PDMS 장치 제작 및 표면 변경

제 이름은 켄 코츠입니다. 저는 매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)과 연계된 Bio MAs Resource Center에서 박사후 연구원으로 일하고 있습니다. 저의 주요 연구 프로젝트는 미세유체 구조를 가진 면역 친화성 포획 장치를 사용하여 호중구를 분리하는 것입니다.

우리는 전국 5개 병원에서 이 장치를 사용하여 다운스트림 게놈 분석을 위해 RNA를 분리합니다. 기본적으로 당신이 가지고 있는 것은 실리콘 위에 SU 8 포토 레지스트의 마스터입니다. 이 마스터 위에 두 부분으로 구성된 엘라스토머 A-P-D-M-S를 붓고 PDMS가 금형을 형성합니다.

케이스에서 마스터 몰드를 제거하고 페트리 접시에 넣습니다. 마스터는 페트리 접시 바닥에 테이프로 고정됩니다. 저울에서 우리는 PDMS, 경화제 및 기본 수지의 혼합물을 측정합니다.

비율은 경화제 1 부분 대 수지 10 부분입니다. 일반적으로 절단된 장치의 경우 수지 20-30g과 경화제 2-3g의 무게를 각각 잰다. 경화제와 수지를 모두 작은 유청 보트에 부은 후 표준 플라스틱 포크를 사용하여 두 가지를 함께 혼합합니다.

경화제가 수지 내에 고르게 분포되도록 강력하게 혼합하고 혼합물을 서로 겹쳐서 접어야 합니다. 일반적으로 우리는 두 가지가 얼마나 잘 혼합되었는지 모니터링합니다. 기포의 수를 살펴봄으로써, 우리는 엘라스토머 전체에 작은 기포가 고르게 분포되도록 노력합니다.

그런 다음 페트리 접시에 있는 SU 8 마스터 위에 PDMS를 붓습니다. PDMS가 있는 마스터를 진공 벨 용기에 넣고 챔버를 비워 혼합된 공기를 제거합니다. 일반적으로 탈기 과정은 30분에서 1시간 정도 걸립니다.

가스 제거 후, 진공 챔버에서 장치를 제거하고 65-80 °C의 오븐에 넣습니다.이 온도에서 최소 경화 시간은 3-6 시간입니다. 우리 실험실에서는 일반적으로 장치를 밤새 오븐에 둡니다.

일반적으로 우리는 숫자 11 수술용 강철 칼을 사용합니다. 우리는 실리콘 마스터의 가장자리에서 약 50cm 떨어진 곳을 직선으로 자르고 마스터의 가장자리 주위를 잘라 큰 디스크를 만듭니다. 마스터에서 PDMS 금형을 벗겨내고 깨끗한 페트리 접시에 피처 면이 위로 향하게 놓습니다.

우리는 페트리 접시에서 해방된 곰팡이를 꺼내 칼 또는 선형 레일에 장착된 칼을 사용하여 절단 표면에 놓습니다. 우리는 금형에 들어있는 장치를 절단합니다. 그런 다음 각 섹션 장치는 추가 처리를 위해 페트리 접시에 다시 배치됩니다.

일반적으로 장치를 유체와 인터페이스하기 위해 PDMS 장치에 구멍을 뚫습니다. 구멍을 뚫는 데 사용하는 장치는 표준 3밀 주사기입니다. 3 밀 주사기의 끝에는 뭉툭한 끝 스테인레스 스틸 바늘이 있습니다.

스테인레스 스틸 바늘 안에는 바늘의 내경에 맞는 와이어가 있습니다. 이 와이어는 주사기의 플런저에 부착되어 있습니다.플런저를 뒤로 당기고 바늘을 집어넣으면 PDMS에 구멍을 뚫거나 플러그를 뚫을 수 있습니다. PDMS 장치를 뒤집고 플런저를 눌러 꺼냅니다.

펀칭 장치의 비밀은 플런저를 가능한 한 수직으로 유지하고 펀칭 장치를 전혀 회전시키지 않는 것입니다. PDMS를 펀칭할 때 핀셋으로 전체 장치, 전체 PDMS 장치를 들어 올리고 뒤집은 다음 플런저를 눌러 플러그를 꺼냅니다. 핀셋으로 플러그를 잡고 처분합니다.

그런 다음 플런저를 다시 집어넣고 장치를 다시 아래로 뒤집은 다음 절단 장치를 당겨 빼냅니다. 모든 구멍이 뚫릴 때까지 이것을 반복합니다. 따라서 접착 공정의 경우 PDMS 장치를 유리 슬라이드에 접착합니다.

우리 장치의 경우 PDMS를 유리 슬라이드에 비가역적으로 결합하거나 공유 결합할 것입니다. 이를 수행하는 방법은 플라즈마에 배치하고 플라즈마 Asher에 배치하고 활성 산소 플라즈마에 노출시키는 것입니다. 따라서 이 작업을 수행하는 단계는 PDMS 장치를 플라즈마 Asher의 트레이에 놓

장치 기능이 위쪽을 향하게 하면 모든 표준 유리 현미경 슬라이드를 사용할 수 있습니다. 우리는 장치에 맞게 약간 확대된 1.5인치 현미경 슬라이드를 사용합니다. 패키지에서 꺼내자마자 바로 사용할 수 있습니다.

우리는 피라냐 용액으로 처리하는 것을 선호합니다. 이렇게 하면 유리 슬라이드 표면에 있을 수 있는 유기 오염 물질을 제거할 수 있습니다. 플라즈마 Asher용 트레이 위에 장치와 유리 슬라이드를 놓은 후 트레이를 플라즈마 Asher에 밀어 넣고 활성 산소 플라즈마에 노출시킵니다.

플라즈마 Asher의 프로그램이 완료되면 챔버를 열고 장치와 함께 플레이트를 벤치 탑으로 제거합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 장치를 조심스럽게 들어 올리고 손가락으로 접착 표면을 만지지 않도록 주의합니다. 접착 면을 유리 위, 유리 슬라이드 위로 뒤집은 다음 PDMS와 유리 슬라이드 사이에 기포가 없는지 확인합니다.

우리는 더 나은 화학 결합을 달성하기 위해 더 나은 화학 결합을 달성하기 위해 65-75°C에서 10분 동안 핫 플레이트에 유리에 접착된 PDMS 장치를 놓습니다. 그래서 이 부분에서, 이 섹션에서는 클린룸에서 접착한 후 유리의 PDMS 표면을 화학적으로 변형할 예정이며, 표면에 반응성 OL 그룹이 있는 표면 A PMS 표면이 남게 됩니다. 우리는 이 반응성 표면이 친수성이고 결국 PMS의 대부분으로 확산되어야 합니다.

따라서 표면 화학은 플라즈마 처리 직후에 가장 잘 수행되며, 우리는 me capto의 5% 용액을 사용할 것입니다. 그것은 쓰리 미 캡토, 프로필, 트리메스 옥시입니다. 부피 기준으로 5%의 용액이며, 기본적으로 우리가 하는 일은 흡입구에 주입하고 기포 없이 장치를 완전히 채우

기포가 있으면 핀셋으로 밀어냅니다. 이것은 일단 슬랜을 주입하고 나면 15-30분 동안 그대로 둡니다. 실온에서 일반적으로 반응 10분 후에 두 번째 볼륨의 슬란을 주입합니다.

그래서 실린이 약 30분 동안 반응한 후, 우리는 3-4개의 장치 부피의 순수 에탄올로 모든 장치를 세척할 것입니다. 우리가 배출하는 초과분은 화학 물티슈로 닦아냅니다.장치를 헹군 후 장치를 집어 섭씨 100도로 설정된 핫 플레이트에 놓고 기본적으로 거기에 있는 에탄올이 증발하도록 합니다. 이것은 실링 표면을 무릎 꿇는 데 도움이 됩니다.

장치가 건조되면 몇 달 동안 건조된 상태로 보관하거나 장치를 가져와서 즉시 다음 단계로 진행할 수 있습니다. 장치가 경화된 후 유리와 PDMS 표면 모두에 사인 코팅이 되어 경화되었습니다. 사인은 티올기(thiol group)와 캡토 사인(capto sine)이며, 이는 GMBS인 이종 작용기 교차결합제(hetero bifunctional crosslinker)와 반응합니다.

순수 에탄올에 희석되어 있습니다. 물에 반응하기 때문에 수성 조건에 노출되지 않도록 주의해야 합니다. 우리는 그것을 장치에 주입하고 모든 표면이 이 분자와 결합되어 있는지 확인하기 위해 여기에서 하는 것처럼 핀셋으로 기포를 제거합니다.

우리는 그것을 덮고 30 분 동안 반응하게합니다. GMBS가 30분 동안 반응한 후 장치에 있는 미량의 에탄올을 제거하기 위해 탈이온수로 장치를 세척할 것입니다. 그런 다음 비오틴 결합 단백질인 뉴 트라빈(neu travain)을 통해 흐를 것입니다.

그런 다음 neu travain을 mil당 10마이크로그램의 농도로 미리 희석합니다. 실수로 장치에 공기가 주입된 경우 젖은 모든 공기를 효과적으로 제거하기 위해 장치를 에탄올로 다시 세척해야 하는 경우 장치 표면이 더 좋아지고 실수로 장치에 유입된 기포를 제거할 수 있습니다. 그리고 일단 장치가 이온수로 세척되면, 우리는 일반적으로 희석된 중성 증거 T travain 용액의 2-4개 장치 부피로 장치를 채웁니다.

너트 트라빈은 GMBS와 반응하며, GMBS는 너트 트라빈의 주요 수단을 통해 표면에 고정됩니다. 이 과정은 실온에서 1시간 동안 발생할 수 있습니다. 일반적으로 저는 장치를 섭씨 4도의 냉장실에 밤새 놓습니다.

그러나 항체를 추가하기 전에 용액에 결합되지 않은 모든 Aden을 씻어내고 싶습니다. 그리고 우리는 PBS에 희석된 1% 용액 BSA를 통해 이를 수행합니다. 이 칩은 다운스트림 게놈 분석에 사용될 예정이기 때문에 우리가 사용하는 모든 솔루션은 RNA가 없습니다.

일반적으로 우리가 하는 일은 4-5개의 1%BSA 용액으로 장치를 세척하는 것입니다. 그런 다음 항체를 추가합니다. 이 실험의 항체는 CD 66 B와 전혈의 과립구에 특이적인 항체입니다.

우리는 밀당 10에서 25마이크로그램 사이의 농도를 사용하여 항체를 주입합니다. 각 장치에 200마이크로리터의 항체를 주입합니다. 우리는 100 마이크로 리터를 장치의 각 포트에 하나씩 두 번 주입 할 것입니다.

일반적으로 한 포트에 100마이크로리터를 주입하고 30분 동안 기다렸다가 반대쪽 포트에 100마이크로리터를 추가로 주입합니다.