룽 공학을위한 절차

우리는 decellularized의 폐를 세포외 기질 및 기능 폐 조직을 생성하는 데 사용할 수있는 소설 biomimetic 생물 반응기를 개발했습니다. 생물 반응기에서 매트릭스와 culturing에 세포를 시딩함으로써, 우리는 시간의 짧은 기간에 대한 생체내에 이식하면 효과 가스 교환을 보여주는 조직을 생성합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 형태학적으로나 생리학적으로 천연 폐 조직과 유사한 폐 조직을 배양에서 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 쥐의 심장과 폐를 채취하여 수행됩니다. 다음 단계는 폐동맥과 기관을 캐뉼레이션하고 캐뉼레이션된 폐를 생물반응기에 연결하여 탈세포화하는 것입니다.

탈세포화 및 헹굼 후 폐를 멸균 배양 생물 반응기로 옮기고 착석을 준비합니다. 절차의 마지막 단계는 준비된 세포 집단으로 폐의 원하는 구획을 파종하는 것입니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사를 통해 탈세포화된 세포외 기질이 지역별 폐 마커를 발현하는 세포로 효율적으로 재증식되는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

폐 세포를 in vitro에서 배양하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 장시간 동안 분화된 표현형을 유지하므로 생물학적으로 파생된 3차원 기질에서 몇 주 동안 연구할 수 있다는 것입니다. 탈세포화를 위해 폐는 혈관 캐뉼라를 통해 생물반응기 캡에 연결되고 캡은 탈세포화 장치에 연결됩니다. 폐 위의 유리병은 링 스탠드와 부착된 클램프로 제자리에 고정됩니다.

이 시점에서 세포 물질을 제거하여 세포 외 기질 골격을 생성할 수 있으며, 이 골격은 세포 물질로 다시 채워질 수 있습니다. 조작된 폐 조직의 파종 및 배양을 위한 생물반응기의 조립이 이 다이어그램에 나와 있습니다. 기관 캐뉼라의 루어 잠금 커넥터는 기관 저장소와 메인 챔버 사이의 호흡 루프에 연결됩니다.

호흡 루프에는 두 개의 단방향 밸브가 포함되어 있습니다. 매체가 폐로 들어오고 나가는 다른 경로를 따르는 위치. 작은 저장소는 내피 세포의 파종을 위해 관류 라인에 임시로 통합됩니다.

박동 펌프는 저장소에서 폐의 혈관 구획으로 세포를 운반하는 데 사용됩니다. 혈관 관류는 롤러 펌프를 사용하여 제공됩니다. 배지는 부착된 캐뉼라를 통해 폐동맥으로 관류되고, 폐 혈관 구조를 통해 폐정맥을 통해 주 생물 반응기로 직접 흘러 들어가 배지가 관류를 위해 작성됩니다.

폐 상피는 호흡 루프에 주입하여 자리잡습니다. 폐를 포함하는 메인 챔버와 기관 저장소는 장기적인 폐 배양에 사용됩니다. 폐를 적출하고 동맥과 기관을 올바르게 캐뉼레이션하면 새로 추출한 폐는 누출 없이 공기를 보유해야 합니다.

이것은 액체에 잠긴 상태에서 공기로 부풀려 확인할 수 있습니다. 공기 누출을 나타내는 거품이 없어야 합니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 폐가 가득 찰 때까지 니트로프레스 나트륨 측이 포함된 PBS로 폐를 팽창시키되 과도하게 팽창하지 않도록 즉시 기관 캐뉼라를 덮어 폐가 팽창된 상태로 유지되도록 합니다.

다음으로, 15mm의 수은에서 최소 15분 동안 PBS와 SNP를 폐에 관류합니다. 그런 다음 기관 캐뉼라에서 마개를 제거하여 폐가 수축할 수 있도록 합니다. 필요한 경우 15-30분 동안 PBS 및 SNP로 관류를 계속합니다.

풍부한 압력이 10-15mm의 수은으로 유지되도록 PBS 및 SNP를 리필합니다. 긴 탈세포화 절차를 시작하기 위해 생물반응기 캡이 탈세포화 장치에 연결됩니다. 그런 다음 폐가 뚜껑에 연결됩니다.

YS 모양의 캐뉼러에 연결된 루어 잠금 연결을 사용하여 폐동맥 캐뉼러는 관류 라인에 연결되어야 하고 기관 캐뉼러는 자유롭게 떠있어야 합니다. 조직의 완전한 탈세포화를 보장하려면 체내에서 공기를 차단하는 것이 중요합니다. 동맥 및 기관 캐뉼러의 단방향 판막은 튜브의 역류를 가능하게 하여 튜브의 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다.

따라서 주사기로 기포를 제거할 수 있도록 하고 모든 라인에 공기가 없는지 확인하십시오. 탈세포화 용액으로 관류를 시작합니다. 탈세포화 용액으로 관류됩니다.

500밀리리터의 용액이 폐를 통해 관류될 때까지 최적의 압력은 15밀리미터 미만의 수은입니다. 일반적으로 2.5시간이 소요됩니다. 유속은 일반적으로 처음에는 매우 느리고 두 번째 시간 동안 분당 약 1 밀리리터 이상으로 급격히 증가합니다.

관류 중에 주기적으로 제거하고 생물 반응기에서 탈세포화 유체를 사용하면서 폐와 기관 캐뉼라를 지지하기에 충분한 유체가 남아 있는지 확인했습니다. 탈세포화 유체를 사용한 관류가 완료되면 폐와 생물반응기를 조직 배양 후드로 옮깁니다. 장기 헹굼을 시작하려면 탈세포화 유체가 들어 있는 500ml 병을 제거하고 최대 1리터의 멸균 PBS가 들어 있는 멸균 병으로 교체하십시오.

진공 흡입 또는 주사기를 사용하여 동일한 방식으로 10-15mm의 수은에서 혈관 구조를 통해 PBS의 공기 관류가 라인에 없는지 확인합니다. 탈세포화의 경우, 멸균 기술을 사용하여 주기적으로 생물반응기에서 폐 PBS를 제거하고 PBS 용기를 교체하거나 다시 채웁니다. 신선하고 멸균된 PBS의 경우 최소 2.5리터의 멸균 PBS가 폐를 관류할 때까지 계속 헹굽니다.

이것은 일반적으로 헹굼이 완료될 때 탈세포화 과정이 시작된 후 2일이 걸립니다. 새로운 PBS와 10% FBS 및 10% 펜 연쇄상구균을 포함하는 새로운 멸균 생물반응기 시스템으로 폐를 옮기고 전체 관류 루프와 전체 기도 라인이 모두 액체로 채워지도록 합니다. 여기서부터 박동 펌프를 사용하여 분당 5mm로 폐를 관류시킵니다.

10%FBS와 10%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 PBS로 하룻밤 관류하여 폐 세포외 기질 골격을 살균합니다. 이 단계를 완료한 후 폐를 섭씨 37도의 인큐베이터로 1시간 동안 또는 온도가 평형을 이룰 때까지 옮깁니다. Ben Nase로 치료를 준비하기 위해 다음 단계는 Ben Nase로 폐를 치료하는 것입니다.

각 폐의 잔여 DNA를 제거하려면 먼저 10ml 주사기 1개에 Prewarm Ben Nase 완충액만 채우고 10ml 주사기에 90ml/ml당 90 단위를 채웁니다. Ben Nase 완충액에 희석된 Ben Nase. 폐의 관류를 중지하십시오.

그런 다음 폐에 공기를 주입하지 않도록 Ben Nase 완충액으로 기도를 팽창시킵니다. 1분 동안 폐가 수축되도록 합니다. 그런 다음 Ben Nase 용액으로 폐를 팽창시킵니다.

다시 말하지만, Ben Nase로 팽창한 후 폐로 공기가 유입되지 않도록 주의하십시오. 폐가 섭씨 37도에서 1시간 동안 관류나 환기 없이 그대로 두십시오. 1시간이 끝나면 이미 생물반응기에 있는 PBS와 10%FBS 10%페니실린 스트렙토마이신으로 관류를 재개하고 다음 날 밤새 관류를 계속합니다.

헹굼 및 살균 후, 긴 세포외 기질 골격은 세포 재증식을 위해 준비될 수 있습니다. P-B-S-F-B-S 벤조 용액을 250ml의 배양물로 교체하십시오. 세포가 도입되기 최소 1시간 전에 Medium perfu를 투여하고 세포를 파종하기 직전에 신선한 배양 배지로 교체하십시오.

많은 세포 공급원이 장기 후퇴를 위해 활용될 수 있습니다. 여기에서는 상피 세포 집단이 있는 좌석을 시연할 것입니다. 먼저, 원하는 상피 세포 집단의 세포 현탁액 15ml를 포함하는 주사기를 준비합니다.

다음으로, 기도 저장통에 80ml의 배양 배지를 채우고 모든 환기 라인에 공기가 없는지 확인합니다. 그런 다음 생물반응기를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 넣고 환기를 위해 주사기 펌프를 연결합니다. 15ml의 세포 현탁액을 기관 캐뉼라에 주입하여 단일 고속 볼루스를 사용하여 세포를 폐에 파종합니다.

주 생물 반응기의 공기 필터가 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 즉시 주사기 펌프를 사용하여 분당 3ml의 속도로 주 생물 반응기에서 60ml의 공기를 빼내기 위해 한 번의 느린 호흡을 시작합니다. 이 과정은 약 20분 동안 지속됩니다.

A: 그 후 약 18시간 동안 폐가 정적으로 앉아 있도록 합니다. 분당 약 0.5ml의 속도로 천천히 혈관 관류를 시작합니다. 장기 배양 중 관류는 일반적으로 분당 1-3밀리리터로 수행됩니다.

상피 배양 중 롤러 펌프를 사용하여 일반적으로 분당 1회의 호흡과 5-10밀리리터의 일회 호흡량으로 인공호흡이 제공됩니다. 주사기 펌프를 사용하여 공기를 주기적으로 빼내고 생물 반응기로 주입하여 메인 챔버 내부의 음압과 대기압을 번갈아 가며 호흡에 영향을 줍니다. 환기 중 생물 반응기를 밀폐된 상태로 유지해야 하기 때문에 매일 환기를 일시 중지하고 메인 챔버의 공기를 교체해야 합니다.

또한 배지는 약 3-4일마다 교체해야 합니다. 배양 중에는 폐 상피와 혈관 내피를 배양하여 매번 총 부피의 약 절반을 교환해야 합니다. 생물반응기에 장착된 골격 내에서 짧은 시간 간격으로 가스 교환에 참여할 수 있는 폐 조직을 생성할 수 있습니다.

탈세포화된 쥐 폐의 H 및 e 염색과 비교하기 위해 천연 쥐 폐의 표준 적혈구, 토인 및 어인 염색이 여기에 나와 있습니다. 최종적인 탈세포화된 세포외 기질은 세포 물질이 전혀 없어야 하며, 천연 폐의 총체적, 미시적, 초구조적 특성을 유지해야 합니다. h 및 e 염색은 불충분한 탈세포화로 인해 골격에 달라붙거나 세포 파종 및 후속 폐 배양을 위한 최적의 조건을 헹구는 결과로 잔여 DNA를 시각화할 수 있습니다.

그리고 생물반응기는 폐의 5개 엽 모두에 잘 분포된 세포를 생성해야 하며 세포외 기질 골격의 약 70%를 커버해야 합니다. 이 이미지는 면역 형광에 의해 염색되었을 때 천연 폐와 재증식 폐를 비교합니다. 주요 폐 마커의 경우, 배양된 세포 집단은 Clara cell secretory protein pro secretory protein C 및 Aquaporin five에 대해 양성입니다.

관심 마커는 빨간색으로 표시되고 DAPI 염색 핵은 모든 패널에서 파란색으로 표시됩니다. 탈세포화에서 후퇴까지 이 절차를 숙달하면 적절하게 수행되면 4-5일 안에 완료할 수 있습니다.