분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

본 프로토콜의 목적은 neurosphere 자산을 사용하여 인간 교모세포종(glioblastoma multiform) 종양 세포를 분리하고 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 채취한 종양 조직을 잘게 다진 후, 기계적 해리를 거쳐, 최종적으로 결과 세포를 neurosphere 배양법으로 성장시키기 위해 플레이팅함으로써 달성됩니다. 본 영상에서는 neurosphere 배양법을 이용해 인간 교모세포종 종양 조직으로부터 줄기세포 유사 세포를 분리하고 증식시키는 방법을 보여드리겠습니다.

이 방법은 다른 뇌종양뿐만 아니라 유방암, 전립선암, 간암 및 폐암과 같은 고형암의 세포를 배양하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그럼 시작하겠습니다. 수술을 통해 절제된 GBM 종양 조직을 수령한 후, 배지를 제거합니다.

혈액 및 파편과 같은 오염 물질을 제거하기 위해 멸균 PBS를 사용하여 종양을 2~3회 세척합니다. 세척 후, 절제된 종양을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 먼저 종양을 작은 조각으로 자른 다음, 종양 조직의 일부를 별도의 페트리 접시로 옮기고 10번 메스를 사용하여 조직을 아주 작은 조각으로 잘게 다집니다.

이렇게 하면 효소 해리를 위해 이용 가능한 표면적이 증가합니다. 다지기는 종양의 크기에 따라 1분에서 3분 정도 소요될 수 있습니다. 이제 다져진 조직에 미리 데워둔 trypsin 3~5 ml를 넣고 15 ml 멸균 falcon 튜브로 옮깁니다.

15 Ml 튜브를 37 °C 항온수조에 10분에서 15분 동안 둡니다. 5분마다 튜브를 흔들어 줍니다. 조직 소화를 더 확실하게 하기 위해, 동일한 부피의 트립신 억제제를 첨가하여 반응을 중단시킵니다.

피펫팅을 여러 번 반복하여 Trypsin이 활성화되도록 합니다. 현탁액을 800 RRP M 또는 110 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 다음, 팁을 튜브 바닥에 댄 상태에서 1 ml의 신경 줄기세포 기초 배지에 펠렛을 재현탁합니다.

덩어리를 제거하여 우윳빛 현탁액이 될 때까지 피펫으로 3~7회 상하로 섞어줍니다. 과도한 피펫팅은 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 50 ml 튜브에 40 micron 필터를 장착합니다. 이제 세포 현탁액에 10~15 ml의 기초 배지를 추가하고 부드럽게 섞은 후, 세포 현탁액을 40 micron 필터에 통과시켜 부유물과 결합된 덩어리를 제거합니다.

세포를 원심 분리하고 상층액을 흡입하여 제거합니다. 1~2 mL의 완전 배지에 세포를 재현탁합니다. 그 다음, 현탁액을 균질하게 하기 위해 파이펫으로 부드럽게 위아래로 섞어줍니다.

10 µL의 세포 현탁액을 90 µL의 Trian blue와 혼합합니다. 현탁액을 충분히 섞은 후 10 µL를 hemo.Cytometer로 옮깁니다. 여기에 표시된 대로 세포 수를 측정합니다.

정확한 세포 수를 측정하기 위해서는 응집물이 없는 단일 세포 현탁액이 필요합니다. 트라이판 블루(trypan blue) 양성 세포는 제외하십시오. T 80 플라스크에 세포를 분주하기 위해 수를 측정할 때 적용합니다.

50 ml 튜브에 완전 신경줄기세포 배지 20 ml를 넣습니다. ml당 200,000 cells의 밀도가 되도록 적절한 양의 세포 현탁액을 추가합니다. 이제 최종 농도가 20 nanogram per ml가 되도록 EGF를 첨가합니다.

0.2% heparin을 ml당 1 µL의 농도로 첨가하십시오. 마지막으로, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 BFGF를 첨가하십시오. 성장 인자가 보충된 완전 배지에서 세포를 혼합하십시오.

그 다음 현탁액을 T 80 플라스크로 옮기고 라벨을 부착합니다. 이후 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 7~10일 동안 배양합니다. 배양 8일 후면 스피어(sphere)가 완전히 성장하여 계대 배양할 수 있는 상태가 됩니다.

플라스크의 내용물을 수집하여 50 ml 원심분리관으로 옮깁니다. 세포를 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 진공 흡입하여 제거한 후, 펠렛을 미리 데워둔 trypsin 1 ml에 다시 부유시킵니다.

세포를 37 °C 워터 배스에서 2분 동안 배양합니다. 동일한 양의 trypsin inhibitor를 첨가하고 충분히 혼합하여 활성화를 유도합니다. 그 후 세포를 펠렛화합니다.

상층액을 제거하고 1 ml의 완전 배지에 세포를 재현탁한 후, 피펫팅을 통해 부드럽게 섞어 세포 현탁액을 균질화합니다. 앞서 설명한 대로 세포 수를 측정하여, 50 ml 튜브에 20 ml의 완전 배지를 넣고 T 80 플라스크에 분주할 준비를 합니다. ml당 50,000 cells의 밀도가 되도록 적절한 양의 세포 현탁액을 첨가합니다.

이제 앞서 설명한 농도로 E-G-F, B-F-G-F를 포함한 성장 인자와 헤파린을 첨가합니다. 생성된 세포 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음, 현탁액을 T 80 플라스크로 옮겨 인큐베이터에 7~10일 동안 배양합니다. 다음은 일차 GBM 배양의 예시입니다.

이 단계에서 4일이 지나면 세포가 증식하며 구체를 형성하기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다. 이 단계에서는 세포의 커다란 구형 클러스터가 관찰되어서는 안 됩니다. 만약 그렇게 보인다면 이는 조직 준비 과정이 부적절했기 때문일 것입니다.

7~10일 동안 배양하면 다양한 크기의 구체가 형성되며, 구체의 평균 직경이 150~200 µm에 도달하면 계대 배양할 준비가 된 것입니다. 이것은 8일 후 GBM 배양물을 계대 배양한 예시입니다. 다시 보시면 다양한 크기의 구체들을 확인할 수 있으며, 건강한 구체는 주변부에 미세한 돌기(micro spikes)를 나타냅니다.

단일 세포 현탁액을 준비하는 것은 모든 구체 배양에서 매우 중요한 문제입니다. 그렇지 않으면 세포를 접종한 다음 날에도 세포 응집체가 관찰될 수 있습니다. 이러한 응집체는 구체로 간주될 수 있으나, 관통 세포가 진정한 구체를 형성하는 데에는 최소 일주일이 걸린다는 점에 유의해야 합니다.

일차 종양 구체 배양(primary tumor sphere culture) 시 발생하는 잔해물의 양은 조직의 기원, 조직 제거의 정밀도, 그리고 조직 처리 기술과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 이 영상이 유용하게 활용되길 바라며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 기원합니다.