분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

이 프로토콜의 목표는 neurospheres 자산을 사용하여 인간 교모세포종 다형 종양 세포를 분리하고 확장하는 것입니다. 이는 먼저 수확된 종양 조직을 다진 다음, 기계적 해리를 일으키고, 마지막으로 생성된 세포를 도금하여 신경 구 배양에서 성장함으로써 달성됩니다. 이 비디오에서는 neuros sphere culture 방법을 사용하여 인간 교모세포종 종양 조직에서 줄기와 같은 세포를 분리하고 확장하는 방법을 보여줄 것입니다.

이 방법은 또한 유방, 전립선, 간 및 폐와 같은 고형 종양뿐만 아니라 다른 뇌 종양의 세포를 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 자, 시작하겠습니다. 수술에서 절제된 교모세포종 종양 조직을 받은 후 배지를 제거합니다.

종양은 혈액 및 파편과 같은 오염 물질을 제거하기 위해 멸균 PBS를 사용하여 두세 번 세척합니다. 세척 후 절제된 종양을 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 먼저 종양을 더 작은 부분으로 자른 다음 종양 조직의 일부를 별도의 페트리 접시로 옮기고 숫자 10 메스를 사용하여 조직을 작은 조각으로 다집니다.

이렇게 하면 효소 해리에 사용할 수 있는 표면적이 증가합니다. 다지는 데는 종양의 크기에 따라 1분에서 3분 정도 걸릴 수 있습니다. 이제 3-5ml의 예열 트립신을 다진 조직에 넣고 15ml 멸균 매 튜브에 옮깁니다.

15ml 튜브를 37도 수조에 10-15분 동안 놓습니다. 5분마다 튜브를 흔듭니다. 더 나은 조직 소화를 위해 동일한 양의 트립신 억제제를 첨가하여 반응을 중단하십시오.

활성화 중인 트립신은 여러 번 위아래로 피펫팅하여 보장됩니다. 서스펜션을 800RRP M 또는 110G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 다음 팁을 튜브 바닥에 대고 1ml의 신경 줄기 세포 기저 배지에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

피펫을 3-7회 위아래로 움직여 피펫팅을 통해 유백색 현탁액이 될 때까지 덩어리를 분해하면 세포가 사멸할 수 있습니다. 40ml 튜브에 50미크론 필터를 놓습니다. 이제 10-15ml의 기초 배지를 세포 현탁액에 추가하고 혼합하여 40 미크론 필터를 통해 세포 현탁액을 부드럽게 통과시켜 연결되지 않은 덩어리의 파편을 제거합니다.

PT 세포 그리고 supernat 떨어져 진공 청소기. 1-2ml의 완전한 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 현탁액을 균질화하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.

10마이크로리터의 세포 현탁액을 90마이크로리터의 Trian blue에 혼합합니다. 현탁액을 잘 섞고 10마이크로리터를 헤모로 옮깁니다. 세포분석기. 여기에 표시된 대로 셀 수를 계산합니다.

정확한 세포 수를 갖기 위해 덩어리가 없는 단일 세포 현탁액이 필요합니다. 트리안 블루 양성 세포는 포함하지 마십시오. T 80 플라스크에서 세포를 플레이트팅하기 위해 계수할 때.

50ml 튜브에 완전한 신경 줄기 세포 배지 20ml를 추가합니다. 200의 조밀도를 도달하기 위하여 세포 현탁액의 적합한 양을 추가하십시오, ml 당 000의 세포. 이제 EGF를 추가하여 ml당 20나노그램의 최종 농도에 도달합니다.

ml당 1마이크로리터의 농도로 0.2%헤파린을 첨가합니다. 마지막으로 BFGF를 추가하여 ml당 10나노그램의 최종 농도에 도달합니다. 성장 인자로 보충된 완전한 배지에 세포를 혼합합니다.

그런 다음 서스펜션을 T 80 레이블로 옮기십시오. 그런 다음 플라스크는 7-10일 동안 섭씨 37도, 5%CO2의 인큐베이터로 이동합니다. 8일 동안 배양한 후, 구체는 완전히 자라서 통과할 준비가 됩니다.

플라스크의 내용물을 모아 50ml 2개의 원심분리기로 옮깁니다. 5분 동안 800RPM으로 셀. 슈퍼낫을 진공 청소기로 청소한 다음 예열 트립신 1ml에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

세포를 섭씨 37도의 수조에서 2분 동안 배양합니다. 동일한 양의 트립신 억제제를 첨가하고 완전히 혼합하여 활성화를 보장합니다. 그런 다음 세포를 펠릿으로 만듭니다.

상층(supernat)을 제거하고 세포 현탁액을 균질화하기 위해 1ml의 완전한 중간 피펫에 세포를 위아래로 부드럽게 재현탁합니다. 앞에서 설명한 대로 세포 계수를 수행하여 50ml 튜브에 20ml의 완전한 배지로 T 80 플라스크의 세포를 플레이트합니다. 50의 조밀도를 도달하기 위하여 세포 현탁액의 적당한 양, ml 당 000의 세포를 추가하십시오.

이제 앞에서 설명한 농도의 E-G-F-B-F-G-F 및 헤파린을 포함한 성장 인자를 추가합니다. 생성된 세포 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음 현탁액을 T 80으로 옮기고 7-10일 동안 인큐베이터에 넣습니다. 다음은 기본 교모세포종 배양의 예입니다.

이 단계에서 4일이 지나면 세포가 증식하고 구체를 형성하기 시작하는 것을 볼 수 있습니다. 이 단계에서는 큰 구형 세포 클러스터를 관찰해서는 안 됩니다. 이것은 부적절한 조직 준비로 인해 발생했을 것입니다.

7일에서 10일 동안 배양한 후, 구체의 평균 직경이 150에서 200미크론에 도달하면 다양한 크기의 구체가 형성되어 통과할 준비가 됩니다. 이것은 8일 후 통과 교모세포종 배양의 예입니다. 다시 말하지만, 다양한 크기의 구체, 건강한 구체, 주변에 미세한 스파이크를 나타내는 것을 볼 수 있습니다.

단일 세포 현탁액을 준비하는 것은 모든 구 배양에서 매우 중요한 문제입니다. 그렇지 않으면 세포를 도금한 다음 날에도 세포 응집체를 관찰하게 될 수 있습니다. 이러한 응집체는 구(sphere)로 가정되지만, 세포를 뚫는 것이 진정한 구를 형성하는 데 최소 일주일이 걸린다는 점에 유의해야 합니다.

원발성 종양 구체 배양에서 파편물의 양은 조직의 출처, 조직이 얼마나 정밀하게 제거되었는지, 조직 처리 기술과 같은 많은 요인에 따라 달라집니다. 이 동영상이 유용하기를 바라며 실험에 행운을 빕니다.