phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: Anopheles 벡터에 부위 특이적 전이유전자 통합을 위한 미세주입 기술

phiC31 인테그라제는 이식유전자, 즉 외래 유전자를 숙주 게놈으로 전환하는 부위 특이적 재조합을 촉매하는 파지 유래 재조합효소입니다. Anopheles 숙주에서 이식유전자 통합을 위해서는 적절한 완충액에 있는 Anopheles 배아로 시작합니다.

Anopheles 게놈은 유전자 통합을 위한 부착 부위와 시각적 선택을 위한 청록색 형광 마커로 사전 설계되었습니다. 다음으로, 원하는 이식유전자 화물, 부착 부위, 적색 형광 마커 및 플라스미드 백본 성분을 운반하는 소량의 기증자 플라스미드를 바이알에 추가합니다. 그런 다음 유전자 암호화 인테그라제를 운반하는 도우미 플라스미드의 최적 부피를 추가합니다. 이제 플라스미드 혼합물을 마이크로 주사기에 넣습니다.

생식 세포의 기원 부위인 배아의 후극에 플라스미드를 부드럽게 주입하여 세포질이 약간 움직입니다. 배아 내부로 들어가면 헬퍼 플라스미드는 인테그라제 효소 합성을 시작합니다.

인테그라제 효소는 기증자 플라스미드와 숙주 게놈 사이의 부위 특이적 재조합을 매개합니다. 따라서 기증자 플라스미드의 이식유전자와 적색 형광 마커는 Anopheles 게놈의 재조합 부착 부위 내에서 통합됩니다. 그 후, 간헐적으로 소용돌이치면서 부화를 위해 생리학적 조건에서 주입된 배아를 배양합니다.

며칠 안에 배아는 유충으로 부화합니다. 형광 현미경에서 성공적으로 통합된 유전자를 가진 Anopheles 유충은 숙주 게놈을 표시하는 청록색 형광과 기증자 플라스미드의 이식유전자를 표시하는 적색 형광을 모두 발현합니다.

내독소가 없는 정제 키트를 사용하여 기증자 및 보조 플라스미드를 정제합니다. 관심 있는 이식유전자를 운반하는 attB 태그 기증자 플라스미드와 인테그라제를 운반하는 도우미 플라스미드를 결합하여 최종 농도가 도모자 플라스미드의 마이크로리터당 350나노그램, 헬퍼 플라스미드의 마이크로리터당 150나노그램의 혼합물을 얻습니다.

음처럼 차가운 100% 에탄올 2.5부피에 0.1몰 아세트산나트륨 3부피를 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 그런 다음 소용돌이. 흰색 침전물이 즉시 보여야 합니다. 펠릿을 세척하고 주입 완충액에 재현탁하여 마이크로리터당 총 최종 농도 500나노그램에 도달합니다. 그런 다음 각각 10-15마이크로리터의 분취량을 준비하여 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

미세 주사 72시간 전에 원하는 도킹 라인에서 4-7일 된 모기와 야생형 모기에 혈액을 공급합니다. 25밀리몰 염화나트륨에서 배아의 후극을 45도 각도로 표적으로 삼아 Anopheles gambiae 배아 미세 주입을 수행합니다.

로카본 오일에서 후극을 30도 각도로 표적으로 삼아 Anopheles stephensi 배아 미세 주입을 수행합니다. 주사 직후 계란을 멸균 증류수로 채워진 페트리 접시에 옮기고 곤충 상태로 되돌립니다. 부화하면 G₀ 유충을 매일 소금에 절인 증류수가 담긴 트레이에 옮기고 번데기로 옮깁니다.