액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

액틴 단량체는 머리에서 꼬리 방향으로 중합되어 마이크로필라멘트라고 하는 얇은 섬유를 형성합니다. 유사하게, 튜불린 이량체는 더 긴 속이 빈 원통형 미세소관으로 중합됩니다. 이러한 세포골격 성분은 세포 모양을 유지하고 세포 운동성을 촉진합니다.

전반사 현미경(TIRF)으로 액틴-미세소관 결합 역학을 시각화하려면 맞춤형 이미징 어셈블리를 사용합니다.

이미징 어셈블리는 상단 m-PEG 실란 코팅 커버슬립과 하단 비오틴-PEG 실란 코팅 커버슬립의 두 개의 커버슬립으로 구성됩니다. 두 개의 커버슬립은 양면 접착 테이프로 세로로 간격을 두고 양쪽 끝을 밀봉하여 흐름 채널을 만듭니다.

BSA를 흐름 채널에 피펫팅하여 챔버를 프라이밍합니다. 스트렙타비딘 용액을 첨가하고 배양합니다. 스트렙타비딘 분자는 하단 커버슬립의 PEG-실란에 부착된 비오틴 분자에 결합합니다.

TIRF 버퍼를 채널로 흐르게 합니다. 표지되지 않은 비형광단 표지 및 녹색 형광단 표지 튜불린 이량체와 표지되지 않은 비오틴 표지 및 보라색 형광단 태그가 지정된 액틴 단량체를 포함하는 세포골격 혼합 용액을 추가합니다.

다음으로, ATP(액틴 중합 촉진제) 및 GTP(튜불린 중합 촉진제) 및 액틴-미세소관 커플링 단백질을 함유한 반응 용액을 첨가합니다. 인큐베이트.

튜불린 이량체는 GTP 분자에 결합하여 중합하는 반면, 액틴 단량체는 ATP 분자와 결합하여 중합되어 각각 미세소관과 미세필라멘트를 형성합니다.

이미징 어셈블리를 TIRF 현미경 아래에 놓습니다. 적절한 파장의 레이저로 형광단을 여기시킵니다.

여기광은 내부에서 반사되어 굴절률이 다른 두 매체가 있는 유리-물 계면 근처의 제한된 영역에서 형광단을 선택적으로 비추는 광장을 생성합니다. 이 영역에서 미세필라멘트는 보라색으로 나타나고 미세소관은 녹색으로 나타납니다.

면 양면 테이프 12개를 24mm 길이로 자릅니다. 테이프 뒷면의 한쪽을 제거하고 깨끗한 이미징 챔버에 있는 6개의 홈에 인접한 테이프 조각을 고정합니다. 두 번째 테이프 뒷면을 제거하여 각 챔버 홈을 따라 테이프의 끈적끈적한 면을 노출시키고 챔버를 테이프 면이 위로 향하게 하여 깨끗한 표면에 놓습니다.

작은 계량 보트에서 에폭시 수지와 경화제 용액을 일대일로 혼합하고 P1000 팁을 사용하여 각 이미징 챔버 홈 끝에 있는 테이프 스트립 사이에 혼합 에폭시 한 방울을 놓습니다. 그런 다음 챔버 테이프 또는 에폭시 면이 위로 향하도록 깨끗한 표면에 놓습니다.

섭씨 70도 인큐베이터에서 코팅된 커버슬립을 제거하고 커버슬립의 코팅된 표면과 코팅되지 않은 표면을 이중 증류수로 6회 헹구십시오. 여과된 질소 가스로 건조시킨 다음 커버슬립 코팅면이 테이프를 향하도록 이미징 챔버에 부착합니다.

P200 또는 P1000 피펫 팁을 사용하여 테이프-유리 인터페이스에 압력을 가하여 테이프와 커버슬립 사이의 밀봉을 잘 합니다. 조립된 챔버를 실온에서 최소 5-10분 동안 배양하여 사용하기 전에 에폭시가 챔버 벽을 완전히 밀봉할 수 있도록 합니다.

관류 챔버는 조립 후 12-18시간 이내에 만료됩니다. 관류 펌프를 사용하고 50마이크로리터의 1% BSA를 흐르게 하여 관류 챔버에서 컨디셔닝 용액을 순차적으로 교환하여 이미징 챔버를 프라이밍합니다.

Luer-lock 피팅 저장소에서 초과 완충액을 제거합니다. 그런 다음 밀리리터당 0.005밀리그램의 50마이크로리터를 흐르게 하고 실온에서 1-2분 동안 배양합니다. 저장소에서 여분의 완충액을 제거합니다.

50마이크로리터의 1% BSA를 흐르게 하여 비특이적 결합을 차단하고 10-30초 동안 배양합니다. 저장소에서 여분의 완충액을 제거합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 따뜻한 1x TIRF 완충액을 흐른 다음 50마이크로리터의 안정화 및 50% 비오티닐화 미세소관 종자를 1x TIRF 완충액에 희석합니다.

첫 번째 생화학 반응을 이미징하기 전에 30분 동안 섭씨 35도에서 37도의 온도를 유지하도록 스테이지 또는 대물렌즈 히터 장치를 설정합니다. 그런 다음 획득 간격을 15분에서 20분 동안 5초마다 설정합니다. 다음으로, 액틴 필라멘트 조립을 시작하기 위해 먼저 중합 반응을 조정하여 5% 내지 10% 전력에서 488 및 647-레이저 노출을 50 내지 100밀리초로 설정합니다.

647나노미터에서 이미지를 획득하고 적절하게 조정합니다. 그런 다음 두 번째 조건화된 관류 웰에서 중합 반응을 조정하여 미세소관 조립을 시작합니다. 488나노미터에서 시각화하고 적절하게 조정합니다.

사용 전 15분 이내에 3마이크로리터의 10마이크로몰 488-튜불린과 100마이크로몰 형광 표지되지 않은 튜불린의 7.2마이크로리터 분취량을 혼합합니다. 그런 다음 희석된 비오티닐화 액틴 3마이크로리터를 적절한 부피의 형광 표지 및 표지 액틴에 결합하여 최종 혼합물이 10% 내지 30% 형광 표지와 함께 12.5마이크로몰 총 액틴이 되도록 합니다.

이미징 15분 이내에 2마이크로리터의 12.5마이크로몰 액틴 혼합 스톡을 튜불린 스톡 믹스와 결합하여 세포골격 혼합물을 준비합니다. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.

2x TIRF 완충액, 표백제 방지제, 뉴클레오티드, 완충액 및 보조 단백질을 포함한 다른 모든 실험 성분과 단백질을 결합하여 단백질 반응 혼합물을 준비합니다. 세포골격 혼합물을 단백질 반응 혼합물에 별도로 섭씨 37도에서 30 내지 60초 동안 배양합니다.

반응을 시작하려면 단백질 반응 혼합물의 내용물을 세포골격 혼합물에 첨가하고 혼합합니다. 15마이크로몰 유리 튜불린, 1밀리몰 GTP, 0.5마이크로몰 액틴 단량체 및 적절한 부피의 완충액 대조군이 보충된 1x TIRF 완충액을 포함하는 반응 혼합물 50마이크로리터를 관류 챔버로 흐르게 합니다.

현미경 소프트웨어를 사용하여 15-20분 동안 5초마다 촬영하는 타임랩스 동영상을 녹화합니다. 새로운 관류를 잘 컨디셔닝하고 완충액 부피를 관심 조절 단백질 및 완충액 대조군으로 교체합니다. 새로운 액틴 미세소관 기능에 대한 조절 단백질을 평가하기 위해 획득합니다.