Name: T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 배우세요 iPS 세포에서 T 림프구를 분화시키는 방법을 OP9 DL1 배양 시스템과 rag 결핍 마우스를 활용하여. 이 기술은 항원 특이적 T 세포를 생성하여 종양 면역치료에 활용할 수 있습니다.

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우리는 제공해 주셔서 박사 신야 야마 나카을 (교토 대학교) 감사 IPS를 MEF-잉-20D-17 세포주, OT1-2A을 지원하기위한 박사 다리오 Vignali (세인트 주드 어린이 연구 병원) • pMig II 만들어낸 박사 후안 카를로스 OP9-DL1 셀 라인을 지원하기위한 Zuniga-Pflucker (면역학학과, 토론토 대학), 그리고 본 연구의 디자인을 도와 주셔서 박사 켄트 전자 Vrana (약리학학과, 의학 펜은 주립 대학교 대학). 이 프로젝트는 국립 암 연구소 Barsumian 신뢰와 흑색증 학술 진흥 재단 (J. 노래)에서 부여 번호 K18CA151798과 보조금 하에서 자금 지원을하고 있습니다.

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
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<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
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<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

<html> ACT 기반 요법의 경우 생체내 다시 주입에 대한 반응성이 매우 높은 자세에 특정한 T 세포의 다수의 체외 발생에는 최적의 접근 방식이다. 우리의 체외 방식은 IPS 세포, IPS 세포 파생 세포, 특히 네 번째 주일 만에, 4 주 후에 죽고 다수의 기능성 T 세포의 증가를 제공하더라도. 우리는 노치에서 생존 신호 DL1뿐 아니라 IL-7과 FLt3L은 IPS 세포 파생 전구 T 세포의 생존을 유지하는 데 충분하지 않은가 매개 신호 전달한다는 결론 다른 생존 요인이 세포 성숙을 통제하고 협동있을 수 있습니다. TCR 유전자 형질 도입과 노치 리간드와 시험 관내 자극을 크게 직접적인 T 세포 분화의 IPS 세포 보낸 그러나 IPS 세포 파생 항원에 특정한 T 세포는 여전히 IPS 세포 파생의 적절한 숫자 얻는 것을 방지 더 이상하지 생존, 항원을 수 ACT 기반 immunotherapy에 대해 특정 T 세포. ve_...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> C57BL/6J 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 000,664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 002,216 </td></tr><tr><td> 반 (反) 인 경우에는 3 번 CD (2C11) 항체 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553,058 </td></tr><tr><td> 안티 CD28 (37.51) 항체 </td><td> BD PharMingen </td><td> 553,295 </td></tr><tr><td> 반 (反) 인 경우에는 3 번 CD (17A2) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 100,202 </td></tr><tr><td> 안티 CD4 (GK1.5) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 100,417 </td></tr><tr><td> 안티 CD8 (53-6.7) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 100,714 </td></tr><tr><td> 안티 CD25 (3C7) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 101,912 </td></tr><tr><td>TI-CD44 (1M7) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 103,012 </td></tr><tr><td> 반 (反) CD117 (2B8) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 105,812 </td></tr><tr><td> 안티 - TCR-β (H57597) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 109,220 </td></tr><tr><td> 안티 - IL-2 (JES6-5H4) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 503,810 </td></tr><tr><td> 안티 IFN-γ (XMG1.2) 항체 </td><td> BioLegend </td><td> 505,822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> 를 Brefeldin </td><td> 시그마 </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> 시그마 </td><td> 107,689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> 통합 과학 </td><td> 204,130 </td></tr><tr><td> RNA 키트 &lt;/ TD&gt; <td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> DNA 검사 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 69,504 </td></tr><tr><td> CD8 절연 키트 </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> ACK 용해 완충액 </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250 31L </td></tr><tr><td> MIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-안티 OVA 항체 </td><td> 록클랜드 Immunochemicals </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Permeabilization 버퍼 </td><td> Biolegend </td><td> 421,002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 </td><td> 시그마 </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0.4 μm의 필터 </td><td> MIllipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; Moflo 세포 분류기 </td><td> 타케의 Cytomation </td><td></td></tr><tr><td> Calibur 흐름 Cytometer </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR II 흐름 Cytometer </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 restrainer </td><td> Braintree 과학 </td><td></td></tr></tbody></table>

t lymphocytes쪽으로 유도 pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

항원에 특정한 CD8 + 세포 독성 T의 lymphocytes (CTLs)의 입양 셀 전송 (ACT)는 malignancies 1 다양한 유망한 치료법입니다. CTLs은 악성 세포를 죽이는 T 세포 수용체 (TCR) 및 릴리스 cytotoxins뿐만 아니라 크린 시토킨과 종양 항원을 상호 작용하여 악성 세포를 인식할 수 있습니다. 이러한 CTLs가 높은 proliferative 잠재력을 가지고 있기 때문에 그것은, 덜 차별 및 중앙 메모리 같은 (반응성이 매우 높은 되나) CTLs 행동 기반 immunotherapy에 대한 최적의 인구가있는 것으로 알려져 더욱 차별화된 세포보다 apoptosis에 적은 경향이 있으며이 생체 항상성 크린 시토킨 2-7에 대응하기 위해 높은 능력. 그러나 환자로부터 그런 CTLs의 높은 숫자를 얻기의 어려움으로 인해, 성공적인 ACT 기반 요법에 대한 반응성이 매우 높은 자세 특정 CTLs을 생성하기 위해 새로운 접근 방법을 찾기 위해 긴급 필요가있다. 자체 재생 줄기의 TCR의 형질 도입면역 reconstitution에 대한 세포는 질병 8-10의 치료에 대한 치료 가능성을 가지고 있습니다. 그러나, 환자의 배아 줄기 세포 (ESCs)을 구하는 접근 가능하지 않습니다. 치료 목적으로 조혈 줄기 세포의 사용 (HSCs)가 널리 클리닉 11-13으로 적용되었지만, HSCs는 차별화 및 proliferative 용량을 감소하고, HSCs은 체외의 세포 배양 14-16로의 확장하기가 어렵습니다. 최근 IPS 세포 기술과 유전자 전달을위한 체외 시스템의 개발은 어떤 수술 방법이없는 환자에서 IPS 세포를 생성할 수 있습니다. 또한, ESCs처럼, IPS 세포는 체외에서 무기한 proliferative 용량을 가지고 있고 조혈 세포로 차별화하는 표시되었습니다. 따라서 IPS 세포는 ESCs이나 HSCs에 비해 ACT 기반 immunotherapy에 사용될 수있는 큰 잠재력을 지니고 있습니다. 여기서는 T lympho의 생성을위한 방법을 제시체외에서의 IPS 세포에서 cytes 및 암 면역 감시를 홍보를위한 IPS 세포의 항원에 특정한 CTLs의 생체내 프로그래밍 인치 노치 리간드와 체외에서의 자극은 IPS 세포에서 T 세포 분화를 몰고, 그리고 종양의 성장을 방지 생체내에서 항원에 특정한 T 세포로 차별 IPS 세포의 TCR 유전자 형질 도입 결과. 따라서, 우리는 IPS 세포에서 항원에 특정한 T 세포 분화를 보여줍니다. 우리의 연구는 ACT 기반 요법에 대한 항원에 특정한 CTLs 창출을위한 잠재적으로보다 효율적인 접근 방식을 제공하고 질병에 대한 치료 전략의 개발을 용이하게합니다.

유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포로부터 T lymphocytes의 생성은 T 세포 기반 immunotherapy에 대한 배아 줄기 세포를 사용하는 대체 방식을 제공합니다. 방법 중 하나를 이용하여 알게됩니다<em&gt; 체외에서</em&gt; 또는<em&gt; 생체내에서</em&gt; 유도 시스템, IPS 전지는 종래와 항원에 특정한 모두 T의 lymphocytes로 차별하실 수 있습니다.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

항원 특이적 CD8+ 세포 독성 T 림프구(CTL)의 입양 세포 전이(ACT)는 다양한 악성 종양에 대한 유망한 치료법입니다 1. CTL은...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, IPS cells)로부터 T 림프구를 생성하고 그 특성을 분석하는 것입니다. IPS 세포는 OP9-DL1 배양 시스템에서 체외(in vitro) 분화시킨 후, rag 결핍 마우스 내에서 체내(in vivo) 성숙 과정을 거칠 수 있습니다. 또는 세포를 유전적으로 조작하여 OT-1 TCR을 과발현시킨 후, 체내 발달을 위해 입양 전이를 수행할 수 있습니다.6주간의 생체 내(in vivo) 분화 후, 마우스의 복강 내에 EEG seven 종양 세포를 주입하여 챌린지하고, 이후 IPS 유래 T 세포의 항원 특이성을 평가할 수 있습니다. 결과적으로 IPS 세포는 일반 T 세포와 항원 특이적 T 세포 모두로 분화할 수 있으며, 후자는 종양 챌린지로부터 동물을 보호할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 개별 맞춤형 암 면역 요법으로 확장될 수 있습니다.이 방법은 환자의 소량의 혈액 또는 피부 조직으로부터 다수의 종양 반응성 T 세포를 생성할 수 있게 합니다. 0일 차에 20% FBS alpha MEM 배지가 포함된, OP9-DL1 세포 단층이 형성된 100mm 배양 접시에 5×10⁴개의 iPS 세포를 옮깁니다. 5일 차에 트립신 처리 후 세포를 원심 분리합니다. 새로운 100mm 배양 접시에서 37°C 인큐베이터 내에 30분 동안 배양한 뒤, OP9-DL1 세포 단층이 있는 새로운 100mm 접시에 부유 세포 5×10⁵개를 20% FBS alpha MEM 배지 및 mouse Flt3 ligand와 함께 분주합니다. 8일 차에 느슨하게 부착된 세포를 피펫으로 조심스럽게 떼어내 원심 분리한 후, OP9-DL1 세포 단층이 코팅된 6웰 배양 플레이트의 단일 웰로 세포를 옮깁니다. 세포를 37°C, 5% CO₂ 조건에서 2주 더 배양합니다. 22일 차에.분리된 IPS 세포를 새 배양 접시에 넣고 37 °C의 신선한 배지에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 부유 세포의 약 절반을 제거하여 70 µm 나일론 스트레이너에 통과시켜 세포 덩어리를 제외하고, 이렇게 얻은 단일 세포 현탁액을 차가운 PBS로 3회 세척합니다. 3회 세척 후, 세포를 1.5 × 10⁷ cells/mL 농도의 PBS에 재현탁하고 정맥 주사 전까지 얼음 위에서 유지합니다.4주 된 rag 결핍 마우스를 적외선 램프 아래에 두어 꼬리 정맥을 확장시킵니다. 그런 다음

directed-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-towards-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 CD8+ T 세포를 사용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제를 억제하는 분석을 보여줍니다. HBV 특이적 수용체로 조작된 이 T 세포는 형질전환 마우스로 전달됩니다. 그런 다음 복제 가능한 HBV 게놈 플라스미드를 간에 직접 주입하여 바이러스 DNA 흡수를 가능하게 합니다. 바이러스 항원이 하이브리드 MHC-I 분자에 의해 발현되고 제시되면 조작된 T 세포는 이러한 복합체를 인식하고 결합합니다. 이는 세포독성 분자의 방출을 유발하여 HBV에 감염된 간 세포를 파괴하고 바이러스 복제를 억제합니다.

바이러스 항원 특이적 T 세포를 이용한 B형 간염 바이러스 복제 억제

이 동영상은 종양 항원 특이적 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 CD8αβ+ T 세포를 생성하는 분석을 보여줍니다. 종양 항원 특이적 iPSC는 기질 세포 단층에서 성장하며 조혈전구세포(HPC)로 분화됩니다. HPC는 분화 배지를 사용하여 CD4+, CD8+, 이중 양성 T 세포로 분화됩니다. 그런 다음 이러한 세포를 자극하여 CD8을 발현하는 단일 양성 T 세포를 생성합니다.

유도 만능 줄기 세포에서 단일 양성 CD8 T 세포 생성

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

이 프로토콜은 전사 인자의 강제 발현을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 혈구 내피 및 다중전위 조혈 전구 세포의 효율적인 유도를 설명합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜의 목표는 흑색종 종양 침투 림프구를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 프로토콜을 보여주는 것입니다.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기서는 쥐 모델에서 자가면역 관절염의 면역 요법을 위해 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 기능적 항원(Ag) 특이적 조절 T 세포(Tregs)를 개발하는 방법을 제시합니다.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

여기, 우리는 인간의 만능 줄기 세포 (hPSC) 문화 프로토콜, hPSCs CD34로 차별화 하는 데 사용 현재+ 조 혈 창시자. 이 방법은 단계 특정 조작 정식 WNT 신호 독점적으로 프로그램 중 하나는 확실 한 또는 원시 조 혈 세포를 지정 하려면 사용 합니다.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

배우세요 iPS 세포에서 T 림프구를 분화시키는 방법을 OP9 DL1 배양 시스템과 rag 결핍 마우스를 활용하여. 이 기술은 항원 특이적 T 세포를 생성하여 종양 면역치료에 활용할 수 있습니다.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

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