T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

이 절차의 전반적인 목표는 유도 만능 줄기 세포 또는 IPS 세포에서 T 림프구를 생성하고 특성화하는 것입니다. 그런 다음 IPS 세포는 OP nine DL one 배양 시스템에서 시험관내에서 분화한 다음 헝겊 결핍 마우스에서 생체 내에서 성숙시킬 수 있습니다. 또는 OT one TCR을 과도하게 발현하도록 세포를 유전적으로 조작한 다음 in vivo 발달을 위해 채택하여 전달할 수 있습니다.

6주간의 생체 내 분화 후, EEG 7개의 종양 세포를 복강내 주사로 마우스에 투여할 수 있으며, 그런 다음 IPS 유래 T 세포의 항원 특이성을 평가할 수 있습니다. 궁극적으로 IPS 세포는 기존 T 세포와 항원 특이적 T 세포로 분화할 수 있으며, 후자는 종양 도전으로부터 동물을 보호할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 암 면역 요법의 개별화로 확장됩니다.

이 방법은 환자의 혈액 또는 피부 조직의 최소량에서 파생된 많은 수의 종양 반응성 T 세포의 생성을 허용하며, 0일차에 4번째 IPS 세포를 5배 10배로 5회 전달하여 5일째에 20%FBS 알파 MEM 배지에서 1개의 세포 단층을 포함하는 100mm 배양 접시에 넣고, 트립신 눈. 그런 다음 OP 9의 단층을 포함하는 새로운 100mm 접시에 신선한 100mm 배양 접시와 30분 동안 배양하고 37도 배양기 플레이트에서 20% FBS 알파, MEM 배지 및 마우스 플랫 3 리간드의 부동 세포의 5배 10에서 5배로 배양한 후 세포를 원심분리합니다. 8일째에 DL one 세포는 느슨하게 부착된 세포를 부드럽게 피펫으로 내리고 세포를 원심분리한 다음 세포를 confluent OP nine DL one cell로 코팅된 6웰 배양판의 단일 웰로 옮깁니다. 22일째에 2주 동안 섭씨 37도, 5% 이산화탄소에서 세포를 배양합니다.

분리된 IPS 세포를 섭씨 37도의 새로운 배양 접시에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 부유 세포의 약 절반을 제거하고 70미크론 나일론 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리를 배제하고 생성된 단일 세포 현탁액을 차가운 PBS로 세 번 세척합니다. 세 번째 세척 후, PBS의 세포를 밀리리터당 7번째 세포의 1.5배의 10배로 재현탁시키고 IV 주입 전에 세포를 얼음 위에 유지합니다.

4주 된 헝겊 결핍 쥐를 적외선 아래에 놓고 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 그런 다음 26 및 26 게이지 반의 바늘이 장착된 1ml 주사기에 200마이크로리터의 세포 현탁액을 채우고 팽창된 꼬리 정맥을 통해 세포를 채택적으로 전달합니다. 입양으로 이식된 마우스의 안락사를 확인한 후 3주 후, 조직을 기계적으로 분해한 후 림프절과 비장을 제거합니다.

단일 세포 현탁액을 CK 용해 완충액으로 라이싱한 다음 생성된 단핵 세포를 차가운 PBS에서 두 번 세척합니다. 그런 다음 세포 표면 마커를 염색한 후 0일차에 유세포 분석으로 세포를 평가하고, 유전자 JAMA 트랜스펙션 시약을 사용하여 1일차에 OT 1 MIDR로 하룻밤 동안 도금된 플레이트 E 패키징 세포를 6개의 IPS 세포에 10배로 2일차에 0.1% 젤라틴 사전 코딩된 24웰 플레이트의 1웰로 트랜스펙션합니다. Plat E 세포에서 S natin을 함유한 유사 바이러스를 채취한 다음 0.4미크론 필터를 통과시켜 원심분리 후 잠재적인 오염 물질을 배제합니다. 섭씨 32도에서 330배 G로 1시간 동안 폴리 브레인의 면전에서 세포를 형질감염시킵니다.

형질도입 절차를 반복한 후 동일한 온도에서 밤새 배양합니다. 트립신은 4일째에 형질도입된 IPS 세포를 관찰한 다음 펠릿화 후 세포를 재생하여 세포를 신선한 배지에 현탁시키고 사전 코딩된 방사선 조사된 snl 7 6 7 공급세포에 파종합니다. transduction된 세포가 con fluency에 도달하면 유세포 분석을 통해 GFP 및 DS red double positive cell을 분류합니다.

IPS 세포를 이식한 지 6주 후, 종양 챌린지 50일째에 동일한 마우스의 복막강에 50마이크로리터의 EEG 7개의 토마 세포를 주입합니다. mil E biotech CD 8 양성 T 세포 분리 키트를 사용하여 입양 이식 동물의 비장 및 림프절에서 CD 8 양성 T 세포를 분류합니다. 나이브 C 57 블랙 6 J 마우스에서 방사선 조사된 SPOC 크기의 분리된 CD 8 양성 T 세포를 1 대 10 비율로 혼합하고 40시간 동안 난자 mil당 0.5 마이크로몰로 공동 배양을 펄스합니다.

그 후, 펠든 A를 4시간 더 세포에 첨가합니다. 마지막으로, naive C 57 black six J mouse에서 SP cyte를 분리한 후 유세포 분석을 통해 세포 집단을 평가합니다. 세포 현탁액을 두 그룹으로 나눕니다.

CFSE 고농도 그룹에 CFSE 1mil당 5마이크로몰로 표시하고 난자 펩타이드 10마이크로그램으로 세포를 펄스하고, 0.5 MICROMOLES per mil CFSE로 A-C-F-S-E 낮음 그룹을 라벨링한 후 펄스하지 않습니다. 2.5 곱하기 10에서 여섯 번째, CFSE 높은 세포와 2.5 곱하기 10 여섯 번째, PBS의 CFSE 낮은 세포를 혼합합니다. 그런 다음 CFSE 발현을 위해 유세포 분석으로 cyte를 분석합니다.

관심 마우스로 이식한 입양 후 16시간 종양 챌린지 20일째에 복강내 종양 세포를 계산합니다. 18 및 18 게이지 반 바늘과 차가운 PBS가 장착된 10ml 주사기를 사용하여 복강을 세척합니다. 종양 침투 세포를 식별하기 위해 회수된 종양 세포를 계산합니다.

종양 챌린지의 후반 단계에서 종양을 제거한 다음 종양을 세 조각으로 자릅니다. 첫 번째 종양 조각을 냉동 바이알에 넣고 바이알을 드라이아이스에 놓습니다. 즉시 두 번째 포름 알데히드를 고정하십시오.

세 번째 조각은 냉동 보존된 조직 절편을 공기 건조한 후 컨디셔닝된 RPMI 1640 배지에 보존합니다. 15 분 동안 차가운 아세톤으로 고정하고 고정 부분을 15 분 동안 공기 건조 한 후 15 분 더 고정하십시오. 세탁 후 PBS에서 5분 동안 슬라이드를 세척합니다.

슬라이드를 습한 챔버에 놓고 조직 섹션을 30마이크로리터의 3%B, SA 및 PBS로 30분 동안 덮어 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 차단 완충액을 닦아내고 배양 종료 시 2시간 동안 축축한 챔버에서 PBS의 3% PSA로 희석된 pe anti tcr, RV alpha two 항체 및 fitzy anti ova 항체의 50마이크로리터 혼합물로 조직 절편을 배양합니다. 슬라이드를 차가운 물로 세 번 세척한 PBS는 마지막으로 종양 침투 T 세포의 유세포 분석을 위한 형광 현미경 검사 전에 수성 장착 매체로 절편을 장착합니다.

종양을 단세포 현탁액으로 뭉개십시오. 그런 다음 특정 표면 마커에 대한 셀을 분석합니다. C, CD 3 및 TCR beta는 노치 리간드 DL 1을 사용한 IPS 세포의 자극이 T 세포 CD 4 및 CD 8 세포 표면 발현에 기여할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 T 세포의 마커로 사용됩니다. CD 3 양성 TCR r 베타 양성 IPS 세포 유래 세포를 평가했습니다.

22일째 CD를 보여주는 오른쪽의 점도표는 시험관 내 IPS 세포에서 생성된 3개의 양성 TCR, R 베타 양성 CD 4개, 음성 CD 8개의 양성 단일 양성 T 세포를 보여줍니다. 또한, 앞의 그림에서 유래한 IPS 세포는 플레이트코팅된 anti CD 3 및 soluble anti CD 28 항체에 의해 시험관내에서 자극되었을 때 인터루킨 2와 인터페론 감마를 생성하여, IPS 세포 유래 T 세포가 수용 마우스로 채택된 이식 후 기능하는 것을 확인하였다. TCR 유전자 형질도입된 IPS 세포의 대다수는 CD 8 양성 CTL로 분화를 거쳤으며, 이 CTL은 풀링된 림프절과 비장 세포에서 이러한 점도표에서 인터루킨 2와 인터페론 감마를 분비하여 펩타이드 자극에 체외에서 반응했습니다.

CD 8 양성 V 베타 5 양성 T 세포를 TCR이 형질도입되었으나 대조군이 아닌 형질도입된 IPS 세포와 함께 양양으로 전달된 마우스에서 생성되었다. CD 8 양성 V 베타 5 양성 집단은 인터루킨 2 및 인터페론 감마 생성에 대한 세포 내 사이토카인 염색에 대해 양성이었으며, 이는 IPS 유래 CTL이 기능적임을 나타내는 음영 처리된 이소타입 대조군 히스토그램과 비교하여 어두운 선으로 이러한 히스토그램에서 나타났습니다. 이러한 데이터는 각 그래프에서 오른쪽의 피크로 표시되는 펩타이드로 펄스된 CFSE 고세포와 IPS 세포 이식 후 10주 또는 O OT 1개의 CTL 이식 후 1일 후에 마우스에 주입된 왼쪽의 피크로 표시되는 CFSE 저대조군 세포를 보여줍니다.

항원 특이적 IPS 유래 CTL은 항원 자극에 반응하고 여기에 CFSE 고세포가 없는 것으로 나타난 바와 같이 세포독성 활성을 가졌습니다. OT 1 TCR 유전자 형질도입 IPS 세포를 C 57 블랙 6 마우스에 채택하여 이식한 후, 20일째에 7개의 종양 세포를 EEG로 챌린지 실시한 후 복막강 내 종양 세포를 계수하였다. TCR TRANSDUCED IPS를 투여받은 마우스에서 대조군에 비해 종양 세포 수가 현저히 감소한 것을 주목하십시오.

가장 중요한 것은, TCR 형질도입 IPS 세포의 채택 이식은 과반응성 CTL의 종양 조직으로의 침투를 촉발하고 종양 챌린지로부터 동물을 보호한다는 것인데, 이는 종양 챌린지 후 30일에서 35일 사이에 회복된 종양 조직의 염색에서 볼 수 있듯이, TCR 형질도입 세포 또는 OT 1 CTL로 양양적으로 이식되었으나 모의 주입 또는 대조군은 아니었다. 형질도입된 세포는 여기에서 빨간색 화살표로 표시된 것처럼 염증성 세포에 의해 침투되었습니다. 빨간색의 난자 특이적 V 알파 2개의 양성 CTL이 녹색의 종양 조직을 발현하는 난자에 침투하는 것으로 밝혀졌습니다.

이 그림에서 대조군의 마우스에서 종양은 종양 침투 세포가 더 적거나 전혀 없었지만, CD 8 양성 모집단에서 게이팅 한 후 유세포 분석에 의해 V alpha 2 양성 및 V beta 5 양성의 발현에 대해 종양 조직의 단일 세포 현탁액을 분석했습니다. TCR Transduced IPS 세포로 양양으로 이식된 마우스의 종양 조직은 가장 높은 수준의 종양 침투 세포를 보인 반면, 대조군을 받은 마우스의 종양은 가장 높은 수준의 종양 침투 세포를 나타냈습니다. 형질도입된 IPS는 난자 특이적 CD 8개의 양성 T 세포에 의한 침투를 나타내지 않았습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 IPS 세포에서 항원 특이적 T 세포를 생성하는 방법과 IPS 유래 T 세포의 기능을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.