Name: 접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 세균 접합에서 유전자 결실과 교배 분석을 이용한 단백질 상호작용 영역 분석 방법을. 이 기법은 미생물학 및 유전학 연구에서 유전자 기능을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학위원회에서 발견 그랜트 (NSERC)에 의해 지원되었다.

<ol><li>Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+in+pathogenic+and+environmental+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).</li>
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<li>Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+sequence+and+gene+products+of+the+transfer+region+of+the+F+sex+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor.</a> Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).</li>
<li>Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+exclusion+in+F-like+plasmids+requires+intact+TraG+in+the+donor+that+recognizes+its+cognate+TraS+in+the+recipient%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient.</a> Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).</li>
<li>Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Architecture%2C+and+Function+of+Bacterial+Type+Iv+Secretion+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+the+Agrobacterium+VirB%2FD4+and+related+conjugation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems.</a> Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).</li>
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<li>Christie, P. J., Cascales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+dynamic+properties+of+bacterial+Type+IV+secretion+systems+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review).</a> Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).</li>
<li>Christie, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+secretion%3A+Intercellular+transfer+of+macromolecules+by+systems+ancestrally+related+to+conjugation+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).</li>
<li>Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+structure+of+the+bacterial+type+IV+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).</li>
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<li>Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Regulation+of+the+Type+VI+Secretion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and Regulation of the Type VI Secretion System.</a> Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).</li>
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<li>Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+pilus+in+recipient+cell+recognition+during+bacterial+conjugation+mediated+by+F-like+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids.</a> Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).</li>
<li>Jobling, M. G., Holmes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+vectors+with+the+pl5a+replicon%2C+kanamycin+resistance%2C+inducible+lacZ%CE%B1+and+pUC18+or+pUC19+multiple+cloning+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites.</a> Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+P%28BAD%29+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter.</a> J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
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<li>Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Like+Type+IV+Secretion+Systems+Encode+Proteins+with+Thioredoxin+Folds+That+Are+Putative+DsbC+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues.</a> J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).</li>
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<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).</li>
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<li>Harris, R. L., Silverman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tra+proteins+characteristic+of+F-like+type+IV+secretion+systems+constitute+an+interaction+group+by+yeast+two-hybrid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).</li>
<li>Moore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+F-Plasmid+Conjugative+Transfer+Gene+traU%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU.</a> J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).</li>
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<li>Klimke, W. A., Frost, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+role+of+the+transfer+gene%2C+traN%2C+of+the+F+and+R100-1+plasmids+in+mating+pair+stabilization+during+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation.</a> J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).</li>
<li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas%3A+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).</li>
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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

접합 공정은 박테리아와 같은 항생제 내성 마커의 확산 등의 어려운 환경에서 성장을 위해 진화하는 장점을 제공하는 유전자를 확산 할 수있는 수단을 제공한다. 공역 플라스미드 많은 너무 크기 때문에, 공역 플라스미드 자체의 표적 유전자의 돌연변이를 통해 전송 장치의 조립에 관여하는 단백질의 기능 연구 12 다루기이다. 본원에 설명 된 프로토콜을 하나 더 쉽게 더 작고 관리 발현 플라스미드 (도 1)를 사용하여 관심 대상 유전자를 평가할 수있는 수단을 제공한다. 우리는 F 플라스미드 매개 활용을 연구하는 F 플라스미드 유도체 pOX38-TC (표 1) 사용; 다른 공역 플라스미드는 여기에 설명 된 프로토콜과 해당 파생 플라스미드를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 설명 된 상대 분석은 일부 modificati와 프로스트와 동료, (42)에서 채택 된기능. 이전 연구에서, pOX38-TC Δgene :: 형상 구조체의 8,33,...

미세 유기체의 수준에서의 유전자 및 단백질의 전사는 박테리아의 생존과 발전뿐만 아니라 감염 과정에서 중요한 역할을한다. 박테리아 사이 또는 박테리아 및 세포 간 DNA의 교환은 변형, 결합, 벡터 전달을 통해 달성 될 수있다. 1,2- 활용은 대장균 등의 그람 음성균 간의 접합시 점에서 변환 및 전달에 비해 독특 DNA의 전사는 복합 고분자 시스템 공여자와 전지를 연결함으로써 도너 - 제어 방식으로 발생한다. 활용은 박테리아 세포는 호스트 시스템에서 유전자, 단백질 또는 화학 물질을 주입하는 숙주 세포와 상호 작용하는 가장 직접적인 방법입니다. 3 종종, 이러한 에이전트의 전송은 진화와 적응을 호스팅하는 기전과 발암에 이르기까지 호스트에 놀라운 효과를 가지고있다. 그것은 그 공역 recombinatio을 보였다n은 환경 스트레스 조건에서 높은 돌연변이 속도와 박테리아에 적응 3 배의 속도를 증가시킨다. (4) 또한, 접합은 균주의 항생제 내성 유전자가 확산되는을 통해 지금까지 가장 일반적인 경로입니다. 5,6 미생물 세포막 전체 거대 분자의 전달을 지원하기 위해 특수 분비 시스템 진화; 설명 된 그람 음성 세균에서 분비 시스템 (TSSs)의 9 종류의 현재 위치 : T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS뿐만 아니라 초 (분비)과 문신이 (두 아르기닌 전위) 경로. 분비 시스템의 7,8 각 유형은 또한 다른 균주에 의한 단백질의 다양성과 관련된 경로의 특수성에, 다른 하위 유형으로 필요성을 분할된다. 예를 들어, 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)에있어서, Ti 및 CAG 시스템은 F-플라스미드 반면 이펙터 전송을 용이 R27 A를차 pKM101 T4SSs는 공역 플라스미드의 이동을 용이하게한다. 생물받는 사람이나 자신의 주변 환경과 휴대 내용을 자신의 구성 요소 단백질에서 각각 분비 시스템을 조립하고 공유하는 메커니즘의 7,9,10 자세한 이해는 병원성 미생물의 프로세스에 대처하기 위해 대상 전략의 개발에 중요한 요소이다 세포 감염. Lederberg 및 테이텀 (11)에 의한 대장균의 초기 식별 접합 다음 모바일 공역 플라스미드 다수 확인되고 특성화되었다. (12) 이러한 모바일 플라스미드 그러나 모든 모바일 플라스미드 전송 (기술 Orit)하여 플라스미드의 전송을 가능하게하는 근원을 인식하는 relaxase를 포함, 상당한 범위 (1에서 200 킬로베이스 (킬로바이트)로) 크기가 표시됩니다. 공역 기능 T4SS 조립 용 플라스미드를 더 인코딩 유전자뿐만 아니라, 형IV 결합 단백질. 도 12는 예를 들어 대장균 100킬로바이트 F 플라스미드 33.3 kB의 전송 (TRA) 영역 내의 모든 공역 유전자를 암호화한다. 13 쌍의 형성 (MPF), DNA 전송 및 제외 기능을 짝짓기 pilus 형성을 촉진 모든 단백질 공역 플라스미드 전송시 F 플라스미드 인코딩의 TRA 지역에서 유전자. 10,14,15 지식의 중요한 몸은 공역 T4SSs 사용할 수 있습니다, 그러나 단지 최근에 사용 가능한되고있다 공역 단백질 복합체의 구조 연구를 설명. 16-28 공역 처리의 광범위한 관점을 조립하기 위해, 전사 공역 단백질의 돌연변이를 분석하는 상세한 구조 연구의 결합이 필요하다. 이 공역 정합 분석을 통해 달성 될 수있다. 은 F 플라스미드를 들어, TRA 영역 내에 인코딩 각 단백질은 F-CO 매개하는 역할njugation; 따라서, 전달 유전자의 녹아웃 / 삭제 셀 (도 1)의 공역 용량을 폐지 할 것이다. 작은 이동 플라스미드는 F와 같은 큰 공역 플라스미드위한 표준 삭제 절차에 더 도움이되는 동안 표적 유전자는 하나의 별개의 항생제 내성 유전자를 전달로 치환되는 경우, 유전자 녹아웃보다 쉽게 ​​상동 재조합을 통해 달성된다. 현재의 프로토콜에서, 우리는 55킬로바이트 F 플라스미드 유도체 pOX38-TC의 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제 (CAT)와 관심 전사 유전자를 대체하는 상동 재조합을 사용; 29,30 얻어진 녹아웃 플라스미드 pOX38-TC Δgene :: 형상은 성장 배지에 클로람페니콜의 존재 (CM)로 저항을 용이하게한다. pOX38-TC Δgene :: CM 은닉 공여 세포는 결합 분석을 사용하여 관찰 공역 DNA 전달 / 결합에 영향을 줄 수 없다; pOX38-TC Δgene :: 형상 도너 셀의 결합 효율과 정상 RECIPient 더 자주, 폐지, 감소 또는 것입니다. pOX38-TC Δgene : CM 플라스미드의 공역 전송이 대상 전송 유전자를 품고 작은 복구 플라스미드를 통해 복원 할 수 있습니다. 이 복구 플라스미드는 플라스미드 pK184 (pK184 유전자), 31 또는 너무 오래 그 플라스미드가 제대로 셀 (세포질이나 주변 세포질) 내에서 올바른 위치에 유전자를 표적으로 유도 식을 제공 하나, 구성 적 발현을 제공 하나가 될 수 있습니다. 따라서,이 새로운 기증자 사이의 결합 분석에서 (pOX38-TC Δgene : CM + pK184 유전자 플라스미드를 은닉) 과받는 사람의 세포가 결합 효율은 거의 그 정상 기증자받는 사람 짝짓기 분석의 복원 것으로 예상된다. 이 시스템은 pK184 유전자 작 제물 (결실 또는 점 돌연변이)의 일련의 생성을 통해 기절 유전자의 기능을 검사하고 pOX38-TC Δgene :: 형상 은닉의 결합 용량을 복원하는 각 구조체의 능력을 테스트 한있게 기증자 세포에스.

<table><tbody><tr><td>GeneJet 플라스미드 미니 준비 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 젤 추출 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR 정제 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 부위 지정 돌연변이 유발 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>광범위한 DNA 사다리</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>큐벳은 1mm의 간격이 있습니다.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td> Final Concentrations</td></tr><tr><td>Chloramphenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>카나마이신 (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Nalidixic 산 (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>리팜피신(Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>테트라사이클린(Tc)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP912-100</td><td>10 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>스트렙토마이신(Sm)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP910-50</td><td>50 &마이크로; g/mL</td></tr></tbody></table>

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

박테리아 접합에 의한 유전 물질의 전달은 특정 전달 단백질에 의해 형성된 복합체를 통해 발생하는 과정입니다. 대장균(Escherichia coli)에서 이러한 전달 단백질은 짝짓기 쌍 형성(mating pair formation) 또는 DNA 전달 복합체(DNA transfer complex)로 알려진 DNA 전달 메커니즘을 구성하며, 이는 접합 플라스미드 전달을 촉진합니다. 이 논문의 목적은 짝짓기 분석법과 함께 일련의 결실 및/또는 점 돌연변이를 사용하여 접합에 관여하는 특정 전달 단백질의 역할을 결정하는 데 사용할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 타겟 유전자는 conjugative plasmid에서 knock out된 다음 타겟 유전자를 보유하고 있는 작은 회수 플라스미드를 사용하여 trans로 제공됩니다. 회수 플라스미드의 표적 유전자에 영향을 미치는 돌연변이는 돌연변이 유전자를 품고 있는 공여자 세포의 짝짓기 효율의 변화를 초래하는 표적 단백질의 기능적 측면에 대한 정보를 드러낼 수 있습니다. 짝짓기 효율의 변화는 접합 DNA 전달을 촉진하는 데 있어 특정 전달 단백질 또는 그 안의 영역의 역할과 중요성에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 짝짓기 분석을 상세한 3차원 구조 연구와 결합하면 접합 전달 단백질의 기능에 대한 포괄적인 이해를 제공할 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호 작용 영역을 식별하고 특성화하는 수단을 제공할 수 있습니다.

F 플라스미드 구동 접합 과정은 pilus 합성과 공역 DNA 전달을 용이하게하기 T4SS을 어셈블 F-플라스미드 TRA 영역 내에 전달 단백질을 포함하는 조정 방법이다. 단백질 트래픽 (GenBank 액 # BAA97961, UniProt ID P14497)을 공역 F-pilus 형성을 위해 필요합니다. 10,14,35 -이 촉매 CXXC 모티브가 없습니다 불구하고 37 단백질은 C 말단 티 오레 독신과 같은 도메인이 포함되어 있습니다. 그것은 그것의 N 말단 영역을 통해 TraH 단백질과 상호 작용하는 것으로 예상되었지만, 35,38, 39의 영역 밖의 많지 않음 37 단백질의 구조적 특징에 대해 알려져 있으며, 그 C 말단 도메인보다 동적 인 것으로 나타났다. 구조적인 연구와 관련하여 TRAF 단백질의 기능적 양상을 평가하기 위해,...

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

이 짝짓기 분석의 전반적인 목표는 기능적 유형 4 분비 복합체의 맥락에서 플라스미드 전달에 영향을 미치는 능력에 대한 conjugative transfer gene 내의 돌연변이의 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 박테리아 접합에서 기능적 유형 4 분비 시스템을 조립할 때 전달 단백질 간에 발생하는 단백질-단백질 상호 작용 영역을 식별하는 것과 같은 단백질 특정 질문을 할 수 있습니다. 이 기술에서는 큰 접합 플라스미드의 유전자가 상동 재조합에 의해 녹아웃됩니다.유전자 기능은 더 작은 플라스미드의 knock-out에 표적 유전자를 제공하여 평가합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 절차를 성공적으로 수행하기 위해 조직과 설정이 중요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 해석 가능한 결과를 얻으려면 적절한 실험 준비가 필요합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 분해된 pBAD33 플라스미드를 준비하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 각 다이제스트를 아가로스 젤에서 실행합니다. UV 캐비닛과 멸균 면도기를 사용하여 카테터 염기서열에 해당하는 2.8kg 베이스밴드를 젤에서 잘라냅니다.DNA의 UV 노출을 최소화하기 위해 신속하게 작업하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 잘라낸 겔 슬라이스에서 DNA를 추출합니다. 추출된 고양이 카세트를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 또는 PCR로 증폭한다.멸균 PCR 튜브에서 반응 혼합물을 준비합니다. 상동 재조합을 위해 타겟 유전자 염기서열과 상동적인 돌출부를 포함하는 프라이머를 사용합니다. 템플릿 DNA를 이중 증류수로 대체하는 것을 제외하고 동일한 구성 요소를 포함하는 음성 대조군을 설정합니다.또한 PCR 반응에서 효과가 입증된 템플릿 DNA와 프라이머를 사용하여 positive control을 설정합니다. 피펫팅으로 모든 반응 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 나열된 PCR 매개변수를 사용하여 추출된 고양이 카세트를 증폭합니다.각 반응에 대해 5마이크로리터만 사용하여 아가로스 젤 전기영동을 통해 올바른 증폭 크기를 확인할 수 있습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 앰플리콘을 정제합니다. 증폭된 cat cassette 300 nanogram을 50 microlitent DY330R cell에 첨가하여 pOX38-Tc plasmid를 얼음 위에 묻힙니다.위아래로 부드럽게 피펫팅하여 섞습니다. 변형되지 않은 pBAD33 플라스미드를 양성 대조군으로 사용하여 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 세포를 미리 냉각된 1mm 전기천공법 큐벳으로 옮깁니다.electroporator를 사용하여 1.8 킬로볼트에서 5.5 밀리초의 시간 상수로 셀을 전기천공합니다. 펄스를 가한 후 즉시 1ml의 SOC 매체로 세포를 희석하고 새 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 세포를 섭씨 32도에서 2시간 동안 배양합니다.다음으로, 각 샘플의 100 마이크로 리터를 밀리리터 테트라 사이클린 당 10 마이크로 그램 및 밀리리터 클로람 페니콜 당 20 마이크로 그램을 포함하는 한천 플레이트로 분취합니다. 멸균 스프레더를 사용하여 접시 위에 부분 표본을 펴 바릅니다. 접시를 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 거꾸로 배양합니다.다음 날, 성공적인 재조합 물질을 선택합니다. 세포에 도입된 고양이 카세트는 관심 유전자와 상동 재조합을 거쳐 pOX38-Tc 클로람페니콜 녹아웃 클론을 생성합니다. 300 나노그램의 pK184 유전자 또는 pK184 유전자 돌연변이 플라스미드를 이전과 같이 pOX38-Tc 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드를 보유한 50마이크로리터의 전기등성 DY330R 세포로 분리합니다.XK1200 공여체 세포를 생성하기 위해 접합 짝짓기를 수행한 후 전기천공법을 수행하여 XK1200 세포를 생성하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 클로람페니콜 녹아웃과 PK184 플라스미드를 모두 하포레이션합니다. 클로람페니콜 및 카나마이신이 함유된 20ml의 멸균 LB에서 이러한 XK1200 기증자 세포의 하룻밤 배양을 준비합니다. 또한 글리세롤 스톡 또는 ang 한천 플레이트의 단일 콜로니에서 추출한 세포를 사용하여 스트렙토마이신 1밀리리터당 50마이크로그램으로 50mL LB의 MC4100 수용 세포를 준비합니다.섭씨 37도에서 배양물을 성장시키고 200rpm으로 흔듭니다. 모든 공여자 세포에 최종 농도인 100밀리몰까지 포도당을 추가합니다. 다음 날, 각 하룻밤 배양에서 70분의 1을 동일한 항생제가 함유된 멸균 LB 2ml에 따로 희석합니다.200rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 중간 로그 단계로 세포를 성장시킵니다. 세포 배양을 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 항생제를 제거하기 위해 냉간 멸균 LB로 세포 펠릿을 한 번 씻습니다.이전과 같이 두 번째 원심분리 후 2ml의 저온 멸균 LB.In 복제에 세포를 현탁시키고 100마이크로리터의 기증자 세포와 100마이크로리터의 수혜자 세포를 총 1ml의 부피에 대해 800마이크로리터의 멸균 LB 배지로 분취합니다. 세포가 섭씨 37도에서 흔들리지 않고 1시간 동안 짝짓기를 하도록 합니다. 한 시간 후, 짝짓기 쌍을 방해하기 위해 30초 동안 세포를 소용돌이칩니다.그런 다음 더 이상의 짝짓기를 방지하기 위해 세포를 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 중간 로그 배양액과 신선한 멸균 LB를 사용하여 공여자 및 수혜자 세포를 1 및 100에서 1 및 1,000만 세포로 6회 연속 희석할 수 있습니다. 날라딕산(naladixic acid), 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 카나마이신(kanamycin)을 함유한 한천 플레이트의 두 반쪽 각각에서 XK1200 기증자 세포의 각 희석액에 대해 10마이크로리터 분취액을 찾아냅니다.스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 한천 플레이트에서 수용자 MC4100 세포의 희석액에 대해 스포팅을 반복합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 와류 혼합물과 신선한 멸균 LB를 사용하여 transconjugants의 6 가지 희석액을 준비합니다.pOX38-Tc chloramphenicol knock-out bu를 품고 있는 transconjugant MC4100 세포를 선택하여 스트렙토마이신과 클로람페니콜을 포함하는 한천 플레이트의 각 절반에서 각 희석액의 10마이크로리터 분취량을 발견합니다. 두 중복 혼합물 모두에 대해 반복합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.각 donor, recipient 및 transconjugants 세포에 대한 동일한 희석 spotting의 colony 수를 계산하여 짝짓기 효율성을 계산합니다. 또한, 주어진 희석액에서 수용자보다 더 많은 수의 transconjugants로 인한 편향을 테스트하기 위해 수용자 콜로니를 계산합니다. 짝짓기 효율을 transconjugant colonies의 수를 donor colony의 수로 나눈 값에 100을 곱하여 100개의 donor cells당 효율 값을 구하는 것으로 계산합니다.pOX38-Tc 플라스미드에서 4형 분비계 유전자-tra-F가 녹아웃되면 pOX38-Tc traF 클로람페니콜이 기증자에서 수용 세포로 플라스미드를 녹아웃합니다. 그러나, traF 유전자가 PK184 traF 플라스미드에 의해 트랜스에 제공될 때, pOX38-Tc traF 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드의 접합 전달의 회복이 관찰된다. 공여자 세포에서 traF 및 PK184 플라스미드의 희석 돌연변이와 함께 제공되면 pOX38-Tc traF 클로람페니콜 녹아웃 플라스미드의 접합 전달 손실이 관찰될 수 있습니다.Loss of conjugative transfer는 접합 유형 4 분비 시스템 내에서 단백질-단백질 상호 작용에 중요한 단백질의 영역을 나타냅니다. 그런 다음 이 영역은 전달 효율성에 영향을 미치는 점 돌연변이에 의해 더 자세히 조사할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 예상 성장 시간과 함께 하루 만에 수행할 수 있습니다.이 프로토콜은 여기에 설명된 셀 이외의 셀에서 수행할 수 있습니다. 이 시점에서 중요한 측면은 공여자와 수용자 세포가 관심 플라스미드를 가지고 있지 않다는 것입니다. 따라서 knock-out plasmid를 추가할 때 상충되는 결과를 얻지 않습니다.이 절차를 시도하는 동안 공여자, 수혜자 및 transconjugate 세포에 대한 다양한 성장 조건과 항생제가 있으므로 매우 체계적인 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 결정학, NMR 또는 질량 분석법과 같은 다른 방법을 수행하여 관심 단백질의 상세한 구조 및 기능 그림을 얻을 수 있습니다.

conjugative-mating-assays-for-sequence-specific-analysis-transfer

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

우리는 여기에서 황색 포도상 구균의 활용, 전달, 자연 변화의 체외 조사에 대한 세 가지 다른 프로토콜을 설명합니다.

수평 유전자 전달의 연구에 대한 방법론<em&gt; 황색 포도상 구균</em

우리가 활용 빈도, 얼마나 효율적으로 예측 하려면 높은 해상도에 차이 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 다양 한 세균성 conjugative DNA 요소 다른 조건 하에서 동작을 이해 하는 목표로, 기증자 박테리아 활용을 시작합니다.

세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

당사는 그람 음성 박테리아에 있는 포화 트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성하고 고처리량 시퀀싱을 위한 DNA 증폭기 라이브러리의 후속 준비를 생성하는 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리는 ESKAPE 병원체, 아신토박터 baumannii에초점을 맞추고 있지만,이 프로토콜은 그람 음성 유기체의 넓은 범위에 순종.

고처리량 시퀀싱을 위한 그람 음성 박테리아에 트랜스포슨 삽입 라이브러리 생성

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

이 원고에서는 세균 전사를 표적으로 하는 항균제의 전사 및 억제 활성을 기능적으로 검사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

여기에서는 비교적 짧은 시간 내에 나무 2차 줄기 조직에서 유전자 및 프로모터 구조의 중간에서 높은 처리량의 기능적 특성화를 용이하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 효율적이고 사용하기 쉬우며 다양한 나무 종에 널리 적용할 수 있습니다.

나무 형성 및 보조 스템 개발에 관여하는 유전자 및 발기인 유학을위한 유도 체세포 업종 분석 (ISSA)의 사용

배우세요 세균 접합에서 유전자 결실과 교배 분석을 이용한 단백질 상호작용 영역 분석 방법을. 이 기법은 미생물학 및 유전학 연구에서 유전자 기능을 평가하는 데 활용됩니다.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

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