접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

이 짝짓기 분석의 전반적인 목표는 기능적 유형 4 분비 복합체의 맥락에서 플라스미드 전달에 영향을 미치는 능력에 대한 conjugative transfer gene 내의 돌연변이의 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 박테리아 접합에서 기능적 유형 4 분비 시스템을 조립할 때 전달 단백질 간에 발생하는 단백질-단백질 상호 작용 영역을 식별하는 것과 같은 단백질 특정 질문을 할 수 있습니다. 이 기술에서는 큰 접합 플라스미드의 유전자가 상동 재조합에 의해 녹아웃됩니다.

유전자 기능은 더 작은 플라스미드의 knock-out에 표적 유전자를 제공하여 평가합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 절차를 성공적으로 수행하기 위해 조직과 설정이 중요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 해석 가능한 결과를 얻으려면 적절한 실험 준비가 필요합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분해된 pBAD33 플라스미드를 준비하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 각 다이제스트를 아가로스 젤에서 실행합니다. UV 캐비닛과 멸균 면도기를 사용하여 카테터 염기서열에 해당하는 2.8kg 베이스밴드를 젤에서 잘라냅니다.

DNA의 UV 노출을 최소화하기 위해 신속하게 작업하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 잘라낸 겔 슬라이스에서 DNA를 추출합니다. 추출된 고양이 카세트를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 또는 PCR로 증폭한다.

멸균 PCR 튜브에서 반응 혼합물을 준비합니다. 상동 재조합을 위해 타겟 유전자 염기서열과 상동적인 돌출부를 포함하는 프라이머를 사용합니다. 템플릿 DNA를 이중 증류수로 대체하는 것을 제외하고 동일한 구성 요소를 포함하는 음성 대조군을 설정합니다.

또한 PCR 반응에서 효과가 입증된 템플릿 DNA와 프라이머를 사용하여 positive control을 설정합니다. 피펫팅으로 모든 반응 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 나열된 PCR 매개변수를 사용하여 추출된 고양이 카세트를 증폭합니다.

각 반응에 대해 5마이크로리터만 사용하여 아가로스 젤 전기영동을 통해 올바른 증폭 크기를 확인할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 앰플리콘을 정제합니다. 증폭된 cat cassette 300 nanogram을 50 microlitent DY330R cell에 첨가하여 pOX38-Tc plasmid를 얼음 위에 묻힙니다.

위아래로 부드럽게 피펫팅하여 섞습니다. 변형되지 않은 pBAD33 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하여 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 세포를 미리 냉각된 1mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다.

electroporator를 사용하여 1.8 킬로볼트에서 5.5 밀리초의 시간 상수로 셀을 전기천공합니다. 펄스를 가한 후 즉시 1ml의 SOC 매체로 세포를 희석하고 새 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 섭씨 32도에서 2시간 동안 배양합니다.

다음으로, 각 샘플의 100 마이크로 리터를 밀리리터 테트라 사이클린 당 10 마이크로 그램 및 밀리리터 클로람 페니콜 당 20 마이크로 그램을 포함하는 한천 플레이트로 분취합니다. 멸균 스프레더를 사용하여 접시 위에 부분 표본을 펴 바릅니다. 접시를 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 거꾸로 배양합니다.

다음 날, 성공적인 재조합 물질을 선택합니다. 세포에 도입된 고양이 카세트는 관심 유전자와 상동 재조합을 거쳐 pOX38-Tc 클로람페니콜 녹아웃 클론을 생성합니다. 300 나노그램의 pK184 유전자 또는 pK184 유전자 돌연변이 플라스미드를 이전과 같이 pOX38-Tc 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드를 보유한 50마이크로리터의 전기등성 DY330R 세포로 분리합니다.

XK1200 공여체 세포를 생성하기 위해 접합 짝짓기를 수행한 후 전기천공법을 수행하여 XK1200 세포를 생성하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 클로람페니콜 녹아웃과 PK184 플라스미드를 모두 하포레이션합니다. 클로람페니콜 및 카나마이신이 함유된 20ml의 멸균 LB에서 이러한 XK1200 기증자 세포의 하룻밤 배양을 준비합니다. 또한 글리세롤 스톡 또는 ang 한천 플레이트의 단일 콜로니에서 추출한 세포를 사용하여 스트렙토마이신 1밀리리터당 50마이크로그램으로 50mL LB의 MC4100 수용 세포를 준비합니다.

섭씨 37도에서 배양물을 성장시키고 200rpm으로 흔듭니다. 모든 공여자 세포에 최종 농도인 100밀리몰까지 포도당을 추가합니다. 다음 날, 각 하룻밤 배양에서 70분의 1을 동일한 항생제가 함유된 멸균 LB 2ml에 따로 희석합니다.

200rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 중간 로그 단계로 세포를 성장시킵니다. 세포 배양을 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 항생제를 제거하기 위해 냉간 멸균 LB로 세포 펠릿을 한 번 씻습니다.

이전과 같이 두 번째 원심분리 후 2ml의 저온 멸균 LB.In 복제에 세포를 현탁시키고 100마이크로리터의 기증자 세포와 100마이크로리터의 수혜자 세포를 총 1ml의 부피에 대해 800마이크로리터의 멸균 LB 배지로 분취합니다. 세포가 섭씨 37도에서 흔들리지 않고 1시간 동안 짝짓기를 하도록 합니다. 한 시간 후, 짝짓기 쌍을 방해하기 위해 30초 동안 세포를 소용돌이칩니다.

그런 다음 더 이상의 짝짓기를 방지하기 위해 세포를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 중간 로그 배양액과 신선한 멸균 LB를 사용하여 공여자 및 수혜자 세포를 1 및 100에서 1 및 1,000만 세포로 6회 연속 희석할 수 있습니다. 날라딕산(naladixic acid), 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 카나마이신(kanamycin)을 함유한 한천 플레이트의 두 반쪽 각각에서 XK1200 기증자 세포의 각 희석액에 대해 10마이크로리터 분취액을 찾아냅니다.

스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 한천 플레이트에서 수용자 MC4100 세포의 희석액에 대해 스포팅을 반복합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 와류 혼합물과 신선한 멸균 LB를 사용하여 transconjugants의 6 가지 희석액을 준비합니다.

pOX38-Tc chloramphenicol knock-out bu를 품고 있는 transconjugant MC4100 세포를 선택하여 스트렙토마이신과 클로람페니콜을 포함하는 한천 플레이트의 각 절반에서 각 희석액의 10마이크로리터 분취량을 발견합니다. 두 중복 혼합물 모두에 대해 반복합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

각 donor, recipient 및 transconjugants 세포에 대한 동일한 희석 spotting의 colony 수를 계산하여 짝짓기 효율성을 계산합니다. 또한, 주어진 희석액에서 수용자보다 더 많은 수의 transconjugants로 인한 편향을 테스트하기 위해 수용자 콜로니를 계산합니다. 짝짓기 효율을 transconjugant colonies의 수를 donor colony의 수로 나눈 값에 100을 곱하여 100개의 donor cells당 효율 값을 구하는 것으로 계산합니다.

pOX38-Tc 플라스미드에서 4형 분비계 유전자-tra-F가 녹아웃되면 pOX38-Tc traF 클로람페니콜이 기증자에서 수용 세포로 플라스미드를 녹아웃합니다. 그러나, traF 유전자가 PK184 traF 플라스미드에 의해 트랜스에 제공될 때, pOX38-Tc traF 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드의 접합 전달의 회복이 관찰된다. 공여자 세포에서 traF 및 PK184 플라스미드의 희석 돌연변이와 함께 제공되면 pOX38-Tc traF 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드의 접합 전달 손실이 관찰될 수 있습니다.

Loss of conjugative transfer는 접합 유형 4 분비 시스템 내에서 단백질-단백질 상호 작용에 중요한 단백질의 영역을 나타냅니다. 그런 다음 이 영역은 전달 효율성에 영향을 미치는 점 돌연변이에 의해 더 자세히 조사할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 예상 성장 시간과 함께 하루 만에 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 여기에 설명된 셀 이외의 셀에서 수행할 수 있습니다. 이 시점에서 중요한 측면은 공여자와 수용자 세포가 관심 플라스미드를 가지고 있지 않다는 것입니다. 따라서 knock-out plasmid를 추가할 때 상충되는 결과를 얻지 않습니다.

이 절차를 시도하는 동안 공여자, 수혜자 및 transconjugate 세포에 대한 다양한 성장 조건과 항생제가 있으므로 매우 체계적인 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 결정학, NMR 또는 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 단백질의 상세한 구조 및 기능 그림을 얻을 수 있습니다.