인간 상피 장 모델에서 괴사성 장염의 유도

인간 소장 조직 유래 선와(줄기 세포와 다양한 유형의 상피 세포를 포함하는 세뇨관 함입)를 얻습니다.

장 지하실을 차가운 지하실 매트릭스에 추가합니다.

이 혼합물을 멀티웰 플레이트로 옮겨 3차원 돔을 만듭니다.

성장 배지를 추가하고 배양합니다.

줄기세포는 자기 조직화, 증식 및 여러 유형의 장 세포로 분화하여 장권을 형성합니다.

시간이 지남에 따라 장권은 장 선와와 유사한 3차원 자가 재생 구조인 장구로 성숙합니다.

박테리아 내독소인 지질다당류 또는 LPS를 엔테로이드 함유 웰에 넣고 배양합니다.

LPS 분자는 엔테로이드의 톨 유사 수용체에 결합하여 전염증 반응을 시작하여 활성 산소종을 축적합니다. 이것은 세포사멸로 이어지는 일련의 사건을 유발합니다.

결과적으로 엔테로이드의 무결성이 손상되어 LPS가 내강으로 침투하여 염증 반응이 더욱 강화됩니다.

이것은 미숙아의 장에 심각한 염증이 생기는 괴사성 소장결장염의 발병을 모방합니다.

수술실에서 수집할 때 인간 소장 조직 샘플을 차가운 DPBS에 넣습니다. 혈액과 대변이 없어질 때까지 차가운 DPBS에서 검체를 세척하십시오.

검체를 섭씨 4도의 RPMI 1640 배지에 보관합니다. 계속할 준비가 되면 검체에 대변과 혈액이 없는지 다시 확인하십시오. 섬세한 해부 가위를 사용하여 과도한 지방이나 수술용 클립 및 스테이플을 제거합니다. 표본의 무게를 측정하고 약 0.75-2.5g의 조각을 목표로 합니다.

그런 다음 조직을 0.5cm 조각으로 자르고 30밀리리터의 킬레이트 완충액 #1이 들어 있는 튜브에 넣습니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 저속으로 흔듭니다. 그런 다음 100마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 조직을 여과하고 흐름을 버립니다.

여과된 조직을 30밀리리터의 킬레이트 완충액 #2가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 저속으로 흔듭니다. 100마이크로미터 필터를 통해 조직을 걸러내고 흐름을 버립니다.

그런 다음 나중에 사용할 수 있도록 얼음 위에 500마이크로리터의 기저막 매트릭스를 해동합니다. 50밀리리터 원뿔형 튜브에 담긴 차가운 DMEM 10밀리리터에 티슈를 넣고 손으로 10초 동안 세게 흔듭니다. 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 이 현탁액을 여과하고 흐름을 수집합니다. 이 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

별도의 50밀리리터 원뿔형 튜브에 있는 다른 10밀리리터의 차가운 DMEM에 티슈를 넣고 손으로 10초 동안 세게 흔듭니다.