액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

액틴 단량체는 머리에서 꼬리 방향으로 중합되어 마이크로필라멘트라고 하는 얇은 섬유를 형성합니다. 유사하게, 튜불린 이량체는 더 긴 속이 빈 원통형 미세소관으로 중합됩니다. 이러한 세포골격 성분은 세포 모양을 유지하고 세포 운동성을 촉진합니다.

전반사 현미경(TIRF)으로 액틴-미세소관 결합 역학을 시각화하려면 맞춤형 이미징 어셈블리를 사용합니다.

이미징 어셈블리는 상단 m-PEG 실란 코팅 커버슬립과 하단 비오틴-PEG 실란 코팅 커버슬립의 두 개의 커버슬립으로 구성됩니다. 두 개의 커버슬립은 양면 접착 테이프로 세로로 간격을 두고 양쪽 끝을 밀봉하여 흐름 채널을 만듭니다.

BSA를 흐름 채널에 피펫팅하여 챔버를 프라이밍합니다. 스트렙타비딘 용액을 첨가하고 배양합니다. 스트렙타비딘 분자는 하단 커버슬립의 PEG-실란에 부착된 비오틴 분자에 결합합니다.

TIRF 버퍼를 채널로 흐르게 합니다. 표지되지 않은 비형광단 표지 및 녹색 형광단 표지 튜불린 이량체와 표지되지 않은 비오틴 표지 및 보라색 형광단 태그가 지정된 액틴 단량체를 포함하는 세포골격 혼합 용액을 추가합니다.

다음으로, ATP(액틴 중합 촉진제) 및 GTP(튜불린 중합 촉진제) 및 액틴-미세소관 커플링 단백질을 함유한 반응 용액을 첨가합니다. 인큐베이트.

튜불린 이량체는 GTP 분자에 결합하여 중합하는 반면, 액틴 단량체는 ATP 분자와 결합하여 중합되어 각각 미세소관과 미세필라멘트를 형성합니다.

이미징 어셈블리를 TIRF 현미경 아래에 놓습니다. 적절한 파장의 레이저로 형광단을 여기시킵니다.

여기광은 내부에서 반사되어 굴절률이 다른 두 매체가 있는 유리-물 계면 근처의 제한된 영역에서 형광단을 선택적으로 비추는 광장을 생성합니다. 이 영역에서 미세필라멘트는 보라색으로 나타나고 미세소관은 녹색으로 나타납니다.

양

면 양면 테이프 12개를 24mm 길이로 자릅니다. 테이프 뒷면의 한쪽을 제거하고 깨끗한 이미징 챔버에 있는 6개의 홈에 인접한 테이프 조각을 고정합니다. 두 번째 테이프 뒷면을 제거하여 각 챔버 홈을 따라 테이프의 끈적끈적한 면을 노출시키고 챔버를 테이프 면이 위로 향하게 하여 깨끗한 표면에 놓습니다.

작은 계량 보트에서 에폭시 수지와 경화제 용액을 일대일로 혼합하고 P1000 팁을 사용하여 각 이미징 챔버 홈 끝에 있는 테이프 스트립 사이에 혼합 에폭시 한 방울을 놓습니다. 그런 다음 챔버 테이프 또는 에폭시 면이 위로 향하도록 깨끗한 표면