T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

이 실험 절차의 전반적인 목표는 유도만능줄기세포(IPS cells)로부터 T 림프구를 생성하고 특성을 분석하는 것입니다. IPS 세포는 in vitro에서 OP9 DL1 배양 시스템 상에서 분화시킨 후 rag 결핍 마우스 내에서 in vivo로 성숙시킬 수 있습니다. 또는 세포를 유전적으로 조작하여 OT-1 TCR을 과발현시킨 후, in vivo 발달을 위해 입양 전이할 수 있습니다.

6주간의 in vivo 분화 후, 마우스에 EEG seven 종양 세포를 복강 내 주사하여 챌린지하고, 이후 IPS 유래 T 세포의 항원 특이성을 평가할 수 있습니다. 결과적으로, IPS 세포는 일반 T 세포와 항원 특이적 T 세포 모두로 분화할 수 있으며, 후자는 종양 챌린지로부터 동물을 보호할 수 있습니다. 이 기술의 시사점은 개별 맞춤형 암 면역 요법으로 확장됩니다.

이 방법은 환자의 혈액이나 피부 조직의 최소량으로부터 대량의 종양 반응성 T 세포를 생성할 수 있게 합니다. 0일 차에 20% FBS alpha MEM 배지가 포함된 100mm 배양 접시의 합류된(confluent) OP9-DL1 세포 단층 위로 5×10⁴개의 iPS 세포를 이식합니다. 5일 차에 트립신 처리(trypsinize)합니다. 그 후, 신선한 100mm 배양 접시에서 37°C 인큐베이터 내에 30분간 배양한 뒤 세포를 원심 분리합니다. OP9-DL1 세포 단층이 포함된 새로운 100mm 접시에 20% FBS alpha MEM 배지 및 mouse Flt3 ligand와 함께 부유 세포 5×10⁵개를 분주합니다. 8일 차에 느슨하게 부착된 세포들을 조심스럽게 피펫팅하여 떼어낸 후, 세포를 원심 분리하고, 합류된 OP9-DL1 세포가 코팅된 6-웰 배양 플레이트의 단일 웰로 세포를 옮깁니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 2주 더 배양합니다. 22일 차에.

분리된 IPS 세포를 새로운 배양 접시에 담아 신선한 배지에서 37°C로 30분 동안 배양합니다. 그다음 부유 세포의 약 절반을 제거하여 70 µm 나일론 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리를 제거하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 3회 세척 후, 세포를 1.5 × 10⁷ cells/mL 농도의 PBS에 재현탁하고 IV 주사 전까지 얼음 위에서 보관합니다.

4주 된 rag 결핍 마우스를 적외선 조명 아래 두어 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 그런 다음 26.5 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 세포 현탁액 200 µL를 채우고, 확장된 꼬리 정맥을 통해 세포를 입양 전이시킵니다. 3주 후, 입양 전이된 마우스의 안락사를 확인한 다음, 조직을 기계적으로 분쇄하여 림프절과 비장을 제거합니다.

CK 용해 버퍼를 사용하여 단일 세포 현탁액을 용해시킨 후, 결과물인 단핵구를 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 그 다음 세포 표면 마커를 염색하고, 0일 차에 유세포 분석을 통해 세포를 평가합니다. 1일 차에는 JAMA transfection 시약을 사용하여 플레이팅된 plat E 패키징 세포에 OT one MIDR을 하룻밤 동안 형질전환시킵니다. 2일 차에는 0.1% 젤라틴으로 사전 코팅된 24웰 플레이트의 한 웰에 1×10⁶ 개의 iPS 세포를 분주합니다. plat E 세포로부터 S natin을 포함하는 슈도바이러스를 수집한 후, 원심분리 후 잠재적 오염 물질을 제거하기 위해 0.4 µm 필터에 통과시킵니다. polybrene 존재 하에 32 °C에서 330 ×g로 1시간 동안 세포를 형질도입합니다.

형질도입 절차를 반복한 후, 동일한 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 4일째에 트립신을 사용하여 형질도입된 IPS 세포를 떼어내고, 원심 분리 후 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁하여 미리 코팅된 방사선 조사 snl 7 6 7 피더 세포 위에 접종합니다. 형질도입된 세포가 합류 상태에 도달하면, 유세포 분석기를 사용하여 GFP와 DS red 이중 양성 세포를 분리합니다.

iPS 세포를 입양 전이시킨 6주 후, 종양 유도 50일째에 동일한 마우스의 복강 내로 50 µL의 EEG-7 thoma 세포를 주입합니다. Miltenyi Biotec의 CD8 positive T cell isolation kit를 사용하여 입양 전이된 동물의 비장과 림프절에서 CD8 positive T 세포를 분리합니다. 분리된 CD8 positive T 세포를 naive C57BL/6J 마우스 유래 방사선 조사된 SPOC 세포와 1:10 비율로 혼합하고, 0.5 µmol/mL의 OVA로 40시간 동안 공동 배양하여 자극합니다.

그 후, 세포에 felden A를 추가하여 4시간 동안 더 처리합니다. 마지막으로, naive C 57 black six J 마우스로부터 SP 세포를 분리한 후, 유세포 분석법으로 세포 집단을 평가합니다. 세포 현탁액을 두 그룹으로 나눕니다.

CFSE high 그룹에는 5 µM의 CFSE를 처리하여 라벨링하고, 10 µg/mL의 ova peptide로 1시간 동안 펄싱합니다. CFSE low 그룹에는 0.5 µM의 CFSE를 처리하여 라벨링하며, 펄싱은 수행하지 않습니다. PBS 내에서 2.5 × 10⁶개의 CFSE high 세포와 2.5 × 10⁶개의 CFSE low 세포를 혼합합니다. 그 후, 유세포 분석법을 통해 세포의 CFSE 발현을 분석합니다.

관심 마우스에 입양 이식을 수행한 16시간 후, 종양 챌린지 20일 차에 복강 내 종양 세포 수를 측정합니다. 18.5 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기와 차가운 PBS를 사용하여 복강을 세척합니다. 회수된 종양 세포를 계수하여 종양 침윤 세포를 확인합니다.

종양 유발 후기 단계에서 종양을 제거한 다음, 종양을 세 조각으로 나눕니다. 첫 번째 종양 조각을 크라이오 바이알에 넣고 바이알을 드라이아이스 위에 둡니다. 두 번째 조각은 즉시 포름알데히드로 고정합니다.

동결 보존된 조직 절편을 공기 건조시킨 후, 조건화된 RPMI 1640 배지에서 세 번째 조각을 보존하십시오. 고정된 절편을 다시 15분 동안 공기 건조시킨 후, 차가운 아세톤에서 15분 동안 고정하십시오. 세척 후 PBS에서 5분 동안 슬라이드를 세척하십시오.

슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 조직 절편에 3% B, SA 및 PBS 30 µL를 30분 동안 도포하여 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 블로킹 버퍼를 닦아내고, 3% PSA in PBS에 희석한 pe anti TCR RV alpha two 항체와 fitzy anti ova 항체의 혼합액 50 µL를 조직 절편에 처리하여 습윤 챔버에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 종료 후, 슬라이드를 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 마지막으로, 종양 침윤 T 세포의 유세포 분석을 위한 형광 현미경 관찰 전, 수성 마운팅 매질을 사용하여 절편을 마운팅합니다.

종양을 눌러 단일 세포 현탁액으로 만듭니다. 그 다음 세포의 특정 표면 마커를 분석합니다. T 세포의 마커로 CD3 및 TCR beta를 사용하며, notch 리간드 DL1을 이용한 iPS 세포의 자극이 T 세포 분화에 기여하는지 확인하기 위해 CD3 양성 TCR beta 양성 iPS 세포 유래 세포에서 CD4 및 CD8 세포 표면 발현을 평가했습니다.

오른쪽의 도트 플롯은 in vitro에서 iPS 세포로부터 생성된 22일차 CD3 양성 TCR $\beta$ 양성 CD4 음성 CD8 양성 단일 양성 T 세포를 보여줍니다. 또한, 이전 그림의 iPS 세포 유래 단일 양성 세포는 플레이트에 코팅된 anti-CD3 및 가용성 anti-CD28 항체로 in vitro에서 자극했을 때 interleukin 2와 interferon gamma를 생성하였으며, 이는 iPS 세포 유래 T 세포가 수여 마우스로의 입양 이식 후 기능적임을 확인시켜 줍니다. TCR 유전자가 도입된 iPS 세포의 대부분은 CD8 양성 CTL로 분화되었으며, 통합된 림프절 및 비장 세포의 이 도트 플롯에서 보듯이 펩타이드 자극에 대해 interleukin 2와 interferon gamma를 분비함으로써 in vitro에서 반응하였습니다.

TCR이 도입된 iPS 세포를 입양 이식한 마우스에서는 CD8+ Vβ5+ T 세포가 생성되었으나, 대조군 도입 iPS 세포를 이식한 마우스에서는 생성되지 않았습니다. CD8+ Vβ5+ 세포군은 인터루킨 2(interleukin 2) 및 인터페론 감마(interferon gamma) 생성에 대한 세포 내 사이토카인 염색에서 양성 반응을 보였으며, 이는 음영 처리된 이소타입 대조군 히스토그램과 비교하여 진한 선으로 표시된 히스토그램을 통해 iPS 유래 CTL이 기능적임을 나타냅니다. 이 데이터는 iPS 세포 이식 10주 후 또는 OT-I CTL 이식 1일 후에 마우스에 주입된, 각 그래프의 오른쪽 피크로 표시된 펩타이드 펄스 CFSE-high 세포와 왼쪽 피크로 표시된 CFSE-low 대조군 세포를 보여줍니다.

항원 특이적 IPS 유래 CTL은 항원 자극에 반응하였으며, 여기서 CFSE high 세포가 소실된 것으로 나타난 바와 같이 세포독성 활성을 보였습니다. OT-I TCR 유전자가 도입된 IPS 세포를 C57BL/6 마우스에 입양 이식한 후, EEG-7 종양 세포를 챌린지 하였으며, 20일째에 복강 내 종양 세포 수를 측정하였습니다. 대조군과 비교하여 TCR 유전자가 도입된 IPS를 투여받은 마우스에서 종양 세포 수가 유의미하게 감소했음에 주목하십시오.

가장 중요한 점은, TCR이 도입된 IPS 세포의 입양 전이는 과잉 반응하는 CTL의 종양 조직 내 침윤을 유도하였으며, 종양 유도 후 30~35일에 회수된 종양 조직의 H&E 염색 결과에서 알 수 있듯이 종양 유도로부터 동물을 보호했다는 것입니다. 이러한 결과는 TCR 도입 세포 또는 OT-I CTL을 입양 전이한 마우스에서는 나타났으나, mock 주입군이나 대조군에서는 나타나지 않았습니다. 여기서 빨간색 화살표로 표시된 바와 같이, 도입된 세포들 사이로 염증 세포들이 침윤되었습니다. 빨간색으로 표시된 Ova 특이적 Vα2 양성 CTL이 초록색으로 표시된 Ova 발현 종양 조직으로 침윤된 것을 확인할 수 있었습니다.

대조군 쥐의 종양에서는 이 그림에서 종양 침윤 세포가 적거나 없었으나, 종양 조직의 단일 세포 현탁액을 대상으로 CD8 양성 집단을 게이팅한 후 유세포 분석을 통해 V alpha two 양성 및 V beta five 양성 발현을 분석하였습니다. TCR이 도입된 iPS 세포를 입양 이식한 쥐의 종양 조직에서는 종양 침윤 세포 수준이 가장 높게 나타난 반면, 대조군 도입 iPS 세포를 이식받은 쥐의 종양에서는 ova 특이적 CD8 양성 T 세포의 침윤이 나타나지 않았음에 유의하십시오.

이 영상을 시청하고 나면, IPS 세포로부터 항원 특이적 T 세포를 생성하는 방법과 IPS 유래 T 세포의 기능을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.