Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 조직 절편의 아밀로이드 구조 분석

비정상적인 단백질 침전물을 나타내는 아밀로이드 응집체가 있는 조직 절편을 채취합니다.

조직은 아밀로이드 원섬유의 베타 시트 구조에 특이적으로 결합하는 형광 염료 heptamer-formyl thiophene acetic acid 또는 hFTAA로 염색됩니다.

염료 분자의 형광 수명을 측정하는 형광 수명 이미징 현미경 장치가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지

염료 분자의 효과적인 여기를 위해 현미경 설정을 최적화합니다.

레이저 광이 조직을 비추면 hFTAA가 여기되고 형광을 발합니다.

조밀한 구조에서 염료 결합이 강하면 수명이 길어지고, 덜 컴팩트한 구조에서 염료 결합이 약하면 수명이 짧

나중에 소프트웨어는 집계체의 색상으로 구분된 이미지를 생성합니다.

빨간색 및 노란색과 같은 색상이 주변에 나타나 덜 조밀하고 불안정한 아밀로이드 구조를 반영하는 형광 수명이 더 짧음을 나타냅니다.

코어의 파란색 및 녹색과 같은 색상은 더 긴 형광 수명을 나타내며 더 작고 안정적인 아밀로이드 구조를 반영합니다.

염색 당일, 절편을 99% 에탄올, 70% 에탄올, dH_2O 및 PBS의 연속 수조에 매번 10분 동안 담근 다음 조직 절편을 주변 조건에서 건조시킵니다. 조직이 건조되는 동안 PBS에서 스톡 1 내지 10,000으로 희석하여 HFTAA의 작업 용액을 준비합니다. 조직이 건조되면 HFTAA 작업 용액의 방울을 각 조직 섹션에 추가하여 덮습니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.

500마이크로리터의 PBS로 염색 용액을 헹구고 슬라이드를 PBS 수조에 10분 동안 담급니다. 주변 조건에서 섹션을 건조시킨 후 형광 마운팅 매체를 사용하여 마운트합니다. 마운팅 매체가 밤새 가라앉도록 합니다.

아밀로이드 검출은 장착 직후 또는 장착 없이 수행할 수 있습니다. 그러나 실험의 목표가 고품질 스펙트럼 정보를 수집하는 것이라면 하룻밤 배양이 선호됩니다.

현미경을 FLIM 모드로 전환하고 핀홀을 20으로, 여기 파장을 490나노미터로, 레이저 강도를 0.5%로 설정합니다. 40메가헤르츠의 펄스 레이저를 사용합니다. FLIM 소프트웨어에서 550나노미터 이상의 광자 계수를 설정합니다. 디스플레이 매개변수 창에서 최대 개수가 약 4,000개의 광자 수가 될 때까지 광자 수를 따릅니다. 파일을 저장하고 SPC 이미지로 내보냅니다.