Name: 분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 학습하세요 인간 교모세포종 다형성(GBM) 종양 조직에서 신경구 배양법을 이용한 줄기유사 세포 분리 및 확장 방법. 이 기법은 종양 생물학 연구와 치료 표적 개발에 활용됩니다.

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뇌종양 치료에 대한 프레스톤 A. 웰스 주니어 센터,이 작품은 뇌 종양 연구 플로리다 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.

1. 기본 GBM 조직의 수집 <ol><li> glioblastoma mutliforme (GBM) 종양은 암 진단과 수술을받은 환자로부터 얻은 것입니다. </li><li> 준비는 신경 외과 팀하셔야합니다. 신경 외과는 신경 줄기 세포 (NSC) 10-15%의 항생제 (Peniciline / Streptomycine)와 보충 기저 매체를 포함하는 적절한 크기의 튜브에 resected의 GBM 종양 추가됩니다. 차가운 매체 실험실로 수술실에 제공해야합니다. 또는 감기에 HEPES - 버퍼 최소 필수 배지 (앙) 또는 인산염은 항생제의 높은 농도와 염분 (PBS)는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다 버퍼. </li><li> resected 종양 조직은 얼음에있는 실험실로 전달, 그리고 후드를 배치됩니다. </li></ol> 2. 단일 셀 서스펜션에 차 종양의 분해 <ol><li> 원래 중간 / PBS를 초과은 팔콘 튜브에서 제거되고 샘플 5-10m로 2-3 번 씻어입니다PBS / NSC 기저 매체의 전 혈액과 이물질을 제거합니다. PBS / 매체가 제거되고 GBM 종양 조직은 배양 접시에 배치됩니다. </li><li> 조직은 작은 조각으로 잘라 trypsinization 프로세스의 면적을 증가 작은 조각에 번호 10 메스 블레이드와 다진 있습니다. 닦지는 종양의 크기에 따라 1~3분 소요될 수 있습니다. </li><li> 다진 조직은 사전 예열 % 0.05 37 ° C의 물을 욕조에 10-15분에 대한 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 - 5ml에 trypsinized 있습니다. 전자 피펫은 15ml 팔콘 튜브에 작은 종양의 조각과 트립신를 전송하는 데 사용됩니다. </li><li> 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨은 잠복기 후 효소 트립신의 반응을 중지에 추가됩니다. </li><li> 트립신의는 불활 성화를 여러 번 다운 서스펜션을 pipetting과에 의해 보장됩니다. 그런 다음 중지를위한 5 분 800rpm (110g)에 centrifuging에 의해 아래 pelleted 있습니다. </li><li> 뜨는가 삭제되고 조직 조각은 무균 NSC 바의 1ml에 resuspended 아르샐 매체. 대단히 짧은 부드럽게 부드러운 하얀 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 (3-7 회) 위아래 pipetting 및하여 dissociated 수 있습니다. pipetting 단계의 수는 직접 다진 조직의 입자의 크기에 따라 달라집니다. 그것이 세포 죽음과 구체 형성의 감소가 발생 하듯이 장기와 활발한 기계적 분리는 피해야한다. </li><li> 취소 dissociated 조각과 파편을 제거하려면, 기저 매체 10-15 ML은 튜브에 추가되고 세포 현탁액은 50ml 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 필터링됩니다. </li><li> 필터링 정지 5 분에 대한 800rpm (110g)에 centrifuged입니다. 뜨는는 나중에 삭제됩니다. </li><li> Pelletted 전지는 다음 셀 카운트를위한 완벽한 NSC 매체의 1 2ml에 resuspended 있습니다. </li></ol> 3. 셀 카운트 및 도금 <ol><li> 세포 현탁액의 10 μL은 1ml eppendorf 튜브에 0.04 % Trypan 블루 90 μL에 추가됩니다. 참고 : 다른 적절한 세포를 거치도록tions도 사용할 수 있습니다. </li><li> 정지를 섞어 아래 피펫합니다. 세포 / trypan 파랑 혼합 10 μL은 세포 밀도를 계산하기 위해 hemocytometer로 전송됩니다. </li><li> 세포의 0.2 % 헤파린 (2μg/ml)의 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF와 1μl/ml와 보충 완료 NSC 매체 (9시 1분 비율 NSC 기저 매체와 NSC 확산 보완의 혼합물)에 도금 아르 적절한 조직 문화 선박. 중간의 5, 20, 40 ML는 각각, T25, T80과 T175 flasks에 사용됩니다. 항생제는 오염의 기회를 감소 1:100의 농도에서 매체에 추가할 수 있습니다. </li><li> 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2 배양기 세트에 배치됩니다. </li></ol> 4. Passaging와 GBM 파생 분야의 확장 : <ol><li> neurospheres 직경 150-200 μm의의 평균 크기에 도달하면 문화 subculture 준비가되었습니다. 각 플라스크의 내용은 적절한 크기의 살균 tiss에서 제거 및 위치UE 문화 튜브, 그리고 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged. </li><li> 뜨는이 제거되고 펠렛은 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> 최적의 trypsinization을 달성하기 위해, 세포 현탁액은 37 ° C 2-3 분 물 목욕에 incubated입니다. 트립신 활동을 중지하려면 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨 세포 현탁액에 추가되고 세포 현탁액은 부드럽게 위아래로 pipetted하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액은 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 NSC 매체의 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> 앞에서 설명한대로 셀 개수가 수행됩니다. </li><li> 세포는 성장 인자와 같은 이전 부분에 설명된 적절한 크기의 조직 문화 선박의 도금과 보충 완료 NSC 매체에 5x10 4 셀 / ML의 농도에 도금하고 있습니다. </li><li> 습기에 ° C 37 incubated 때 보조 neurospheres는 70~10일에 형성5% CO 2 ified 인큐베이터. </li></ol> 5. 대표 결과 : GBM 종양 조직에서 수확한 단일 세포를 도금 후, 종양 줄기와 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식과 (비디오와 그림 1 참조) 3-4일에 몇 가지 세포로 구성된 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 이러한 클러스터의 성장에 따라, 그들은 150-200 마이크론 양식 (비디오 및 그림 2 참조)의 평균 직경 7~8일하여 수 있도록 좀 더 원형 모양, 적절한 단계 밝은 분야를 취득. 높은 배율에서 건강 분야는 일반적으로 자신의 주변에서 microspikes를 보여줍니다. 문화 개시는 문화의 binging에 비 dissociated 대단히 짧은 시간의 존재로 인해 진정한 분야로 착각해서는 안됩니다 이후 1~2일의 클러스터와 같은 큰 범위를 가졌어요. 기본 종양 영역의 문화에 파편의 양은 조직의 초기 소스에 따라 다릅니다 그리고 그것은 모든 주위의 뇌 조직을 포함할지 여부. 적절한 조직 준비 기법매체의 충분한 양의 효소와 기계적 분리, 그리고 샘플의 후속 필터를 포함하는 것은 문화에 덜 파편이 발생할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 사일 도금 후에 기본 GBM의 구체 문화. 종양 줄기 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 3~4일에서 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 원본 확대, 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 팔일 도금 후 항로 일 GBM의 영역 문화를. 원본 확대, 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
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<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신경 줄기 및 일반 성인과 태아의 뇌 1, 2, 3, 4에서 전구 세포를 분리하고 줄기는 같은 같은 폐 5, 전립선 6, 유방 7 뇌 8, 9로 암 조직에서 세포 neurosphere 분석은 또한 종양되었습니다 자주 선택의 방법으로 사용됩니다. 전직 생체내의 multipotency, 주입시 새로운 종양을 만들 수있는 능력, 그리고 자기 갱신,이 간단하고 재현성 분석을 사용하여 하나는 체세포 줄기 세포와 유사한 특성을 보여주 resected 종양 조직에서 세포의 무기한 번호를 생성할 수 있습니다. 이러한 전지는 휴대 전화의 상호 작용, 그리고 차별화, 마이 그 레이션, 침략과 세포 사망을 포함하여 기본적인 암 세포 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 절연 종양 줄기 세포와 같은 방법은 종양의 형태, 진행 및 재발 또한 공부 결국에는 건강에 대한 인사이트를 제공할 수있는 기본 파생 세포 메커니즘을 해명하는 소중한 도구를 제공합니다옵션을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 (인간) </td><td> 중 </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 05,750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 확산 보조 식품 (인간) </td><td> 중간 보충 </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 05,753 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * 가상 </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> 앙 구성 요소 </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> H4034 </td><td> 앙 구성 요소 </td></tr><tr><td> * 증류수 </td><td> 시약 </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> 시약 </td><td> 호슈 </td><td> 104,159 </td><td></td></tr><tr><td> ** 대두 트립신 억제제 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 / Strep </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 번호 10 메스 블레이드 </td><td> 외과 도구 </td><td> BD </td><td> 371,610 </td><td></td></tr><tr><td> 페트리 접시 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,003 </td><td></td></tr><tr><td> 작은 집게 </td><td> 외과 도구 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> 체 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge 뉴NC 국제 </td><td> 136,196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 인터내셔널 </td><td> 178,905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 2028 - EG </td><td></td></tr><tr><td> B - FGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 3139 - FB </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 성장 인자 </td><td> 시그마 </td><td> H4784 </td><td> PBS의 재구성 </td></tr></tbody></table> * 앙을 1M HEPES의 가상 and160ml의 1x10L 패킷을 혼합하고 증류수를 사용하여 8.75 L로 볼륨을 가지고합니다. 7.4에 대한 최종 PH를 설정D 4 ° C.에서 저장 ** 트립신 억제제 솔루션을 준비하려면 먼저 DNase I 용액 (100 MG DNase이 앙 ​​100 ML에 녹아있는) 10 ML을 만들고 다음 DNase 솔루션에 트립신 억제제의 0.14 g을 추가하고 마지막 앙을 사용하여 1 리터에 볼륨을합니다. -20 ° C의 냉동고에 최종 제품의 aliquots 보관하십시오.

분리 및 neurosphere 분석을 사용하여 인간 glioblastoma의 multiforme 종양 세포의 확장

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

줄기 세포와 같은 그러한 유방, 폐, 결장, 전립선과 두뇌와 같은 종양에 고립되어있다. 이러한 모든 종양에서 중요한 문제는, 특히 glioblastoma의 mutliforme (GBM)에, 종양 형성, 진행 및 재발 그들의 역할을 조사하기 위해 종양 시작 세포 인구 (들)을 식별하고 격리하는 것입니다. 세포 인구를 시작 이해 종양이 종양에 대한 효과적인 치료 방법을 찾는 데 실마리를 제공할 것입니다. 의 단순 성과 재현성으로 인해 neurosphere 분석 (NSA)이 종양 세포의 많은 고립과 전파에 대한 선택의 방법으로 사용되고 있습니다. 이 프로토콜은 수술 resected 인간 GBM 종양 조직에서 줄기 같은 세포를 분리하고 확장 neurosphere 문화 방법을 보여줍니다. 절차는 초기 화학 소화 및 종양 조직의 기계적 분리, 그리고 이후 NSA 문화에서 발생한 단일 세포 현탁액을 도금이 포함됩니다. 150-2의 7~10일 후, 기본 neurospheres직경 00 μm의 준수 더욱 passaging 및 확장을위한 준비가되어 있습니다.

이 비디오 프로토콜은 neurosphere 분석 문화 방법을 사용하여 수술 resected 인간 glioblastoma의 mutliforme (GBM) 종양 조직에서 세포처럼 고립과 줄기의 확장을 보여줍니다.

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

줄기세포 유사 세포가 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암 및 뇌종양과 같은 종양에서 분리되었습니다. 이러한 모든 종양, 특히 ...에서 중요한 문제는

본 프로토콜의 목적은 neurosphere 자산을 사용하여 인간 교모세포종(glioblastoma multiform) 종양 세포를 분리하고 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 채취한 종양 조직을 잘게 다진 후, 기계적 해리를 거쳐, 최종적으로 결과 세포를 neurosphere 배양법으로 성장시키기 위해 플레이팅함으로써 달성됩니다. 본 영상에서는 neurosphere 배양법을 이용해 인간 교모세포종 종양 조직으로부터 줄기세포 유사 세포를 분리하고 증식시키는 방법을 보여드리겠습니다.이 방법은 다른 뇌종양뿐만 아니라 유방암, 전립선암, 간암 및 폐암과 같은 고형암의 세포를 배양하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 수술을 통해 절제된 GBM 종양 조직을 수령한 후, 배지를 제거합니다.혈액 및 파편과 같은 오염 물질을 제거하기 위해 멸균 PBS를 사용하여 종양을 2~3회 세척합니다. 세척 후, 절제된 종양을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 먼저 종양을 작은 조각으로 자른 다음, 종양 조직의 일부를 별도의 페트리 접시로 옮기고 10번 메스를 사용하여 조직을 아주 작은 조각으로 잘게 다집니다.이렇게 하면 효소 해리를 위해 이용 가능한 표면적이 증가합니다. 다지기는 종양의 크기에 따라 1분에서 3분 정도 소요될 수 있습니다. 이제 다져진 조직에 미리 데워둔 trypsin 3~5 ml를 넣고 15 ml 멸균 falcon 튜브로 옮깁니다.15 Ml 튜브를 37 °C 항온수조에 10분에서 15분 동안 둡니다. 5분마다 튜브를 흔들어 줍니다. 조직 소화를 더 확실하게 하기 위해, 동일한 부피의 트립신 억제제를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.피펫팅을 여러 번 반복하여 Trypsin이 활성화되도록 합니다. 현탁액을 800 RRP M 또는 110 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 다음, 팁을 튜브 바닥에 댄 상태에서 1 ml의 신경 줄기세포 기초 배지에 펠렛을 재현탁합니다.덩어리를 제거하여 우윳빛 현탁액이 될 때까지 피펫으로 3~7회 상하로 섞어줍니다. 과도한 피펫팅은 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 50 ml 튜브에 40 micron 필터를 장착합니다. 이제 세포 현탁액에 10~15 ml의 기초 배지를 추가하고 부드럽게 섞은 후, 세포 현탁액을 40 micron 필터에 통과시켜 부유물과 결합된 덩어리를 제거합니다.세포를 원심 분리하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1~2 mL의 완전 배지에 세포를 재현탁합니다. 그 다음, 현탁액을 균질하게 하기 위해 파이펫으로 부드럽게 위아래로 섞어줍니다.10 µL의 세포 현탁액을 90 µL의 Trian blue와 혼합합니다. 현탁액을 충분히 섞은 후 10 µL를 hemo.Cytometer로 옮깁니다. 여기에 표시된 대로 세포 수를 측정합니다.정확한 세포 수를 측정하기 위해서는 응집물이 없는 단일 세포 현탁액이 필요합니다. 트라이판 블루(trypan blue) 양성 세포는 제외하십시오. T 80 플라스크에 세포를 분주하기 위해 수를 측정할 때 적용합니다.50 ml 튜브에 완전 신경줄기세포 배지 20 ml를 넣습니다. ml당 200,000 cells의 밀도가 되도록 적절한 양의 세포 현탁액을 추가합니다. 이제 최종 농도가 20 nanogram per ml가 되도록 EGF를 첨가합니다.0.2% heparin을 ml당 1 µL의 농도로 첨가하십시오. 마지막으로, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 BFGF를 첨가하십시오. 성장 인자가 보충된 완전 배지에서 세포를 혼합하십시오.그 다음 현탁액을 T 80 플라스크로 옮기고 라벨을 부착합니다. 이후 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 7~10일 동안 배양합니다. 배양 8일 후면 스피어(sphere)가 완전히 성장하여 계대 배양할 수 있는 상태가 됩니다.플라스크의 내용물을 수집하여 50 ml 원심분리관으로 옮깁니다. 세포를 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 진공 흡입하여 제거한 후, 펠렛을 미리 데워둔 trypsin 1 ml에 다시 부유시킵니다.세포를 37 °C 워터 배스에서 2분 동안 배양합니다. 동일한 양의 trypsin inhibitor를 첨가하고 충분히 혼합하여 활성화를 유도합니다. 그 후 세포를 펠렛화합니다.상층액을 제거하고 1 ml의 완전 배지에 세포를 재현탁한 후, 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어 세포 현탁액을 균질화합니다. 앞서 설명한 대로 세포 수를 측정하여, 50 ml 튜브에 20 ml의 완전 배지를 넣고 T 80 플라스크에 분주할 준비를 합니다. ml당 50,000 cells의 밀도가 되도록 적절한 양의 세포 현탁액을 첨가합니다.이제 앞서 설명한 농도로 E-G-F, B-F-G-F를 포함한 성장 인자와 헤파린을 첨가합니다. 생성된 세포 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음, 현탁액을 T 80 플라스크로 옮겨 인큐베이터에 7~10일 동안 배양합니다. 다음은 일차 GBM 배양의 예시입니다.이 단계에서 4일이 지나면 세포가 증식하며 구체를 형성하기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 단계에서는 세포의 커다란 구형 클러스터가 관찰되어서는 안 됩니다. 만약 그렇게 보인다면 이는 조직 준비 과정이 부적절했기 때문일 것입니다.7~10일 동안 배양하면 다양한 크기의 구체가 형성되며, 구체의 평균 직경이 150~200 µm에 도달하면 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 이것은 8일 후 GBM 배양물을 계대 배양한 예시입니다. 다시 보시면 다양한 크기의 구체들을 확인할 수 있으며, 건강한 구체는 주변부에 미세한 돌기(micro spikes)를 나타냅니다.단일 세포 현탁액을 준비하는 것은 모든 구체 배양에서 매우 중요한 문제입니다. 그렇지 않으면 세포를 접종한 다음 날에도 세포 응집체가 관찰될 수 있습니다. 이러한 응집체는 구체로 간주될 수 있으나, 관통 세포가 진정한 구체를 형성하는 데에는 최소 일주일이 걸린다는 점에 유의해야 합니다.일차 종양 구체 배양(primary tumor sphere culture) 시 발생하는 잔해물의 양은 조직의 기원, 조직 제거의 정밀도, 그리고 조직 처리 기술과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 이 영상이 유용하게 활용되길 바라며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

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뇌종양 줄기세포(BTSC) 신경구 침입 분석: 신경영역에서 BTSC 침입에 대한 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 체외 분석

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Neurospheres 3D 문화로 성장 glioma 생물학을 공부 하는 강력한 도구를 구성 합니다. 여기 선물이 immunohistochemistry 파라핀 포함 통해 glioma neurospheres의 3 차원 구조를 유지 하면서 수행 하는 프로토콜. 이 메서드는 stemness 등 신경 분화 glioma neurosphere 속성의 특성을 수 있습니다.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

레이저 미세 해부 (LMD)는 신경교종 이질성과 침략을 중재하는 통로를 밝히기 위하여 이용될 수 있는 민감하고 높게 재현가능한 기술입니다. 여기에서, 우리는 전사성 분석에 선행된 레이저 LMD를 사용하여 신경교종 조직에서 이산 지역을 격리하기 위하여 최적화된 프로토콜을 기술합니다.

종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

학습하세요 인간 교모세포종 다형성(GBM) 종양 조직에서 신경구 배양법을 이용한 줄기유사 세포 분리 및 확장 방법. 이 기법은 종양 생물학 연구와 치료 표적 개발에 활용됩니다.

분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

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