사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 DNA 구조체를 박테리아 염색체의 미리 정해진 궤적(locus)에 통합하는 것입니다. 이는 네 가지의 조작된 박테리아 균주를 이용한 교배 프로토콜을 통해 수행됩니다. 수용 균주는 spec mycin 내성 유전자와 ATP 사이트에 의해 측면이 둘러싸인 e coli beta glucuronidase 유전자로 구성된 랜딩 패드 서열이 염색체에 통합되어 있습니다.

P JH one 10 공여 균주는 스터퍼(stuffer) 적색 형광 단백질 유전자를 양옆으로 둘러싼 B 사이트와 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 보유하고 있습니다. PJC two 공여 균주는 LAC 프로모터의 제어 하에 있는 streptomyces phage C 31 유래 부위 특이적 인테그라제(integrase)를 포함하는 플라스미드를 보유하고 있습니다. 네 번째 균주인 MT 616은 접합에 필요한 전달 유전자를 제공하여 수용 균주를 통해 플라스미드가 세포에서 세포로 전달되어 트랜스젠(transgene)이 생성되도록 합니다.

인테그레이스 매개 카세트 교환(integrase mediated cassette exchange)에 필요한 두 가지 플라스미드를 확보합니다. PJ H one 10 플라스미드의 공여 카세트와 염색체 상의 랜딩 패드 카세트 마커를 교환하면, 결과물인 트랜스 이그라미펀트(trans immigrant)에서 랜딩 패드 마커인 SPR 및 UIDA는 소실되고 공여 카세트의 RFP 및 GMR은 유지됩니다. 상동 재조합과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프로토콜의 용이성과 효율성입니다.

이 방법은 또한 다양한 범위의 박테리아로 전이 가능합니다. 본 동영상에서 사용된 수용 균주는 S. milli latte 균주입니다. 트랜스 인테그린(trans integrins)을 생성하기 위한 교배 절차 2일 전에, 단일 콜로니를 spectmycin이 포함된 5 mL의 TY 배지에 접종합니다. S. milli 균주를 30 °C에서 2일 동안 진탕 배양합니다. 교배 절차 전날에, 다음의 각 E. coli 균주를 적절한 항생제가 첨가된 5 mL의 LB 액체 배지에 접종합니다. integrase 발현 플라스미드를 포함하는 DH5α는 tetracycline 배지에, mobilizer인 MT616은 chloramphenicol 배지에, 그리고 donor cassette 플라스미드를 포함하는 DH5α는 Gentamycin 배지에 접종합니다. 교배 절차를 위한 세포 준비를 위해, 세 가지 E. coli 균주를 37 °C에서 지속적으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 네 가지 배양액 각각에서 1.5 mL를 튜브로 옮기고, 17,000 ×g에서 30초 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 배지를 제거하고 각 세포 펠릿을 1 mL의 멸균된 0.85% sodium chloride에 재현탁합니다. 상층액을 제거한 후 튜브를 다시 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 각 펠릿을 100 µL의 멸균된 0.85% sodium chloride에 재현탁합니다. 세척된 각 균주 배양액 10 µL를 일반 TY 한천 배지 플레이트에 개별적으로 스폿(spot)합니다.

이 지점들은 대조군 지점입니다. 다음으로, Pjc 2를 포함하는 e coli DH five alpha를 제외한 각 균주 40 µL를 멸균 튜브에 넣고 피펫팅으로 혼합한 후, 이 혼합물 120 µL를 일반 TY agar 플레이트에 점적합니다. 이 지점은 integrase가 없는 음성 대조군입니다.

마지막으로, 멸균 튜브에 네 가지 균주를 각각 40 µL씩 넣어 혼합한 후, 이 혼합액 160 µL를 동일한 TDY 한천 배지에 스팟팅합니다. 이 스팟은 인테그라제 매개 카세트 교환 접합 스팟입니다.

플레이트를 층류 후드(laminar flow hood)에 넣고 약 20분 동안 스팟을 건조시킵니다. 플레이트를 밀봉하고 교배 프로토콜 스트리킹 다음 날 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 두 개의 대조군 스팟과 IMCE 교배 스팟을 streptomycin과 gentamycin이 첨가된 TY 한천 배지에 도말합니다.

S milli 수용균주(acceptor strain)는 streptomycin에 대해 고수준의 내성을 부여하는 돌연변이를 보유하고 있어 IMCE 효율 계산에 사용됩니다. IMCE 교배 스폿(mating spot)의 약 4분의 1을 500 µL의 멸균 0.85% Sodium chloride에 현탁합니다. 10⁻⁷까지 10배 단계 희석을 수행합니다. 전이 이주자(trans immigrants)를 선별하기 위해 streptomycin, gentamycin 및 xgl이 첨가된 TY agar 플레이트에 10⁻²에서 10⁻⁵까지의 희석액을 도말합니다. 전이 이주자와 잠재적 수용균(potential recipients) 모두를 선별하기 위해 streptomycin과 xgl이 첨가된 TY agar 플레이트에 10⁻³에서 10⁻⁷까지의 희석액을 도말합니다. 전체 수용균(IE total recipients)을 확인합니다. 플레이트를 30 °C에서 3일 동안 배양합니다.

녹색광 아래에서 RFP trans를 관찰하고 적색 필터를 통해 trans 이입자의 CFU를 전체 수신자의 CFU와 비교하여 IMCE 효율 백분율을 계산하십시오. streptomycin과 Gentamycin이 첨가된 Ty 배지에서 3일간 배양한 후, trans의 약 절반은 실제 교환이 일어나 흰색으로 변하고 감수성을 잃게 됩니다. 다음의 대조군 균주에서는 성장이 없어야 합니다: no integrase control s milli latte UW 2 27 control e coli MT 616 control e coli DH five alpha containing P JH one 10 control 및 e coli DH five alpha containing PJC two control. 반면, mating spot의 IMCE 스트리킹에서는 첫 번째 스트리크에 융합 성장이 나타나고 두 번째 스트리크에 많은 콜로니가 형성되어야 합니다. 다음 두 이미지는 TY streptomycin xgl 한천 배지와 TY streptomycin Gentamycin xgl 한천 배지에 mating spot의 10⁻² 희석액을 재현탁하여 도말한 모습이며, 특히 TY streptomycin Gentamycin xgl 한천 배지에서의 결과를 보여줍니다.

파란색 콜로니는 단일 재조합체입니다. 흰색 콜로니는 녹색광과 적색 필터를 통해 관찰했을 때 진정한 카세트 교환이 일어난 trans integrin인 반면, TY strept cin xgl 한천 배지 상의 교배 스팟 재현탁액 10⁻² 희석 지점은 형광이 나타나지 않습니다. 이와 대조적으로, Ty streptomycin Gentamycin Xgl 한천 배지 상의 교배 스팟 재현탁액 10⁻² 희석 지점은 두 단계의 형광을 나타냅니다.

더 밝은 콜로니는 청색 콜로니에 해당하며 RFP 발현 수준이 더 높은데, 이는 아마도 벡터 내 LAC 프로모터로부터의 리드스루(read through)가 유도되었기 때문일 것입니다. 덜 밝은 콜로니는 백색 콜로니에 해당하며, 이는 실제 카세트 교환이 일어나 RFP가 직속 프로모터만 포함하고 LAC 프로모터로부터의 리드스루가 없는 상태입니다. 이러한 경향의 콜로니들은 스펙티노마이신(spectinomycin)에도 민감해야 합니다.

전체 수신 세포 대비 트랜스 이식 세포의 백분율로 표시되는 트랜스 통합 효율은 0.5% 범위 내에 있어야 합니다. 이 영상을 시청하신 후, 저희가 엔지니어링한 균주를 이용한 박테리아 접합을 통해 박테리아 염색체에 DNA 구조물을 삽입하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.