미세혈관 혈전 형성을 연구하기 위한 Intravital Fluorescence Microscopy

생체 내 형광 현미경은 미세혈관 손상 부위에서 혈전(혈전) 형성의 광독성 유도를 연구하는 데 유용합니다.

광독성 형광단 표지 다당류를 주사한 마취된 털이 없는 마우스를 복용하는 것으로 시작합니다. 적절한 혈액 순환을 위해 생리학적 온도를 유지하기 위해 가열 플랫폼에 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다.

귀의 정점 부분을 생체 내 형광 현미경 아래에 놓습니다. 빛으로 여기되면 형광단이 형광을 방출하여 미세혈관 혈류를 모니터링할 수 있습니다. 혈전 형성을 유도하기 위해 빛의 강도를 높입니다.

형광단은 고강도 빛을 흡수하고 분자 산소와 반응하여 활성 산소종을 생성합니다. 이 분자는 내피 세포에 산화 스트레스를 일으켜 세포 손상과 내피하 기질의 노출을 유발합니다.

손상된 세포는 내피하 기질에서 노출된 콜라겐과 특정 수용체를 통해 매개체에 결합하는 순환 혈소판을 연결하는 혈전성 매개체를 방출합니다.

결합은 혈소판을 활성화하여 다른 순환 혈소판을 활성화하고 손상 부위로 모집하는 이펙터 분자의 방출을 유발합니다. 순환하는 피브리노겐 단백질은 활성화된 혈소판의 피브리노겐 수용체에 결합하여 혈소판 플러그를 형성합니다.

제한된 혈류를 시각화하여 혈전 형성의 기본 단계인 혈소판 플러그를 확인합니다.

동물을 입체 현미경 아래 플랫폼에 놓습니다. 10X 배율을 사용합니다. 오른쪽 귀의 현미경 검사의 경우 먼저 목 피부에 두개꼬리 방향으로 5mm 절개를 하여 왼쪽 경정맥을 준비합니다. 그런 다음 마이크로 겸자와 마이크로 가위를 사용하여 피하 조직을 해부합니다. 그런 다음 혈관을 건드리지 않고 외막에서 정맥을 풀어줍니다.

이제 형광 염료 주입을 위해 미리 준비된 인슐린 주사기를 사용하십시오. 정맥에 구멍을 뚫지 않고 마이크로 겸자로 혈관 벽을 조심스럽게 잡습니다. 주사기 바늘로 팽창한 혈관벽을 관통하고 FITC-덱스트란을 정맥 주사합니다. 바늘을 빼고 면봉으로 출혈을 멈춥니다. 귀의 혈액 및 염료 오염을 피하십시오.

가열판에 있는 동물을 가열판용 슬롯과 귀 위치를 지정하기 위한 0.5cm 높이의 평면이 있는 말단 유리 구조로 옮깁니다. 접착 붕대를 사용하여 가열판에 동물을 엎드린 자세로 고정합니다. 귀의 정점 부분이 평면에 평평하게 위치할 수 있도록 귀 밑부분에 볼록한 연골을 귀 평면 옆에 놓습니다. 실온의 아쿠아 한 방울을 말단 유리판에 넣습니다. 면봉을 사용하여 아쿠아의 방울을 흡수하고 모세관의 힘이 이어플레인을 말단 유리에 부착하도록 합니다.

연골이 귓바퀴를 볼록한 모양으로 만들더라도 귓바퀴는 가능한 한 평평하게 위치해야 합니다. 따라서 이바퀴의 더 유연한 원위 부분만 말단 유리판에 위치해야 합니다. 조직 손상 및 냉동 염료의 유출을 방지하려면 집게로 귀를 최대한 적게 만지십시오.

다음으로 귀의 볼록한 등쪽에 아쿠아 한 방울을 추가합니다. 귀로 들어가는 기저 혈관을 압박하지 않고 커버슬립 하나를 조심스럽게 귀에 놓습니다. 면봉을 사용하여 커버슬립 아래에서 가능한 한 많은 아쿠아를 제거하여 커버슬립과 귀 대상 혈관 사이의 거리를 최소화합니다.

FITC-덱스트란 시각화를 위해 생체 내 형광 현미경을 조정하는 것부터 시작합니다. 준비된 동물을 생체 내 형광 현미경의 책상으로 옮깁니다. 5X, 10X 및 20X 배율과 20% 광도를 사용하여 직경이 50-60미크론이고 혈류가 전

63X 배율 대물렌즈의 물 침수를 위해 커버슬립에 실온의 물 한 방울을 추가합니다. 물방울을 적용한 직후 직경과 혈류의 기본 평가를 위해 20초 동안 혈관 기록을 시작합니다. FITC-덱스트란 주사 후 5분 후에 혈전 유도를 시작합니다. 이를 위해 광도를 100%로 높입니다.

광독성 혈전 유도 시 30초 동안 현미경의 조리개를 2초 동안 닫아 혈류의 폐색을 확인합니다. 혈류가 지속되면 구멍을 다시 엽니다. 혈관은 흐름이 30초 이상 정지되어 있거나 혈류가 역행하는 경우 폐색된 것으로 분류됩니다. FITC-덱스트란 주사 후 1시간 이내에 귀당 5개의 혈관을 선택하고 폐색합니다.