사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 원하는 DNA 구조를 미리 결정된 자리에서 박테리아 염색체에 통합하는 것입니다. 이는 4개의 조작된 박테리아 균주를 포함하는 짝짓기 프로토콜에 의해 달성됩니다. 수용 균주는 염색체에 통합된 ATP 부위 옆에 있는 spec mycin resistance 유전자와 e coli beta glucuronidase 유전자로 구성된 랜딩 패드 염기서열을 가지고 있습니다.

P JH one 10 공여자 균주는 B 부위에 스터퍼 적색 형광 단백질 유전자와 항생제 내성 유전자를 함유하는 플라스미드를 운반합니다. PJC 2 공여자 균주는 LAC 프로모터의 제어 하에 스트렙토마이세스 파지 C 31로부터 부위 특이적 인테그라제를 함유하는 플라스미드를 운반합니다. 네 번째 균주 MT 616은 세포에서 세포로의 플라스미드 전달을 접합하는 데 필요한 전달 유전자를 제공하여 수용체 균주를 통해 트랜스를 생성합니다.

인테그라제 매개 카세트 교환에 필요한 2개의 플라스미드 획득. PJ H one 10 plasmid로부터의 공여자 카세트를 염색체 상의 랜딩 패드 카세트의 마커와 교환하는 것은 랜딩 패드 마커, SPR 및 UIDA의 소실과 그 결과, 생성된 트랜스 이민자에서 공여자 카세트 RFP 및 GMR의 유지를 초래한다. 상동 재조합과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 프로토콜의 용이성과 효율성입니다.

또한 다양한 박테리아로 전이될 수 있습니다. 이 비디오에 사용된 수용체 균주는 단일 콜로니에서 5밀리리터의 TY 배지로 접종하는 트랜스 인테그린을 생성하기 위한 짝짓기 절차 2일 전에 S 밀리 라떼 균주이며, 스펙트 마이신이 섭씨 30도에서 2일 동안 S 밀리 균주를 배양하고, 짝짓기 절차 전날에 진탕하여 다음 대장균 균주 각각을 5밀리리터의 LB 액체 배지에 접종합니다. 적절한 항생제 DH 5 알파 테트라 사이클린 MT 616, 클로람페니콜 및 DH 5 알파와 함께 동원자 중간체를 포함하는 매체에 인테 그라제 발현 플라스미드를 포함하는 매체에 겐타마이신이 함유 된 배지에 3 개의 대장균 균주를 하룻밤 동안 배양하여 3 개의 전자 대장균 균주를 섭씨 37도에서 밤새 일정한 흔들림으로 짝짓기 절차를 위해 세포를 준비합니다. 4가지 배양물 각각을 튜브에 넣고 17, 000회 G에서 30초 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하고, 배지를 버리고, 각 세포 펠릿을 1밀리리터의 멸균 0.85%염화나트륨 원심분리에 다시 현탁시키고, 상등액을 버린 후 각 펠릿을 100마이크로리터의 멸균 0.85%염화나트륨 원심분리에 현탁시키고, 피펫을 사용하여 각 펠릿을 100마이크로리터의 멸균 0.85%염화나트륨에 개별적으로 스폿을 사용하여 각각에 대해 세척된 배양액 10마이크로리터를 발견합니다. 일반 TY 한천 플레이트에 변형시킵니다.

이 지점은 통제 지점입니다. 다음으로, 멸균 튜브에 Pjc 2를 함유하는 대장균 DH 5 알파를 제외한 각 균주 40 마이크로 리터를 첨가하고 일반 TY 한천 플레이트에 120 마이크로 리터의 이 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 이 지점은 인테그레이스가 없는 음성 대조군입니다.

마지막으로, 멸균 튜브 혼합물에 4 가지 균주 각각을 40 마이크로 리터를 추가하고 그 점을 지적합니다.이 혼합물의 160 마이크로 리터를 동일한 TDY 한천 플레이트에 넣습니다. 이 지점은 인테그라제 매개 카세트 교환 결합 지점입니다.

플레이트를 층류 후드에 놓고 그 후 약 20분 동안 반점을 건조시킵니다. 플레이트를 밀봉하고 짝짓기 프로토콜 행진이 끝난 다음 날 밤새 섭씨 30도에서 배양합니다. 스트렙토마이신(streptomycin)과 겐타마이신(gentamycin)이 보충된 TY 한천 플레이트에 두 개의 대조군 반점과 IMCE 짝짓기 반점.

S 밀리 수용체 균주는 IMCE 효율 계산을 위해 스트렙토마이신에 높은 수준의 내성을 부여하는 돌연변이를 가지고 있으며, Resus는 500 마이크로 리터의 멸균 0.85 % 염화나트륨에서 IMCE 짝짓기 지점의 약 1/4을 중단하고, 음의 7 번째 플레이트에 10으로 10 배 연속 희석을 만듭니다. 희석은 스트렙토 마이신이 보충 된 TY 한천 플레이트에서 음수 2에서 10까지 음수 5까지 경향이있다. 겐타마이신(GentaMycin)과 XGL은 트랜스 이민자를 위해 선택한다. 플레이트 희석은 TY 한천 플레이트에서 음수 3에서 10에서 음수 7까지 경향이 있으며, 스트렙토마이신과 xgl이 보충되어 트랜스 이민자와 잠재적 수혜자 모두를 위해 선택됩니다. IE 총 수혜자는 3일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.

녹색 표시등 아래에서 RFP 트랜스를 보고 빨간색 필터를 통해 총 수혜자의 CFU와 비교하여 트랜스 이민자의 CFU로 IMCE 효율 백분율을 계산하면 트랜스의 약 절반이 진정한 교환을 거쳐 백인과 둔감성을 갖게 됩니다 스트렙토마이신과 겐타마이신이 보충된 Ty에서 3일 동안 배양한 후 다음 대조군 균주에는 성장이 없어야 합니다. 인테그라제 없음 : s 밀리 라떼, UW 2, 27 , 대조군 e coli MT 616 대조군 e coli DH 5 알파 함유 P, JH 1 10 대조군 및 e coli DH 5 알파 함유 PJC 2 대조군. 대조적으로, 짝짓기 지점의 IMCE 줄무늬는 머리 줄무늬에 합류 성장이 있어야 하고 두 번째 줄무늬에 많은 군체가 있어야 합니다. 이 다음 두 이미지는 TY 스트렙토마이신 xgl 한천 및 TY 스트렙토마이신 겐타마이신 xgl 한천에 대한 TY 스트렙토마이신 겐타마이신 xgl 한천의 음의 2 희석에 10의 재현탁액을 보여줍니다.

파란색 군체는 단일 재조합입니다. 흰색 콜로니는 녹색 빛 아래에서 그리고 적색 필터를 통해 볼 때 진정한 카세트 교환을 거친 트랜스 인테그린이지만, TY strept cin xgl 한천에 짝짓기 반점 resus 현탁액의 음의 2 희석에 대한 경향은 형광이 부족합니다. 대조적으로, Ty 스트렙토마이신 Gentamycin Xgl Agar에 대한 짝짓기 반점 재현탁액의 10에서 마이너스 2 희석은 두 가지 수준의 형광을 보여줍니다.

더 밝은 군체는 파란색 군체에 해당하며 더 높은 RFP 발현을 가지며, 이는 아마도 벡터의 LAC 프로모터로부터 판독을 촉진하기 때문일 것입니다. 덜 밝은 군체는 진정한 카세트 교환을 거쳤고 직계 프로모터만 있고 LAC 프로모터에서 읽지 않은 RFP를 포함하는 흰색 콜로니에 해당합니다. 이러한 추세 이민자들은 또한 반점 마이신에 민감해야 합니다.

전체 수혜자 대비 트랜스 이민자의 비율로 표현되는 트랜스 통합의 효율성은 0.5% 범위여야 합니다.이 비디오를 시청한 후에는 박테리아 염색체에 DNA 구조를 삽입하기 위해 당사의 공학적 균주를 사용하여 박테리아 접합을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.