Name: 룽 공학을위한 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 학습하세요 탈세포화 폐 세포외기질과 생체 모방 바이오리액터를 이용한 기능성 폐 조직 공학 방법. 이 기술은 재생의학 및 폐 질환 연구에 활용될 수 있는 유망한 접근법을 제공합니다.

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우리는 생물 반응기 개발에 대한 도움이 Maegan B. Colehour 감사합니다. 이러한 연구들은 마취 예일 대학 학과별 및 NIH 부여 HL 098,220 (LEN)을하여 재정 지원을했다. THP는 NIH T32 GM007171에 의해 지원되었다.

1. 생물 반응기 어셈블리 decellularization과 문화 모두를위한 생물 반응기 설계 및 조립의 자세한 모습 (들)은 각각 그림 1 및 2에 제공됩니다. 모든 구성 요소는 생물 반응기의 조립하기 전에 소독을해야합니다. 다음과 같은 구체적인 사항이 설명되어 있습니다 : 연결 : <ol><li> 동맥 정맥이 튜브의 짧은 세그먼트에 의한 Y - 스플리터에 연결된 luer 잠금 피팅 구성되어 있습니다. luer 잠금 커넥터는 재관류의 튜브에 첨부되어, 그리고 폐동맥을 봉합하지 않는 Y의 세그먼트는 한 방향 밸브에 연결됩니다. 편도 밸브는 그 유체가 튜브 (재관류로 반대 방향으로)로 수립 수있는 중심이지만, 장기 재관류 동안 모든 매체는 허파로 흐른다. </li><li> tracheal 정맥은 또한 튜브와 Y - 스플리터에 연결된 luer 잠금 커넥터로 구성되어 있습니다. luer 잠금은 기관 저수지와 주요 챔버 사이의 호흡 루프에 연결됩니다. 기관을 봉합하지 않는 Y - 커넥터의 구간도 편도 밸브에 연결됩니다. 편도 밸브는 동맥 정맥과 같은 방식으로 지향합니다. </li></ol> 기능 : <ol start="3"><li> 동맥과 tracheal 캐뉼러의 단방향 밸브는 튜브의 흐름 반전을 가능하게하므로 공기 방울을 제거하는 허용하여 튜브에 공기 방울을 취소 활용하고 있습니다. </li><li> "호흡 루프"와 같은 매체가 다른 경로로하고 폐 밖을 다음 위치에 둘 하나 방향 밸브가 포함되어 있습니다. 이 기능의 자세한 설명은 저희 연구실 2에서 전에 간행물에 제공됩니다. </li><li> 혈관 재관류는 롤러 펌프를 사용하여 제공됩니다. 매체가 첨부된 정맥을 통해 폐동맥으로 perfused이며, 폐 vasculature를 통해, 그리고 매체가 재관류에 그려진있는 주요 생물 반응기로 직접 폐동맥 혈관 밖으로 흐르고 있습니다. </li></ol> 2. 장기 적출 수술 <ol><li> 미국 베티 의사회 (60 MG / kg IP)에 의해 규정된 지침에 따라, 성인 (3~6개월 세) 피셔 나트륨 과다 복용으로 344 pentobarbital 쥐를 안락사. 참고 : pentobarbital 솔루션 anticoagulation 100 단위 / ML에서 헤파린이 포함되어 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 함께 가슴과 복부를 스프레이하거나 닦으십시오. </li><li> , 심장과 폐를 노출 폐 손상하지 않도록 돌봐, 흉강을 엽니다. 조심스럽게 폐가 수축을 일으 킵, 흉강에 격막을 통해 작은 창을 만들어 다음 폐의 기지를 노출 수평이 절개를 확장합니다. 세로로 갈비뼈를 통해이 incisions을하고 심장과 폐를 노출 가슴 케이지를 철회. </li><li> 즉, 삭제 플런저와 주사기, 3 방향 꼭지 및 1.5inch, 21 게이지 바늘로 튜브의 ~ 20cm를 사용하여 중력 재관류 시스템을 준비합니다. 링 스탠드를 사용하여 동물의 위에서 ~ 20cm에 주사기를 유지합니다. 모든 공기가 재관류 관에서 제거되었는지 확인하십시오. </li><li> 폐에 복귀에서 예방, 혈액을 유출에 대한 권리 아트리움 컷. 폐에서 혈액과 perfusate 쉽게 배수를 허용하도록 좌심방을 절단하는 것도 도움이 될,하지만 필요는 없습니다 있습니다. </li><li> 우심실 바닥에 바늘을 삽입하고 PBS에 헤파린 나트륨 nitroprusside (50U/ml 및 1ug/ml, 각각)의 솔루션으로 폐를 perfuse에 꼭지를 엽니다. 폐동맥은 재관류 유체로 채우고 있는지 확인하고, 그 혈액이 폐에서 지우면됩니다. 필요한 경우, 추가 리필 액체와 재관류의 주사기. 일반적으로 단 ~ 10ml가 필요합니다. </li><li> 폐 혈액의 명확까지 살포를 계속하고 재관류를 중지합니다. </li><li> 최대한 목에까지, 기관 무료 해부하다. 확인 기관은 식도에서 분리됩니다. 심장, 폐, 기관 남아있는 모든 연결을 해부하다하고, 오는 블록을 제거합니다. </li><li> 메스 또는 날카로운 가위를 사용하여, 오른쪽과 왼쪽 심실을 노출, 심장의 꼭대기를 잘라. </li><li> 장소에서 우심실과 봉합을 통해 폐동맥 트렁크 Cannulate. 초과 왼쪽 심실 조직을 제거합니다. </li><li> 장소에기도와 치료를 Cannulate. 모두 tracheal과 폐동맥 동맥 캐뉼러는 기관, 폐, 또는 큰 혈관 (그림 1)에는 비틀림 응력이없는 그러한 위치하고 있는지 확인합니다. </li><li> 시스템에 갇힌 공기 방울이 장기로의 지속적인 흐름을 방지 수 있으므로, 동맥 정맥에 공기 방울이 없는지 확인합니다. 어떤 경우에는 기포가 완전히 유체 flow.To이 수행 중단할​​ 수 PBS가 들어있는 항아리에 심장 / 폐 블록을 놓으십시오. 모든 거품을 추방하기 위해 심장 정맥으로 PBS의 작은 금액을 주입하기 위해 바늘로 주사를 사용합니다. </li><li> 폐에서 최대한 공기를 제거하기 위해 PBS 4-5 시간으로기도를 세척. </li><li> 세척 단계 후S가 완료되며, 1ug​​/ml에서 PBS가 포함된 나트륨 nitroprusside (SNP)으로 폐를 팽창. tracheal 정맥에 스토퍼를 넣어,이 솔루션은 폐에 남아 있도록. 같은 솔루션이 폐동맥을 통해 vasculature 흐르는으로 폐는 vasodilation을 허용하기 위해, 30 분 동안 품어 수 있습니다. </li><li> 위의 "생물 반응기 조립"에서 설명한 Y 모양 캐뉼러에 연결된 luer 잠금 연결을 사용하여 생물 반응기 뚜껑에 심장 / 폐를 연결합니다. (그림 1). </li></ol> 3. 오르간 Decellularization <ol><li> decellularization 장치에 캡 (폐에 붙어있는) (그림 1)을 연결합니다. 폐동맥의 정맥은 재관류 라인에 연결해야하며, tracheal 정맥은 무료 부동해야합니다. 모든 라인이 공기를 분명 확인합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 라인에 공기가 decllularization 유체의 흐름을 방해하여 가난한 decellularization의 원천이 될 수 있습니다. 시스템에 갇힌 공기는 또한 세포 생존 3 부정적인 영향을 미칠 수있다면, 문화, 시간으로 유지하실 수 있습니다. </li><li> 폐에 이상 - 비정상적으로 증가하지 가득하지만 때까지 PBS / SNP와 폐를 부풀려. 폐가 높게 유지되도록 즉시 tracheal 정맥을 모자. </li><li> ~ 15 mmHg (20cm H 2 O의 압력)에 적어도 15 분 PBS / SNP와 Perfuse의 폐. 15 분 이상 후, 폐는 폐의 수 있도록 tracheal 정맥에서 마개를 제거합니다. </li><li> 30 분 대한 PBS / SNP와 재관류를 계속합니다. 필요한 경우, 리필 PBS / SNP는 재관류 압력이 10-15 mmHg로 유지되도록합니다. </li><li> decellularization 솔루션 (필름 챕스, 1M NaCl, 1X PBS의 25mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과 재관류를 시작합니다. 모든 라인이 공기의 명확 수 있도록하는데주의를 기울여야. 진공 시스템은 흡입을 제공하기 위해 도움이 될 수 있습니다. </li></ol> 솔루션 500ml가 폐 통해 perfused 때까지 decellularization 솔루션 Perfuse. 최적 압력이 &lt;15 mmHg (~ 20cm H 2 O). 이것은 일반적으로 2.5 시간을 필요로합니다. 흐름 속도는 초기에 일반적으로 (0.2-0.5ml/minute) 매우 느리게하며, 빠른 속도로 약 1ml/minute 이상으로 두 번째 시간에 향상시킬 수 있습니다. 정기적으로 충분한 액체를 확보, 생물 반응기에서 사용 decellularization 유체를 제거하면 폐 및 tracheal 정맥을 지원하기 위해 남아 있습니다. 4. rinsing 오르간 및 살균 <ol><li> 조직 문화 후드에 폐를 및 생물 반응기를 전송합니다. decellularization 오일이 들어있는 500ml 병을 제거하고 멸균 PBS의 1L까지 포함하는 멸균 항아리로 교체하여 멸균 PBS로 rinsing 시작합니다. 라인 공기 분명 보장하기 위해 진공 흡입을 사용합니다. </li><li> decellularization에 대해 같은 방식으로 10-15 mmHg에서 vasculature를 통해 Perfuse PBS. 주기적으로, 생물 반응기에서 폐기물 PBS를 제거하고 신선한, 멸균 PBS와 PBS의 병 및 / 또는 리필을 대체합니다. 무균 기술을 사용하는 것이 좋습니다입니다. </li><li> 멸균 PBS 최소한 2.5 L은 폐를 perfused 때까지 계속 rinsing. </li><li> 신선한 PBS를 포함하는 새로운 살균 생물 반응기 시스템에 폐를 전송. 전체 재관류 루프 및 전체기도 라인 모두 액체로 가득 있는지 확인합니다. 이후의 모든 단계가 5ml/min에서 폐가 perfuse하는 타악기 펌프를 사용합니다. </li><li> PBS에 0.​​1 % peracetic 산성과 PBS + 10% FBS + 10% 펜 - strep 솔루션 또는 3 시간 동안 야간 재관류를 통해 하나의 발판을 소독. 후자는 잔류 산성을 제거하는 데 몇 시간 동안 250ml PBS 3 변화와 폐를 rinsing 필요합니다. 각 린스 들어, 폐는 물론 조직의 모든 부분이 완전히 씻어서되는 것을 보장하기 위해 perfused으로 환기해야합니다. </li><li> 온도가 benzonase 치료를위한 준비, equilibrated 때까지 10% FBS와 10 % 페니실린 / ~ 1 시간에 대한 스트렙토 마이신을 가집니다 PBS로 37 ° C 배양기와 perfuse에게 폐를 전송합니다. </li><li> 잔여 DNA를 제거하는 benzonase과 폐를 치료 : <ol><li> 37 ° C.에 benzonase 버퍼를 (시약의 표 참조) 웜 </li><li> 각 폐 들어, 버퍼에 90U/ml benzonase와 benzonase 밖에 남지 한 10ml의 주사기 하나의 10ml의 주사기를 입력하십시오. </li><li> 폐의 관류를 중지합니다. </li><li> benzonase 버퍼와 함께기도를 부풀려. </li><li> 폐는 폐의 수 있도록 허용 (~ 1 분). 그런 다음 benzonase 솔루션으로 폐를 팽창. benzonase 버퍼 &amp; benzonase와 인플레이션 동안 폐에있는 공기를 주입하지 않도록하십시오. </li><li> 폐이 benzonase로 가득 찬 후 1 시간 동안 37 ° C에서 재관류이나 환기없이 앉을 수 있습니다. </li></ol></li><li> PBS + 10% FBS, 생물 반응기에서 이미 10% 페니실린 / 스트렙토 마이신과 하룻밤을 계속 살포을 재개하라. 다음날, 폐는 중 4 저장할 수 있습니다 ° C (최대 3 개월까지) 또는 셀 시딩 준비. </li><li> 셀룰러 repopulation위한 발판을 준비하기 위해 PBS / FBS / 문화 매체 ~ 250ml와 함께 benzonase 솔루션을 교체하십시오. 세포가 도입되기 전에 적어도 한 시간 동안 Perfuse,ND 직접 시딩 세포 전에 신선한 배지로 교체하십시오. </li></ol> 5. Recellularization 장기 reseeding에 대한 세포 소스의 선택은 개별 조사까지 남아 있습니다. 많은 세포 소스는 상용 인구, 갓 절연 신생아 또는 태아의 폐 세포, 배아 줄기 세포, 또는 상용 휴대 소스를 포함하여, 이용하실 수 있습니다. 이 세포 집단에 대한 구체적인 격리 프로토콜은 다른 4,5,6 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 씨앗을 모두 내피와 상피 세포의 인구에 대한 지침을 제공합니다. 내피 시딩 : <ol><li> 적절한 배지에 원하는 내피 세포 인구의 정지를 준비합니다. 세포 대단히 짧은 시간을 제거하는 40um 셀 스트레이너를 통해 필터 세포 현탁액. 저희 연구실에 전형적인 내피 시딩 문화 매체의 60ml에 약 30,000,000 쥐의 폐 microvascular 내피 세포를 활용합니다. </li><li> 일시적으로 생물 반응기의 재관류 루프 (그림 2)에 통합 작은 저수지에 세포 현탁액을 분배. 이 저수지 및 전체 재관류 루프에서 튜브가 공기 방울의 맑은 있는지 확인하십시오. </li><li> 롤러 펌프를 사용하여 3ml/min에서 폐동맥으로 세포를 불어 넣다. </li><li> 세포 주입 후, 원하는 속도로 주요 생물 반응기에서 recirculated 매체와 재관류을 계속합니다. </li><li> 매일, 재관류 튜빙 기포가 명백한 있는지 확인합니다. </li><li> 매체는 정기적으로 새로운 매체로 대체해야합니다, 이것은 종종 모든 3-4일 이루어집니다. </li></ol> 상피 시딩 : <ol><li> 원하는 상피 세포 인구의 세포 현탁액을 준비합니다. 저희 연구실에서는, 이것은 일반적으로 약 50-100000000 신생아 쥐의 폐 세포로 구성되어 있습니다. 40um 셀 스트레이너를 통해 인구를 필터링하고 주사기 문화 매체 15ml에 일시 중지합니다. 문화 매체의 80ml 함께기도 저수지를 입력합니다. </li><li> 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에있는 생물 반응기를 삽입하고, 환기를위한 주사기 펌프를 연결합니다. 모든 환기 라인이 공기를 분명 확인합니다. <ol><li> tracheal 정맥에 하나 볼러스으로 세포 현탁액의 15ml를 주입하여 폐로 씨앗은 세포. </li><li> 즉시 주사기 펌프를 사용하여 단일, 천천히 숨을 시작합니다. 이 호흡 따라서 약 20 분 지속, 3ml/minute에있는 주요 생물 반응기에서 공기의 60ml를 철수하여 관리합니다. 주요 생물 반응기에서 공기 필터가 즉시 세포 현탁액을 주입 후 천천히 숨을 시작하기 전에 내려 덮인 있도록. </li></ol></li><li> 폐 (약 0.5 ML / 분) 느린 혈관 재관류를 시작 후 약 18hrs에 대한 정적으로 앉아 있고, 수 있습니다. </li></ol> 6. 오르간 문화 재관류의 내용 및 환기 실험 설계에 따라 달라집니다 있지만, 다음 사항이 설명되어 있습니다 : <ol><li> 내피 문화 동안 재관류은 일반적으로 롤러 펌프를 사용하여 1-3 ML / 분 수행됩니다. 상피 문화 중에는 환기은 일반적으로 주사기 펌프를 사용하여 분당 한 호흡의 지속적인 속도로 제공됩니다. 주요 생물 반응기에서 공기의 5 10ml의 철수는 일반적으로 정상적인 갯벌 볼륨에서 폐 환기에 영향을해야합니다. 환기 동안 생물 반응기의 밀폐를 유지하기 위해 필요 때문에 환기는 매일 중지되어야하며 메인 챔버에서 공기를 교환해야합니다. 시스템의 모든 공기는 분압에 의해 약 21 %의 산소는 실내 공기입니다. 생물 반응기 (폐에 의해 유체의 5 10ml의 영감을 유도하는)에서 공기의 5 10ml 탈퇴는 폐의 크기를 기반으로 얼마나 많은 엽 (叶)은 교양중인 (동안 엽 (叶)은 분석을 위해 떨어져 묶여 수 있습니다 나머지 엽 (叶))는 문화의 계속합니다. 주사기 펌프에 의해 철회 공기의 양은 대략적인 교양 폐의 "갯벌 볼륨을"로 선택됩니다. </li><li> 매체는 문화 중에 모든 3~4일 대략 변경해야합니다. </li><li> 상피 및 내피, 저희 연구실 일반적으로 첫번째 씨앗 설계 조직 통풍되는 기간 동안 4-8일에 대한 상피에서 실험 모두의 공동 문화 중에. 내피는 다음 조직 모두 perfused하고 통풍이되는 후 재관류를 통해 씨앗을 품고있다. </li></ol> 7. 대표 결과 : Decellularization 프로토콜이 올바르게 수행되면, 갓 추출된 폐 누설하지 않고 공기를 개최한다. 액체에 빠져들면서 공기를 가득 찬 것은 이것을 확인할 수 있습니다 - 공기 누출을 나타내는 모든 거품이 없을 것입니다. (° C, 그리고 PBS는 궁극적으로 10 ML / 분 호흡을 통해 흐름을 할 수 있어야한다 37에서 3 시간 - 이후 decellularization 2.5의 과정을 통해 호흡을 통해 흐름에 decellularization 유체의 ~ 500ml 허용해야합니다~ 아래의 끝에 정수압의 15mm의 HG)가 rinsing. 0.1 % peracetic 산성과 benzonase 치료 후 폐는 최대 3 개월까지 4 ° C에 저장 될 수 있으며, 여전히 recellularization 적합 남아있다. 최종 decellularized 세포외 기질은 세포 물질을 완벽하게 찾아볼 수 있으며, 기본 폐의, 총 미세한​​ 및 ultrastructural 특성을 유지한다. 부족 decellularization 또는 rinsing는 잔여 DNA가 (비교 그림 3 참조) 얼룩 표준 hematoxylin과 eosin과 시각 수있는 발판에 "고집"에 발생할 수 있습니다. acellular 매트릭스 및 폐 조직의 문화 Repopulation 세포가 갓으로 피터슨 및 동료 4로 작업을 함께 온라인 보완에 설명된 칠일 된 신생아의 쥐 새끼에서 격리하는 경우, 하나 (10 새끼의 쓰레기 당 120-150 수백만 세포의 세포 수율을 기대할 수 막 넘는 10000000 neonate 당 세포). 셀 시딩 및 생물 반응기에서 폐의 후속 문화에 대한 최적 조건은 폐암의 모든 5 엽 (叶) 내에 잘 분산된 세포를 양보해야하고, 세포외 기질 발판 (그림 3)의 약 70 %의 혜택을 제공해야합니다. 교양 세포 인구는 상대적으로 풍부한 순서로 프로 분비 단백질 - C (SPC), 클라라 세포 분비 단백질 (CCSP) 및 aquaporin - 5 (AQP), (그림 4)와 같은 주요 호흡기 세포 마커에 대한 긍정적인 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 캐뉼러 위치 및 decellularization의 생물 반응기 <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 생물 반응기는 엔지니어링 폐 조직의 시딩와 문화에 사용 <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 원시, decellularized의 조직학 및 repopulated 폐 <img src="/files/ftp_upload/2651/2651fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 주요 폐암 마커에 대한 Immunofluorescence 염색법

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</ol>

LEN은 Humacyte, 재생 의료 회사의 주식을 보유하고 있습니다. Humacyte이 연구 자금을 안하고, 설명하는 실험이나 방법 중의 설계, 해석, 또는보고에 영향을주지 않았다. 저자 (LEN, THP, EAC)와 예일 대학의 폐 조직 공학에 관한 특허 출원을 제기했습니다.

시스템의 가장 중요한 측면은 여기 불임의 유지 보수 및 발판과 culturing repopulated의 폐 준비하고 시딩의 과정을 통해 혈관 침대에 적용된 압력에 가까운 모니터링을 포함 제시. 불임은 가장 사용하기 전에 모든 자료를 autoclaving하여 신속히 explant 후 닫힌 시스템에서 폐를 장착이 장벽의 후속 위반을 피하기에 의해 유지됩니다. decellularized 행렬이 완전히 씻어서 문화 살균 생물 반응기로 전송되고 나면, 실리콘 캡 및 기타 바다표범과 연결 방해하거나 제거해서는 안됩니다. 가능한 검사에서 압력을 유지하려면 중력에 의해 주도 흐름이 바람직합니다. 펌프가 문화 중 PBS와 계속 함께 rinsing 이후부터 액체의 재순환을 위해 필요한 경우, 우리는 직접 액체는 압력 변환기와 폐동맥을 입력 바로 전에 압력을 측정하는 것이 좋습니다. 적용 압력의 크기는 15mm의 HG를 초과해서는 안됩니다. Recellularized의 폐는 일반적으로 사일에서 최대 3 주에 이르는 기간을, 변화를위한 교양 수 있습니다. 환기는 일반적으로 상피 문화 중 하나 호흡 / 분 속도로 적용하는 동안 혈관 재관류는 일반적으로, 내피 문화 중 1-3 ML / 분 수행됩니다. 복합 문화 기간 동안 동시 환기 및 재관류가 적합합니다. 환기는 액체 배지 또는 공기 중과 함께 수행할 수 있습니다. 지난 몇 년간의 과정 동안, 몇몇 그룹은 체외에서 폐 상피을 차별과 폐 microanatomy 7, 8, 9, 10의 여러 측면을 복제의 가능성을 보여주는 중요한 조직 엔지니어링 작업을 완료했습니다. 그러나, 최근까지, 폐 조직을 엔지니어 이러한 시도 4,5 아무도 혈액과기도 구획 사이의 분리를 유지하고 가스 교환에 참여할 수있게되었습니다 implantable 장기 결과도 있었다. 설명한 방법은 기능적인 폐 조직을 생성하는 장기적인 목표를 향해서만 초기 단계 아르하지만 따라서,이 작품은 이식에 사용할 수 폐 조직의 양을 증가의 가능성을 향해 고무적인 단계입니다. 또한,이 작품은 조직 공학 복잡한 입체 구조를위한 발판으로 decellularized 세포외 기질의 효능을 입증하고 세포의 다양한 유형의 성장과 생존을 지원하는 오트 외.과 Uygun 및 동료 11,12 의해 수행되는 작업을 elaborates . 이 작품은 호흡기 세포 및 분자 생물학의 armamentarium하기 위해 기여 또한 중요하다. 더 전통적인 방법 13 실험실에서 culturing의 쥐 상피는 과학자들이 사용할 수있는 경우도 발생할 수도도 적절한 기계적 자극을 제공할 수 있으며, 그 빠른 드 분화의 수행자 위험을 공유하지 않는 유일한, 3 차원 환경을 제공함으로써 세포 분화 및 기능에 역할을 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용에 새로운 통찰력을 얻을 수 시스템. Cortiella의 그룹은 초기 연구 14 보여준 것처럼, 다양한 줄기 세포 집단의 운명을 안내하기 위해 활용으로 사용하면 이러한 지식은 특히 강력한 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 안락사 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 nitroprusside </td><td> Fluka </td><td> 71,778 </td><td></td></tr><tr><td> Euthasol의 안락사 솔루션 </td><td> Virbac AH </td><td> 710101 </td><td> 390 MG / ML pentobarbital 나트륨 주식 솔루션은 IP 관리를위한 적절한 희석해야합니다 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell 솔루션 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 챕스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB01915 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT 베이커 </td><td> 3722-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> 생물 반응기 구성 요소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 480 ML 병 </td><td> 콜 파머 </td><td> EW - 3460560 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 스토퍼, 크기 14 </td><td> 콜 파머 </td><td> EW - 06298-26 </td><td></td></tr><tr><td> Y - 커넥터 </td><td> 콜 파머 </td><td> ED - 30614-08 </td><td> 간선 및 tracheal 캐뉼러에 사용 </td></tr><tr><td> 실리콘 튜브 </td><td> Masterflex </td><td> 96420-14; 16 </td><td> L / S 14, 16 </td></tr><tr><td> 압력 트랜스 듀서 </td><td> 에드워즈 Lifesciences </td><td> PX - 212 </td><td></td></tr><tr><td> 체크 밸브 </td><td> 콜 파머 </td><td> EW - 98553-20 </td><td> 편도 밸브 </td></tr><tr><td> 4 웨이 stopcocks </td><td> 에드워즈 Lifesciences </td><td> 594WSC </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> 콜 파머 </td><td> 2915-08 </td><td> PTFE, 0.2μm </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Decell 및 rinsing apparati (생물 반응기에 첨가) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 1000 ML 유리 병 </td><td> 코닝 </td><td> 1395-500, - 1L </td><td> decell를 사용하여 중력에 의해 rinsing </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Benzonase 트리 트먼트 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 - HCL </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB14043 </td><td> 1M, 산도 8.0 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> JT 베이커 </td><td> 2444-01 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> 시그마 </td><td> E1014 </td><td> Endonuclease는 매트릭스에서 잔여 DNA를 제거하기 위해 사용 </td></tr></tbody></table>

룽 공학을위한 절차

Procedure for Lung Engineering

폐암 및 만성 폐쇄 폐 질환과 같은 만성 폐 질환, 연간 몇 280,000의 죽음에 대한 cumulatively 계정을 포함하여 폐 조직; 만성 폐쇄 폐 질환은 현재 미국 1 죽음의 네 번째 주요 원인이다. 이 사망률에 기여하는 것은 폐 일반적으로 수리 또는 미세한, 세포 수준 이상 재생하지 않는 것이 사실이다. 따라서 변성이나 감염 또는 수술 resected입니다 폐 조직에 의해 손상된 폐 조직은 기능상 생체내에서 대체되지 않습니다. 폐 조직은 체외에서 발생 될 수 있는지 여부를 탐험하기 위해, 우리는 acellular 폐암 세포외 기질 발판을 생산하는 세포 구성 요소를 제거하는 절차를 사용하여 성인 쥐의 폐 치료. 이 발판은 항공 및 vasculature의 계층 구조 분기뿐만 아니라, 콜라겐 IV, laminin 및 fibronectin 구성되어 대체로 그대로 지하 막을 유지합니다. 발판과 같은 부정적인 압력 환기 및 타악기 혈관 재관류로 폐 생리학의 중요한 측면을 모방하기위한 생물 반응기에 장착됩니다. culturing 폐 상피 및 생물 반응기 장착 발판 이내에 혈관 내피함으로써, 우리는 기본 폐 조직에 phenotypically 비교하고 그 짧은 시간 간격 (45~1백20분)의 가스 교환에 참여할 수있는 폐 조직을 생성할 수 있습니다. 이러한 결과는 격려하고, 폐 행렬의 repopulation은 폐 재생을위한 실질적인 전략 제안하고 있습니다. 이것은 가능성뿐만 아니라 이식에 대한 폐 조직의 공급을 증가 향해 일할뿐만 아니라, 더 이상 기간과 이전에 가능했습니다보다 정확한 microenvironment에 체외에서 호흡기 세포 및 분자 생물학을 공부하는 기회를 제공합니다.

우리는 decellularized의 폐를 세포외 기질 및 기능 폐 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 소설 biomimetic 생물 반응기를 개발했습니다. 생물 반응기에서 매트릭스와 culturing에 세포를 시딩함으로써, 우리는 시간의 짧은 기간에 대한 생체내에 이식하면 효과 가스 교환을 보여주는 조직을 생성합니다.

폐암 및 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 만성 폐질환을 포함한 폐 조직 관련 질환은 누적적으로 약 280,000명의 사망자를 발생시키며...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 형태학적 및 생리학적으로 실제 폐 조직과 유사한 배양 폐 조직을 생성하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 쥐로부터 심장과 폐를 적출합니다. 다음 단계로 폐동맥과 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 캐뉼라가 삽입된 폐를 탈세포화를 위한 바이오리액터에 연결합니다.탈세포화 및 세척 후, 폐를 멸균 배양 바이오리액터로 옮겨 세포 파종을 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 준비된 세포군을 폐의 원하는 구획에 파종하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 탈세포화된 세포외 기질에 영역 특이적 폐 마커를 발현하는 세포들이 효율적으로 재정착되었음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.기존의 체외 폐 세포 배양 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포가 분화된 표현형을 장기간 유지한다는 것이며, 따라서 3차원 생물학적 유래 기질 내에서 수주 동안 연구할 수 있다는 점입니다. 탈세포화를 위해 폐를 혈관 캐뉼라를 통해 바이오리액터 캡에 연결하고, 캡을 탈세포화 장치에 연결합니다. 폐 상단의 유리병은 링 스탠드와 부착된 클램프로 고정합니다.이 시점에서 세포 물질을 제거하여 세포외 기질 스캐폴드를 제작할 수 있으며, 여기에 다시 세포 물질을 채워 넣을 수 있습니다. 공학적으로 제작된 폐 조직의 파종 및 배양을 위한 바이오리액터의 조립 과정이 이 도식에 나타나 있습니다. 기관 캐뉼라의 루어 락 커넥터는 기관 리저버와 메인 챔버 사이의 호흡 루프에 연결됩니다.호흡 루프에는 두 개의 일방향 밸브가 포함되어 있습니다. 이는 배지가 폐로 들어올 때와 나갈 때 서로 다른 경로를 따르도록 배치된 것입니다. 내피세포 시딩을 위해 관류 라인에 소형 저장조가 일시적으로 통합되었습니다.맥동 펌프를 사용하여 저장소에서 폐의 혈관 구획으로 세포를 이송합니다. 혈관 관류는 롤러 펌프를 사용하여 제공됩니다. 배지는 연결된 캐뉼라를 통해 폐동맥으로 관류되어 폐 혈관계를 통해 흐른 뒤, 폐정맥을 거쳐 배지가 관류를 위해 흡입되는 메인 바이오리액터로 직접 배출됩니다.폐 상피를 호흡 루프 내에 주입하여 배치합니다. 폐가 포함된 메인 챔버와 기관 저장소는 폐의 장기 배양에 사용됩니다. 폐를 적출하고 동맥과 기관에 캐뉼라를 정확하게 삽입했다면, 갓 적출한 폐는 공기가 새지 않고 유지되어야 합니다.이는 액체에 잠긴 상태에서 공기를 주입하여 확인할 수 있습니다. 공기 누출을 나타내는 기포가 발생하지 않아야 합니다. 프로토콜을 시작하려면, 폐가 가득 찰 때까지 과팽창되지 않도록 주의하며 sodium nitroprusside가 포함된 PBS를 주입하고, 즉시 기관 캐뉼라를 캡으로 막아 폐가 팽창된 상태를 유지하도록 합니다.다음으로, 15 mmHg의 압력으로 PBS와 SNP를 사용하여 폐를 최소 15분 동안 관류합니다. 그 후, 기관 캐뉼라에서 스토퍼를 제거하여 폐의 공기를 뺍니다. 필요한 경우 PBS와 SNP로 15분에서 30분 동안 관류를 계속합니다.관류 압력이 10~15 mmHg로 유지되도록 PBS와 SNP를 보충합니다. 장기 탈세포화 과정을 시작하기 위해, 바이오리액터 캡을 탈세포화 장치에 연결합니다. 그다음 폐를 캡에 연결합니다.Y자형 캐뉼라에 연결된 루어 락(lure lock) 커넥터를 사용하여, 폐동맥 캐뉼라는 관류 라인에 연결하고 기관 캐뉼라는 자유롭게 띄워 둡니다. 조직의 완전한 탈세포화를 보장하기 위해서는 시스템 내에 공기가 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 동맥 및 기관 캐뉼라에 있는 일방향 밸브는 튜브 내 역류를 가능하게 하여 튜브 속의 기포를 제거하는 데 도움을 줍니다.따라서 시린지를 사용하여 공기 방울이 제거되도록 하여, 모든 라인에 공기가 없음을 확인하십시오. 탈세포화 용액으로 관류를 시작하십시오. 탈세포화 용액으로 관류하십시오.500 milliliters의 용액이 폐를 통해 관류될 때까지 최적 압력은 15 millimeters of mercury 미만으로 유지합니다. 이는 일반적으로 2.5시간이 소요됩니다. 유속은 보통 초기에 매우 느리게 설정하며, 두 번째 시간 동안 약 one milliliter per minute 또는 그 이상으로 빠르게 증가시킵니다.관류 과정 동안, 폐와 기관 캐뉼라를 지지할 수 있는 충분한 양의 액체가 남아 있도록 확인하면서 바이오리액터에서 사용된 탈세포화 용액을 주기적으로 제거합니다. 탈세포화 용액을 이용한 관류가 완료되면, 폐와 바이오리액터를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 장기 세척을 시작하려면 탈세포화 용액이 들어 있는 500 milliliter 병을 제거하고, 최대 1 liter의 멸균 PBS가 들어 있는 멸균 병으로 교체합니다.진공 흡입기나 주사기를 사용하여 라인 내에 공기가 없도록 확인한 후, 동일한 방식으로 10 to 15 mmHg의 압력으로 혈관계에 PBS를 관류합니다. 탈세포화 과정과 마찬가지로, 무균 조작법을 사용하여 바이오리액터에서 폐 PBS를 주기적으로 제거하고 PBS 저장 용기를 교체하거나 다시 채웁니다. 신선하고 멸균된 PBS를 사용하여 최소 2.5 L의 멸균 PBS가 폐로 관류될 때까지 세척을 계속합니다.이 과정은 일반적으로 헹굼 단계가 완료된 시점부터 탈세포화 프로세스 시작 후 이틀 정도 소요됩니다. 폐를 새로운 멸균 바이오리액터 시스템으로 옮기는데, 이때 시스템에는 신선한 PBS에 10% FBS와 10% Pen strep이 첨가된 용액이 들어 있어야 하며, 전체 관류 루프와 모든 기도 라인이 액체로 가득 찼는지 확인하십시오. 이후부터는 맥동 펌프를 사용하여 5 mm/min의 속도로 폐를 관류합니다.10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PBS로 하룻밤 동안 관류하여 폐 세포외 기질 스캐폴드를 멸균합니다. 이 단계를 마친 후, 폐를 37°C 인큐베이터로 옮겨 1시간 동안 또는 온도가 평형을 이룰 때까지 유지합니다. Ben Nase 처리를 준비하기 위해, 다음 단계로 폐에 Ben Nase를 처리합니다.각 폐의 잔류 DNA를 제거하려면, 먼저 10 milliliter 주사기 하나에는 Prewarm Ben Nase buffer만 채우고, 다른 10 milliliter 주사기에는 Ben Nase buffer로 희석하여 90 units per milliliter 농도가 되도록 Ben Nase를 채웁니다. 폐의 관류를 중단하십시오.그다음 폐로 공기가 주입되지 않도록 주의하며 Ben Nase 완충액으로 기도를 팽창시킵니다. 1분 동안 폐의 공기가 빠지도록 둡니다. 그런 다음 Ben Nase 용액으로 폐를 팽창시킵니다.다시 한번, Ben Nase로 팽창시킨 후 폐에 공기가 들어가지 않도록 주의하십시오. 37 °C에서 관류나 환기 없이 폐를 1시간 동안 그대로 둡니다. 1시간이 지나면 바이오리액터에 이미 들어 있는 10% FBS 및 10% penicillin streptomycin이 첨가된 PBS로 관류를 재개하고, 다음 날까지 밤새 관류를 계속합니다.세척 및 멸균 후, 긴 세포외 기질 스캐폴드를 세포 재군집화가 가능하도록 준비합니다. P-B-S-F-B-S benzo a 용액을 250 milliliters의 배양액으로 교체합니다. 세포를 주입하기 전 최소 1시간 동안 배양액을 관류시키고, 세포를 파종하기 직전에 신선한 배양액으로 교체합니다.장기 재생을 위해 다양한 세포원을 활용할 수 있습니다. 본 과정에서는 상피세포 집단을 이용한 시딩(seeding) 방법을 시연합니다. 먼저, 원하는 상피세포 집단의 세포 현탁액 15 milliliters를 담은 주사기를 준비하십시오.다음으로, 기도 저장조에 80 milliliters의 배양액을 채우고 모든 환기 라인에 공기가 없는지 확인합니다. 그런 다음 바이오리액터를 37 degrees Celsius 조직 배양 인큐베이터에 넣고 환기를 위한 시린지 펌프를 연결합니다. 15 milliliter의 세포 현탁액을 기관 캐뉼라에 주입하여 단일 신속 볼러스 방식으로 폐에 세포를 파종합니다.메인 바이오리액터의 공기 필터가 캡으로 밀봉되었는지 확인하십시오. 그런 다음 즉시 시린지 펌프를 사용하여 분당 3 milliliters의 속도로 메인 바이오리액터에서 60 milliliters의 공기를 추출하는 단일 저속 호흡 과정을 시작하십시오. 이 과정은 약 20분 동안 지속됩니다.그 후 폐를 약 18시간 동안 정적으로 유지합니다. 분당 약 0.5 milliliters의 속도로 천천히 혈관 관류를 시작하십시오. 장기 배양 중 관류는 일반적으로 분당 1에서 3 milliliters의 속도로 수행됩니다.상피 세포 배양 중 롤러 펌프를 사용할 때, 환기는 일반적으로 분당 1회의 호흡 횟수와 5~10 mL의 일회 호흡량으로 지속적으로 제공됩니다. 시린지 펌프를 사용할 때는 공기를 주기적으로 흡입하고 바이오리액터 내부로 주입하여, 메인 챔버 내부를 음압과 대기압 상태로 교차시킴으로써 호흡을 유도합니다. 환기 중에는 바이오리액터의 기밀 상태를 유지해야 하므로, 매일 환기를 일시 중지하고 메인 챔버 내부의 공기를 교체해야 합니다.또한, 배지는 약 3~4일마다 교체해야 합니다. 배양 과정 중 폐 상피와 혈관 내피를 배양함으로써 매회 전체 부피의 약 절반을 교체해야 합니다. 바이오리액터에 장착된 스캐폴드를 통해, 짧은 시간 동안 가스 교환이 가능한 폐 조직을 생성할 수 있습니다.탈세포화된 쥐 폐의 H&amp;E 염색 결과와 비교하기 위해, 여기에서는 천연 쥐 폐의 표준 hematoxylin 및 eosin 염색 결과를 보여줍니다. 최종 탈세포화된 세포외 기질은 세포 물질이 완전히 제거되어야 하며, 천연 폐의 육안적, 현미경적 및 초미세 구조적 특성을 유지해야 합니다. H&amp;E 염색을 통해 불충분한 탈세포화 또는 세척으로 인해 스캐폴드에 남아 있는 DNA 잔해를 시각화하여, 세포 파종 및 이후의 폐 배양을 위한 최적의 조건을 확인할 수 있습니다.또한 바이오리액터는 폐의 5개 엽 전체에 걸쳐 세포가 고르게 분포하게 해야 하며, 세포외 기질 스캐폴드의 약 70%를 덮어야 합니다. 이 이미지들은 면역형광 염색을 통해 천연 폐와 재세포화된 폐를 비교한 것입니다. 주요 폐 마커의 경우, 배양된 세포군은 Clara 세포 분비 단백질 pro secretory protein C와 Aquaporin five에 대해 양성 반응을 보입니다.모든 패널에서 관심 마커는 빨간색으로, DAPI 염색된 핵은 파란색으로 표시되어 있습니다. 탈세포화부터 재세포화까지의 이 절차를 숙달하면, 적절히 수행했을 때 4~5일 내에 완료할 수 있습니다.

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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룽 공학을위한 절차

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