Name: 마우스의 비디오 - oculography (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 마우스에서 비디오 안구측정법을 이용하여 안구 운동 성능과 운동 학습을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 정상, 약물 처리 또는 유전자 변형 마우스에 적용하여 운동 행동의 생리학을 탐구할 수 있습니다.

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우리는 친절하게 건강 연구 및 개발을위한 네덜란드기구 (MDJ, CDZ), 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (CDZ), NeuroBasic (CDZ)를 감사이 Beatrix Fonds (CDZ), SENSOPAC (CDZ), C7 (CDZ)하고 Prinses 의 재정적인 지원을위한 유럽 공동체의 CEREBNET (CDZ) 프로그램입니다.

1. 준비 다음 실험은 동물 실험에 대한 Duch 윤리위원회에 따라 실시되었다. <ol><li> 비디오 oculography 위해 쥐를 준비. 마우스의 눈 움직임을 측정하기 위해서는 마우스의 머리는 고정해야합니다. 따라서, 페데 스탈 건설은 마우스 두개골 (그림 1)에서 이루어집니다. <ol><li> 와 가스실에서 산소, isoflurane의 혼합물 (Rhodia Organique 파인 (주), 프랑스 isofluran 1-1.5 %)으로 마우스를 마취. 과도한 가스 청소한다. 코 콘을 통해 마취를 유지합니다. 발가락이 핀치를 통해 마취의 깊이를 확인합니다. </li><li> 항문 thermosensor의 사용과 손난로 (FHC, Bowdoinham, ME)에서 37 ° C에서 체온을 유지합니다. </li><li> 눈 연고 (duratears, Alcon, 벨기에)와 그들을 취재하여 눈을 보호합니다. 지느러미 두개골 모피를 면도하고, 스크럽과 betadin의 회전 외과 영역을 청소전자 또는 chlorhexidine 솔루션입니다. </li><li> 두개골의 지느러미 두개골 표면을 노출 중간 라인 절개를합니다. 표면이 깨끗하고 건조합니다. </li><li> bregma에서 람다의 두개골 지느러미 두개골 표면에, 인산 (커, CA 인의 산성 젤 에천트 37.5 %)의 방울을 적용합니다. 15초 후 에천트를 제거하고 두개골 표면이 다시 염분 및 건조와 함께 청소합니다. </li><li> 이 에칭처리된 두개골 표면 OptiBond 소수의 방울 (커, CA)와 30 초 동안 그것을 공기 건조의 상단에 적용합니다. </li><li> OptiBond 소수의 꼭대기에서 OptiBond 접착제 (커, CA)의 방울을 놓고 1 분 (맥시멈 480 가시 광선의 경화 장치, 헨리 Schein, 미국)의 빛으로 치료. </li><li> 카리스마 합성 (Heraeus Kulzer, 독일)의 얇은 층과 접착 층을 커버. 합성의 두 개의 연결된 너트 (지름 3mm) 포함시킵니다. 라이트와 합성 나중을 치료. 필요한 경우 복합의 추가 레이어를 적용하고 밝은 그들을 치료. </li><li> 광고수술 진통제에 대한 장관 buprenorphine (0.015 밀리그램 / kg, SC). 동물은 약 ​​5 분 이내에 힘으로 돌아갈 겁니다. 마우스 수술 후 최소 3 일간 상온에서 홈 새장에 복구하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 생쥐를위한 비디오-oculography 설정 (그림 2). <ol><li> restrainer에 마우스를 놓고 두 개의 나사 (그림 1)에 의해 restrainer로 머리를 고정시킨다. 마우스가이 절차에 대한 anesthetized 될 필요가 없습니다. 금지 시간은 1 시간 / 일 초과할 수 없습니다. </li><li> 나아가 턴테이블 (60cm 직경)에 따라 마운트되어 XY 플랫폼에서 마우스 머리 앤 바디 ​​restrainer를 탑재합니다. XY 플랫폼 사용 마우스 머리는 턴테이블의 중앙 위에 배치될 수 있습니다. 마우스는 피치, 편요각 및 롤 축 위에 이동할 수 있습니다. 마우스의 머리는 ISCAN syste에 의해 생성된 눈의 영상을 사용하여 시선을 정렬하여 정확한 피치, 편요각 및 롤 각도에 배치됩니다줄게. 양자 택일로, 페데 스탈 건설은 stereotactic 프레임 11에 마우스의 머리에 둘 수 있습니다. </li><li> 턴테이블은 AC 서보 제어 모터 (고조파 드라이브 AG, 네덜란드)와 ​​턴테이블의 위치에 붙어있다는 턴테이블 축에 부착된 전위 차계 (Bourns INC., CA)에 의해 모니터링된다. </li><li> 원통 주위의 화면 (지름 : 63cm, 높이 : 35 ㎝) 임의의 점선 패턴 (각 요소 2 °)와 함께 턴테이블을 커버,이 드럼은 또한 AC 서보 제어 모터 (고조파 드라이브 AG, 네덜란드)을 갖추고있다 . 원통형 스크린의 게재 순위는 축과 화면 할로겐 조명 (20 와트)에 의해 점등 수에 부착된 전위 차계 (Bourns INC., CA)에 의해 모니터링된다. 주변 스크린과 턴테이블 모두 독립적으로 구동됩니다. </li><li> 턴테이블과 주변 화면의 움직임은 I / O 인터페이스 (CED 제한, 캠브리지, 영국)에 연결된 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 고마워, I / O 인터페이스에 의해 디지털 처리되고이 컴퓨터에 저장 : 경과 주변 화면 위치 신호 (20 Hz에서 컷 - 오프 주파수) 필터링됩니다. </li><li> 마우스의 눈으로 세 적외선 방사체가 켜져있는 (600 MW, 분산 각도 : 7 °, 최대 파장 : 880 nm의, RS 부품, 네덜란드). 두 개의 적외선 방사체는 턴테이블에 고정되며 세 번째 방출은 카​​메라에 첨부되어 있습니다. 이 세 번째 에미터는 교정 절차를 수행하는 동안과 안구 운동 녹음시 사용되는 참조 각막 반사 (CR)를 생산하고 있습니다. </li><li> 줌 렌즈 (줌 6000 Navitar INC., NY)이 장착된 적외선 CCD 카메라는 턴테이블에 첨부되어 턴테이블의 중앙에 마우스 머리에 주력하고 있습니다. 카메라 보정 절차 동안 정확히 20 ° 이상의 잠금을 해제 할 수 있으며, 턴테이블의 축에 대해 yawed 수 있습니다. </li><li> 비디오 신호는 안구 추적 시스템 (ISCAN ETL-200, 벌링턴, MA)에 의해 처리됩니다. ISCAN 시스템은 뭔가를 사용하여학생 및 참조 CR의 센터를 추적할 rithm. 시스템은 120 Hz의 샘플 속도로 수평 및 수직 방향으로 학생과 참조 CR을 추적할 수 있습니다. </li><li> 참조 CR 위치, 동공 위치와 동공 크기의 신호는 I / O 인터페이스에 의해 디지털화되며 테이블과 주변의 화면 위치 신호와 같은 파일에 저장됩니다. 동영상 동공 추적 시스템은 약 27 MS의 안구 운동 신호의 지연을 유도합니다. </li></ol></li></ol> 2. 동영상 학생 추적을 사용하여 눈 움직임을 보정 및 측정 안구 추적 시스템 translational 모션으로 동공의 움직임을 캡처합니다. 추적 학생의 translational 움직임은 눈의 회전 중심과 안구 (각막 곡률 즉, 중심)의 해부 센터, 안구의 각도 회전에 의한 회전 성분 사이의 축방향 차이로 인해 translational 구성 요소를 포함하고 있습니다. 빼기으로학생 운동 / 위치에서 참조 CR을 접근한, 바람직하지 translational 성분은 안구의 회전에 의한 것입니다 translational 모션 그 결과 신호로부터 제거된다. 그들은 종종 아주 작은 있지만이 뺄셈도 머리와 카메라 사이의 번역을 없애줍니다. 잔여 절연 translational 운동은 다음과 같은 보정 방법 8,12에 의해 안구의 각도 회전으로 변환됩니다. 이 교정은 어떤 안구 운동 실험 이전에 수행되었다. <ol><li> 동공의 비디오 이미지가 모니터의 중간에 위치하고 참조 CR의 표현은되도록이면 직접 학생 위 안구의 수직 중간선에 위치하고있는 것을 같은 방법으로 카메라에 마우스 머리의 위치를​​ 조정합니다. 때문에 카메라 / 테이블 축을 통해 각막 곡률 중심을 배치하여 수행할 수 있습니다 각운 카메라 회전에 참조 CR의 움직임을 최소화합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 10 ° (즉, 20도에서 최대 피크) 턴테이블의 수직 축을 중심으로 - + / -로 카메라를 여러 번 회전합니다. (학생의 회전 반경을 계산하는 카메라 회전 극단적인 위치에 기록된 추적 동공 (P) 및 참조 CR의 위치를​​ 사용하여 RP; RP = Δ / 죄악 (20 °), Δ = (CR -P),) 그림 3A 참조하십시오. </li><li> RP 값이 동공 크기에 의존한다는 사실로 인해 동공 크기 보정 12 (그림 3B) 구현해야합니다. RP 관계를하고 RP 보정 곡선 (그림 3D)를 작성 - 동공의 크기를 결정하기 위해, (그림 3C 즉, 동공 크기를 조작) 다양한 조명 조건에서 2.2 여러 번 단계를 반복합니다. RP 가치도 수직 안구의 위치에 따라 달라집니다. 실험 수직 안구 운동을 일으킬 것입니다 그렇다면 수직 안구 위치에 대한 보정의 보정이 매우 추천입니다13. </li><li> 참조 CR 위치, P의 위치와 동공 크기를 측정하여 안구 (E)의 각도 위치를 결정합니다. 참조 CR 위치는 translational 무료 동공 위치를 생성 동공 위치에서 빼는됩니다. 동공 크기를 측정하여 RP 값이 RP 보정 곡선에서 추출 수와 E는 다음과 같은 수식을 사용하여 계산할 수 E = arcsin {(Δ1) / RP} (그림 4A, 어디 Δ1 = (P 2 - P 1) 및 P 1과 P 2) 참조 CR의 뺄셈에 의해 해결된다. </li><li> 턴테이블 및 / 또는 주변의 화면 회전의 대형 레퍼토리는 이제 oculomotor 시스템을 자극하는 데 사용할 수 있습니다. 어둠 속에서 비디오 oculography을 수행하기 위해서는 마우스 눈은 동공 팽창을 제한하고 이러한 상황에서 학생 추적을 허용하는 miotic 약물로 pretreated해야합니다. 우리의 실험에서 우리는 pilocarpine (4 %, 연구소 Chauvin, 프랑스)에서 동공 팽창을 제한하기 위해 사용어둠. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 눈 위치, 테이블 위치와 주변 스크린 순위는 모두 (2.4에서 그림 4B와 수식 참조) 각도 위치로 변환됩니다. 안구 신호 학생 추적 시스템의 이미징 처리에 의해 27 MS 유도들의 지연을 위해 수정하고 있습니다. </li><li> 눈, 테이블과 주변 스크린의 각도 위치는 차별 및 20 Hz의 주파수 해제 잘라내기를 사용 버터월스 로우 - 패스 필터로 걸러집니다. </li><li> Saccades는 40 ° / s의 탐지 임계값을 사용하여 안구 속도 신호에서 제거됩니다. 데이터가 감지 임계값을 건너 후 20 MS 80 이전까지 MS부터 제거됩니다. </li><li> 표, 주위의 화면과 눈의 속도 신호는 흔적 (그림 4C)에서 각각의 사이클을 사용하여 평균하고 있습니다. </li><li> 평균 신호는 적절한 기능을 장착하고 있습니다. 일반적으로 sinusoidal 속도 자극을 사용하여 평균하고 있습니다주기는 부비동이나 cosinus 함수 (그림 4C)가 장착되어있다. 단계는 눈의 속도와 경기 부양 속도의 차이 (온도)로 계산할 수 있습니다 반면 그런 이득은 경기 부양 속도로 안구 속도의 비율로 계산할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 뿐만 아니라 모터 학습 (보르 적응, OKR 각색) 비디오-oculography 다양한 oculomotor 공연의 형태를 (; :; 보르 시각적으로 향상된가 vestibulo - 안구 반사 VVOR vestibulo - 안구 반사 OKR 즉 optokinetic 반사) 조사하는 데 사용할 수 있습니다. OKR 시각적 피드백을 사용하여 저주파 방해 보상. OKR은 잘 조명 주변 화면 (동영상 1) 회전에 의해 유도된 수 있습니다. 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위 주위의 화면을 회전하면 optokinetic 시스템이 낮은 주파수 범위 THA에서보다 효율적인 보상 메커니즘입니다 방법을 보여줍니다N 높은 주파수 범위 (그림 5A). 보르는 vestibular 기관에서 신호를 사용하여 고주파 헤드의 움직임에 대한 보상. 보르은 (영화 2) 어둠 속에서 동물 (즉 턴테이블)를 회전하여 유도된 수 있습니다. 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위에서 턴테이블을 회전하면 (그림 5A) vestibulo-안구 시스템이 낮은 주파수 범위보다 높은 주파수 범위에서 보상 안구의 움직임을 생성하는보다 효율적인 방법을 보여줍니다 . 콘서트에서 optokinetic 및 vestibulo - 안구 시스템 행위는 이미지가 헤드 움직임의 광범위한 범위에서 망막에 안정 수납니다. 주변 화면이 잘 켜져있는 동안, 1.6 °의 진폭과 0.2 -1.0 Hz의 주파수 범위에서 턴테이블을 회전하면 (영화 3) 눈이 전체 주파수 범위 이상의 &quot;하이 게인&quot;보상 운동을 (그림 5A 생성 방법을 보여줍니다 ). 이 모든 이득과 산도성별 14 변형 15,16,17 차이가보고되었다지만 ASE 값은, 마우스를위한 전형입니다. 턴테이블 및 주변 화면이 이상의 독립적인 컨트롤은 우리 시각과 vestibular 정보 간의 불일치로 쥐를 직면 수 있습니다. 일치하지 않는 시각과 vestibular 정보의 장기와 균일한 노출 후 마우스 보르가 변경된 영상 입력 (; 영화 4 보르 적응)에 대한 보상으로 변경됩니다. 주변 화면 (1 Hz에서 1.6 °)로 (즉, 180 °) 단계의 턴테이블을 회전하면 보르 게인 (그림 5B)을 증가시킵니다. 보르 이득의 최대한의 변화는 한 시범 학습 패러다임을 사용할 때, 종종 30 분 후에 도달된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스 머리 앤 바디 restrainer의 도식 그리기. 마우스의 시신은 사용하고 구속되어35mm의 직경을 가진 플​​라스틱 원통형 튜브. 마우스의 머리는 두 개의 나사와 철제 막대에 마우스의 받침대를 연결하여 고정합니다. 철 막대 ambulation 동안 정상적인 피치에 마우스의 머리를 배치하기 위해 30 도의의 각도를 만듭니다. * 두 개의 너트를 포함한 받침대 위에 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 비디오 oculography 설정의 도식 그림. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig3.jpg" /> 그림 3. 동영상을 학생 추적 시스템의 보정. 10 ° (즉, 최대 20도 피크) 턴테이블의 수직 축을 중심으로 -) 카메라는 + / -에 의해 회전을 여러 번있다. 추적 동공 (P) 및 카메라 회전 극단적인 위치에 기록된 참조 각막 반사 (CR)은 학생의 회전 반경을 계산하는 데 사용됩니다(RP). B) 동공 직경의 반경은 동공의 크기에 따라 달라집니다. C) 예 (두 픽셀 (픽셀 단위로 측정)) 보정 절차 동안 동공 순위에 동공 크기의 효과를 보여주고 있습니다. D) RP와 동공 직경 사이의 관계는 한 번의 마우스로 측정. 열세 가지 동공 지름은 주변 빛의 강도를 변경하여 수행되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig4.jpg" /> 그림 4. 측정 및 동영상 동공 추적을 사용하여 안구의 움직임을 분석. CR 위치에 대해 수정);) 각도 동공 위치가 학생의 반경 (RP)과 학생의 위치 (P로부터 계산됩니다. B) 보상 안구 운동의 예 vestibular 및 영상 시스템 (시각 향상된 보르)을 자극하여 유도된. 주변 화면이 잘 켜지지 동안 턴테이블은 1.6 °의 진폭과 0.6 Hz에서에서 회전 sinusoidally했습니다. C) 녹음의 분석) B에 표시됩니다. 그래프 턴테이블 (파란색)과 동공 (적색)의 평균 속도 추적을 보여줍니다. 이러한 평균 추적은 sinusoidal 함수 (검정)과 함께 장착했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3971/3971fig5.jpg" /> 그림 5. 성능 하나 C57Bl6 마우스로 측정 oculomotor 시스템을 학습. (vestibulo - 안구 반사 어둠 속에서 마우스를 회전하여 OKR, 상단 패널) : 보르, 중 판넬) 및 (시각 빛 가운데 마우스를 회전하여) 안구의 움직임은 주변 화면 회전 (optokinetic 반사에 의해 생성되는 강화된 vestibulo - 안구 반사 : 0.2에서 1.6 °의 진폭에서 1.0 Hz에서에 이르기까지 다양한 주파수와 VVOR, 하단 패널). 반사의 이득은 경기 부양 속도로 안구 속도의 비율 (왼쪽 패널)와 반사의 단계로 계산되었다 눈의 속도와 경기 부양 속도 (오른쪽 패널) 사이의 위상 차이로부터 계산되었다. B) 모터 학습하여 수행되었다<html> adaptively 위상 교육 패러다임의 아웃을 사용 보르도 증가합니다. 마우스는 마우스의 회전 마흔 분 동안 주변 스크린 (1.0 Hz에서 1.6 °의 회전 모두)의 회전과 상 (180 °) 떨어 졌있는 visuovestibular 교육 패러다임의 대상이었다. 10 분마다 보르는 (1.0 Hz에서 1.6 °) 테스트되었습니다. 이 마우스에는 위상 연수 밖 보르 게인을 증가했다. 영화 1. 생쥐에서 OKR을 유도 패러다임을 보여주는 애니메이션은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie1.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화 2. 생쥐에서 보르을 유도 패러다임을 보여주는 애니메이션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie2.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 생쥐의 VVOR을 유도 패러다임을 보여주는 영화 3. 애니메이션..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. 영화 4. 생쥐의 보르 적응 (증가)를 유도 위상 교육 패러다임의 visuovestibular 밖을 보여주는 애니메이션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3971/3971movie4.mov" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

생쥐에서 고품질의 비디오 안구 운동 녹음을 얻기 위해서는 몇 가지 요구 사항이 필요합니다. 교정 절차는 위에서 언급한 표준 물질로 진행해야합니다. 예를 들어 중심을 벗어난 교정은 학생이 교정 절차를 수행하는 동안 참조 CR과 수직 중간선에 위치하지 않는 경우, 라인란트의 싼 견적 및 안구 운동의 결과적으로 과대 평가가 발생합니다. 매우 안정 동공의 크기를 보여 시도는 매우 드문이기 때문에 더욱이, 우리는 교정 절차 12 동공 크기의 보정 방법을 통합하는 것이 좋습니다. 재판 도중에도 작은 스트레스는 이미 크게 동공 직경을 변경할 수 있습니다. 안구 운동 실험을 설계할 때 다음과 같은 요소들은 안구 운동 응답에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에 고려 또는 조절이 가능해야합니다 나이 13,18, 성별 14 변형 15,16을, 19. 동공과 홍채 사이의 대조가 BALB / C 마우스에서처럼 너무 낮은 경우 동공 탐지 및 추적이 불가능하기 때문에 또한, 실험 동물 색소 붓꽃이 있어야합니다. 매우 긴장하거나 불안한 동물 실험 세트까지하고 억제된 상태 익숙해 사전 실험로 훈련해야합니다. 이 동물은 눈이 덜 폐쇄 혹은 반 폐쇄의 절차 결과 처리 및 실험 도중 눈 체액의 생성을 방지하고 결과적으로 더 나은 학생 추적이 수행됩니다. 마지막으로, 수집하고 데이터를 분석하는 것은 동물마다 두세 시간 전에 필요합니다. 따라서 안구 운동 레코딩 가능성이 선택한 마우스에 적용하여 높은 처리량 선별 검사로서 적합하지 않다 특정 절차 유지됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Rhodia Organique 파인 (주) </td><td></td></tr><tr><td> 생리대 </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 </td></tr><tr><td> Duratears </td><td> Alcon </td><td></td></tr><tr><td> 인산 겔 </td><td> 커 </td><td> 31,297 </td></tr><tr><td> Optibond 프라임 </td><td> 커 </td><td> 35,369 </td></tr><tr><td> Optibond 접착제 </td><td> 커 </td><td> 35,369 </td></tr><tr><td> 카리스마 복합 </td><td> Heraeus Kulzer </td><td></td></tr><tr><td> 맥시멈 480 광 경화 장치 </td><td> 헨리 Schein </td><td></td></tr><tr><td> AC 서보 모터 제어 </td><td> 고조파 드라이브 AG </td><td></td></tr><tr><td> Cylindric 화면 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 할로겐 라이트 (20 승) </td><td> RS 컴포넌트 </td><td></td></tr><tr><td> Potentiometers (정밀) </td><td> Bourns INC. </td><td> 6574 </td></tr><tr><td> 파워 1401 (I / O 인터페이스) </td><td> CED 제한 </td><td></td></tr><tr><td> 컴퓨터 </td><td> 작은 골짜기 </td><td></td></tr><tr><td> 적외선 emmitters </td><td> RS 컴포넌트 </td><td> 195-451 </td></tr><tr><td> ETL-200 </td><td> ISCAN </td><td></td></tr><tr><td> 줌 렌즈 (줌 6,000) </td><td> Navitar INC. </td><td></td></tr><tr><td> Pilocarpinenitrate (minims) </td><td> Laboratoire Chauvin </td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 비디오 - oculography

Video-oculography in Mice

안구의 움직임은 객체를 추적하거나 운동하는 동안 망막에 이미지를 안정화하기 위해 매우 중요하다. 같은 마우스와 같은 fovea없는 동물은, 대상에 자신의 눈을 주시하는 제한된 능력을 가지고. 이러한 목표 감독 안구의 움직임와는 달리, 보상 안구 안구의 움직임을 쉽게 afoveate 동물 1,2,3,4에 elicited있다. 보상 안구 움직임은 눈의 근육을 운전하는 명령 신호로 vestibular 및 optokinetic 정보 처리에 의해 생성됩니다. vestibular 및 optokinetic 정보의 처리는 oculomotor 시스템 적자의 사양을 수 있도록 별도로 함께 조사 할 수 있습니다. oculomotor 시스템 optokinetic 반사 (OKR), vestibulo - 안구 반사 (보르) 또는 시각적으로 향상된 vestibulo - 안구 반사 (VVOR)을 evoking하여 테​​스트 할 수 있습니다. 보르는 반사적 눈 미터 반면 OKR은 망막에서 &quot;전체 필드&quot;이미지의 움직임에 대한 보상 반사 운동이다머리의 움직임을 보상 ovement. VVOR는 적절한 보상을 만들뿐만 optokinetic 정보 등 모두 vestibular를 사용하여 반사 안구 운동입니다. 소뇌는 모니터링하고 이러한 보상 안구의 움직임을 조정할 수 있습니다. 따라서 oculography뿐만 아니라 병적인 조건 (vestibular, 안구 및 / 또는 소뇌 원산지 FE)에서 정상 아래 뇌 - 행동의 관계를 조사하기위한 매우 강력한 도구입니다. oculomotor 시스템을 테스트, 행동 패러다임으로서, 여러 가지 이유가 흥미롭습니다. 첫째, oculomotor 시스템은 잘 이해 신경 시스템 5. 둘째, oculomotor 시스템은 상대적으로 간단한 여섯이다; 가능한 안구 운동의 금액은 그 공 - 인 - 소켓 아키텍처 ( &quot;단일 공동&quot;)과 엑스트라 안구 근육 7 삼쌍에 의해 제한됩니다. 셋째, 행동 출력과 감각 입력을 쉽게 정량이 높은 접근 시스템을지게하고, 측정 가능분석 8. 많은 행동 검사 양적 능력이 높은 수준의 부족합니다. 그리고 마지막으로, oculomotor 시스템의 양쪽 성능뿐만 아니라 소성가있게 테스트할 수 학습과 기억 과정 9 일 연구. 유전자 변형 생쥐는 최근 널리 사용할 수 있으며 그들은 다양한 수준의 10시 뇌 기능의 탐사를위한 중요한 원천을 형성하고 있습니다. 또한, 그들은 모델이 인간의 질병을 모방하는 데으로 사용할 수 있습니다. 정상에 oculography 적용 pharmacologically - 치료 또는 유전자 변형 생쥐 것은 정상과 병적인 조건에서 모터 행동의 기본 생리를 탐험하기 위해 강력한 연구 도구입니다. 여기서는 쥐를 8 비디오 oculography을 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

비디오 - oculography 아주 양적 안구 모터의 성능을 조사하는 방법뿐만 아니라 모터 학습입니다. 여기서는 생쥐에서 비디오 oculography을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 정상에서이 기술을 적용 pharmacologically - 치료 또는 유전자 변형 생쥐 것은 모터 행동의 기본 생리를 탐험하기 위해 강력한 연구 도구입니다.

안구 운동은 물체를 추적하거나 움직이는 동안 망막에 맺히는 영상을 안정화하는 데 매우 중요합니다. 중심와(fovea)가 없는 동물, 예를 들어...

본 절차의 전체적인 목표는 마우스에서 비디오 안구 기록술(video o iconography)을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 마우스의 두개골에 페데스탈 구조물을 장착하여, 특수 헤드 바디 구속 장치에 머리를 고정할 수 있게 함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 마우스를 비디오 안구 설정 장치에 배치하고 비디오 동공 추적 시스템을 보정하는 것입니다.다음으로, 다양하고 광범위한 전정 및 시각 운동 자극을 사용하여 안구 운동계를 활성화하는 동안 안구 운동을 기록합니다. 마지막 단계는 이러한 안구 운동을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 정상, 약물 처리 또는 유전자 변형 마우스를 대상으로 한 비디오 안구 기록법(video iconography)을 통해 운동 행동의 생리학적 특성을 탐구할 수 있습니다.이 방법은 안구 운동계에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 인간의 병리적 상태를 모방한 마우스 돌연변이체를 사용하여 소뇌, 전정기관 또는 안구 유래 질환을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, isof, fluorine 및 산소 혼합물이 담긴 가스 챔버에서 마우스를 마취하십시오. 그 후 마스크를 통해 가스를 공급하여 마취 상태를 유지하십시오.다음으로, 가열 패드와 항문 온도 센서를 사용하여 마우스의 체온을 37 °C로 유지합니다. 이어서, 안구 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포하고, 두개골 등쪽의 털을 깎은 후 수술 부위를 세척합니다. 그 후, 정중선 절개를 통해 두개골의 등쪽 표면을 노출시키고, 해당 표면을 세척 및 건조합니다.그런 다음 bgma에서 인산을 Lambda에 한 방울 적용합니다. 15초 후, 식각제를 제거한 다음 생리식염수로 두개골 표면을 세척하고 다시 건조시킵니다. 식각된 두개골 표면 상단에 opti bond prime을 한 방울 적용하고 공기로 건조합니다.30초 동안 건조합니다. 다음으로, opti bond prime 위에 opti bond 접착제를 한 방울 도포합니다. UV 광선으로 1분 동안 경화시킵니다.그 후, 접착층을 얇은 charisma composite 층으로 덮습니다. 자석 나사 구멍과 부착 부위가 있는 커넥터를 composite 내에 매립합니다. 그런 다음 UV 광선으로 composite을 경화시킵니다.필요한 경우, 복합물을 추가 층으로 도포하고 광경화시킵니다. 수술 후 생쥐가 최소 3일 동안 회복하도록 합니다. 다음 단계는 생쥐를 구속 장치에 넣고 자석과 나사 하나로 머리를 고정하는 것이며, 생쥐 머리 및 몸체 구속 장치를 XY 플랫폼에 장착합니다.XY 플랫폼을 사용하여 마우스의 머리를 턴테이블 중심 위에 놓아 마우스가 피치 Ya 및 롤 축을 따라 이동할 수 있도록 합니다. 그런 다음 안구 스캔 시스템에서 생성된 안구 시각 영상을 이용하여 안구의 위치를 맞춤으로써 머리를 적절한 피치 ya 및 롤 각도로 배치합니다. 이제 턴테이블은 AC 서보 제어 모터에 연결됩니다.턴테이블의 위치는 턴테이블 축에 부착된 포텐쇼미터로 모니터링합니다. 턴테이블은 무작위 점 패턴이 있는 원통형 서라운드 스크린으로 덮여 있으며, 이 스크린에는 AC 서보 제어 모터가 장착되어 있습니다. 원통형 스크린의 위치는 해당 축에 부착된 포텐쇼미터로 모니터링합니다.화면은 할로겐 조명으로 밝힐 수 있습니다. 턴테이블과 주변 화면의 움직임은 입출력 인터페이스에 연결된 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 턴테이블과 주변 화면의 위치 신호는 20 hertz 차단 주파수로 필터링되어 입출력 인터페이스에 의해 디지털화된 후 해당 컴퓨터에 저장됩니다.마우스의 눈은 세 개의 적외선 방출기에 의해 조명됩니다. 두 개는 턴테이블에 고정되어 있으며, 세 번째 방출기는 카메라에 부착되어 있습니다. 이 세 번째 방출기는 기준 각막 반사광을 생성하며, 이는 캘리브레이션 과정과 안구 운동 기록 중에 사용됩니다.줌 렌즈가 장착된 적외선 CCD 카메라를 턴테이블에 부착하고, 턴테이블 중심에 위치한 마우스의 머리에 초점을 맞춥니다. 카메라는 잠금을 해제하여 턴테이블 축을 따라 정확히 20도 범위 내에서 이동할 수 있습니다.보정 절차 동안, 비디오 신호는 안구 추적 시스템에 의해 처리되며, 이 시스템은 120 hertz의 샘플링 속도로 수평 및 수직 방향의 동공과 기준 각막 반사 지점을 추적할 수 있습니다. 그런 다음 기준 각막 반사 위치, 동공 위치 및 동공 크기 신호는 입출력 인터페이스에 의해 디지털화되어 안구 운동을 보정하기 위해 테이블 및 주변 화면 위치 신호와 동일한 파일에 저장됩니다. 쥐의 머리 위치를 카메라에 맞추어 동공의 비디오 이미지가 모니터 중앙에 위치하고, 기준 각막 반사의 표시가 동공 바로 위 안구의 수직 중앙선에 오도록 조정합니다.다음으로, 카메라를 수직 회전축을 중심으로 정점으로 20도씩 여러 번 이동시킵니다. 카메라의 양 끝 위치에서 기록된 추적된 동공 및 각막 기준점의 위치를 사용하여 동공 회전 반경을 계산합니다.동공 크기와 동공 회전 사이의 관계를 결정하기 위해 다양한 조명 조건에서 이 단계들을 여러 번 반복하십시오. 그 다음, 동공 회전 보정 곡선을 작성하십시오. 이제 각막 기준 위치, 동공 위치 및 동공 크기를 측정하여 눈의 각도 위치를 계산하십시오.동공 회전 값은 동공의 회전 보정 곡선에서 추출할 수 있으며, 안구의 각도 위치는 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 여기서는 VVOR 안구 운동 실험을 시연합니다. 이제 안구 위치, 테이블 위치 및 주변 화면 위치를 각도 위치로 변환하십시오.다음으로, 버터워스 저역 통과 필터(Butterworth Lowpass filter)를 사용하여 안구 테이블과 주변 스크린의 각도 위치를 미분하고 필터링합니다. 20 Hz의 차단 주파수를 사용하여, 40 degrees per second의 검출 임계값으로 안구 속도 신호에서 이차 성분을 제거합니다. 그 후, 시도 내의 각 개별 주기를 사용하여 테이블 및 안구 속도 신호를 평균화하고, 평균화된 신호를 적절한 함수로 피팅합니다.일반적으로 정현파 속도 자극이 사용되며, 평균 주기는 사인 또는 코사인 함수로 피팅됩니다. 이 영상은 주변 화면의 회전을 통해 안구 운동이 어떻게 생성되어 시각운동 반사를 유도하는지 보여주며, 주변 화면을 0.2에서 1 Hz의 주파수 범위와 1.6도의 진폭으로 회전시킵니다. 마우스의 시각운동 체계는 고주파 범위보다 저주파 범위에서 더 효율적인 것으로 나타납니다.안구 운동이 어떻게 생성되는지를 보여주는 또 다른 영상입니다. 0.2에서 1Hz의 주파수 범위와 1.6도의 진폭으로 턴테이블을 회전시켜 어둠 속에서 마우스의 전정안반사를 유도하며 회전시킵니다. 마우스의 전정안반사 시스템은 저주파수 범위보다 고주파수 범위에서 더 효율적인 것으로 나타납니다.여기서는 주변 스크린이 충분히 조명된 상태에서 0.2에서 1Hz의 주파수 범위와 1.6도의 진폭으로 턴테이블을 회전시켜 시각적으로 강화된 전정안반사(vestibular ocular reflex)를 유도함으로써, 마우스의 회전을 통해 안구 운동이 어떻게 생성되는지를 보여주는 또 다른 영상이 있습니다. 이 마우스는 전체 주파수 범위에서 효율적인 보상 안구 운동을 생성하는 것으로 나타납니다. 그리고 이 영상은 전정안반사를 적응적으로 증가시켜 운동 학습이 어떻게 이루어졌는지를 보여줍니다. 위상차 훈련 패러다임을 사용하여 주변 스크린과 위상이 다르게 턴테이블을 회전시키면, 이 마우스의 VOR 이득(gain)이 증가합니다.이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 비디오 안구 검사를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 형질전환 마우스 배아의 안구 운동 절편의 생체 외 배양 및 이미징을 보여줍니다. 배아는 분리되어 아가로스에 박혀 있습니다. 비브라톰을 사용하여 안구 운동 핵과 눈을 포함하는 절편을 얻습니다. 슬라이스는 배양에서 유지되고 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다.

Transgenic Mouse Embryos의 안구 운동 절편의 Ex Vivo Culture and Imaging of Oculomotor Embryos

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Bosco, A., et al. In vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma(신경 퇴행 중 망막 미세아교세포 활성화의 생체 내 역학: 마우스 녹내장의 컨포칼 안과 영상 및 세포 형태 측정).   J. Vis. 특급 (2015년) 이 비디오는 녹내장의 마우스 모델에서 망막 미세아교세포의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 형광 단백질 발현 망막 미세아교세포를 가진 형질전환 마우스가 검안경 아래에 위치합니다. 적외선 조명은 시신경두(ONH)를 찾는 데 사용되며, 초점면은 망막 혈관을 랜드마크로 사용하여 설정됩니다. 그런 다음 형광 미세아교세포를 시각화하기 위해 형광 이미징을 사용합니다. 세포체가 커지고 분지 복잡성이 감소하는 것을 특징으로 하는 활성화된 미세아교세포를...

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

출처: Jagodzinska, J., et. al., Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. 특급. (2017) &lt;br /&gt; 이 비디오에서는 SD-OCT(spectral-domain optical coherence tomography)를 사용하여 망막층을 이미지화하고 시신경병증이 있는 유전자 변형 마우스 모델의 구조적 변화를 평가하는 방법을 보여줍니다.

광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography)을 사용한 마우스 망막의 In vivo 이미징

Intravital 현미경 검사는 동물에서 망막 혈관 직경, 혈류 속도 및 총 망막 혈류를 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

생쥐의 망막 혈류에 대한 Intravital Video Microscopy 측정

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

이 원고는 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월)와 마우스 망막의 비보에 이미징에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 몇 가지 검색 및 측정 방법 설명 peripapillary 지역에서 망막 신경 절 세포 (RGC)에 초점을 맞추고.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

제시 프로토콜 장기 학습을 공부 하기 위한 실험에 대 한 영구적인 감각 충돌을 생성 합니다. 영구적으로 그들의 머리에 고정된 장치를 입고, 쥐 집 연습장에서 자유롭게 이동 하면서 시각과 vestibular 입력 사이 감각 불일치에 지속적으로 노출 됩니다.

자유롭게 행동 하는 쥐에 장기 감각 충돌

본 프로토콜은 in vivo 이미지에서 관찰된 망막 신경절 세포 축삭 다발 형태를 검증하기 위한 목적으로 in vivo 가시광선 광간섭 단층 촬영 fibergraphy(vis-OCTF) 이미지를 동일한 마우스 망막의 ex vivo 공초점 이미지와 정렬하는 단계를 설명합니다.

Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)

여기에서는 광동태 반사를 정량화하기 위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 가상 드럼 자극과 비디오 안구 촬영을 결합하여 동작의 특징 선택성과 적응 가소성을 정확하게 평가할 수 있습니다.

생쥐에서 광동태 반사의 시각적 특징 선택성 정량화

배우세요 마우스에서 비디오 안구측정법을 이용하여 안구 운동 성능과 운동 학습을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 정상, 약물 처리 또는 유전자 변형 마우스에 적용하여 운동 행동의 생리학을 탐구할 수 있습니다.

마우스의 비디오 - oculography

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