기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

이 방법의 전반적인 목표는 단계별 신호 조작 접근 방식을 사용하여 인간 만능 줄기 세포의 분화를 원시 또는 확정 조혈 프로그램으로 안내하는 것입니다. 이 방법은 인간 최종 조혈의 신호 및 전사 조절자에 대한 이해와 같은 분야의 많은 주요 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 스테이지별 조작을 즉시 사용한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Carissa Dege입니다. 프로토콜을 시작하려면 섭씨 37도의 인큐베이터에서 CO2가 5%인 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF에서 70%-80% 포화도로 성장한 이전에 준비된 인간 만능 줄기 세포주 또는 HPSC를 얻습니다.HPSC 배지를 흡인하고 섭씨 37도의 0.25%Trypsin EDTA 1ml를 1분 동안 각 웰에 추가합니다.

1분 후 트립신을 흡인하고 각 웰에 1ml의 스톡 배지를 추가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어냅니다. 그런 다음 각 웰에 1ml의 세척 버퍼를 추가합니다.

2밀리리터 혈청학적 피펫으로 세포를 3-5회 분쇄하여 큰 덩어리를 분해합니다. 그리고 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 330 x G에서 5분 동안 HPSC를 원심분리합니다.

스핀 후 HPSC 미디어를 추가하고 셀을 다시 일시 중단합니다. 다음으로, MAT 코딩 플라스틱 용기의 각 웰에 2ml의 재현탁된 HPSC를 추가하고 밤새 세포를 배양합니다. 24시간 후 배지를 흡인하고 1분 동안 섭씨 37도 0.05% 트립신 EDTA로 교체합니다.

트립신 EDTA를 흡인합니다. 1밀리리터의 스톡 배지를 추가하고 세포 스크레이퍼로 세포를 세게 긁어냅니다. 그런 다음 1ml의 세척 매체를 추가합니다.

2밀리리터 혈청학 피펫으로 세포를 세 번 분쇄하고 50밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 220 x G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 20ml의 세척 매체를 추가한 다음 5mL의 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다.

원심분리 및 흡인 후, Day Zero 배지에서 배아체 또는 EB를 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 EB가 포함된 2ml의 분화 배지를 6웰 저접착 세포 배양 접시의 각 웰에 분배합니다. EB를 섭씨 37도의 5% CO2, 5% O2 다중 가스 인큐베이터에 넣습니다.

24시간 후 Day One 배지 2밀리리터를 추가합니다. 멀티가스 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 18시간 후, 5ml 혈청학 피펫으로 EB를 부드럽게 채취하고 100 x G에서 5분 동안 회전시킵니다.

전체 배양액을 10ml의 Iscove의 Modified Dulbecco Medium 또는 IMDM으로 세척하고 결합하십시오. 배양물을 100 X G에서 5분 동안 다시 회전시켜 이물질을 제거한 후 배지를 흡입합니다. P1000 피펫을 사용하여 Day Two Media로 EB를 부드럽게 다시 매달립니다.

그런 다음 웰당 2밀리리터의 EB를 6웰 저접착 세포 배양 플레이트에 분배합니다. 3개의 마이크로몰 CHIR99021 또는 IWP2를 추가하여 각각 확정 또는 원시 조혈 전구 세포를 지정합니다. 섭씨 37도의 멀티가스 인큐베이터에서 플레이트를 30시간 동안 배양합니다.

30시간 후, 2ml 혈청학적 피펫으로 EB를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 330 x G에서 5분 동안 센트퓨징하여 EB를 분리합니다. EB를 부드럽게 다시 매달아 10ml의 IMDM으로 세척합니다. Day Three Media에서 EB를 다시 현탁시키고 접착력이 낮은 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터를 분배합니다.

섭씨 37도의 멀티가스 인큐베이터에서 72시간 동안 세포를 배양합니다. 72시간의 배양 후, 각 웰에 Day Six 배지 2ml를 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 멀티가스 인큐베이터에서 추가로 48시간 동안 EB를 배양합니다.

분화 8일째에 CHIR99021 처리된 EB를 분리하고 다음 섹션으로 진행합니다. 330 x G에서 EB를 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인합니다.

다음으로 EB에 0.25%Trypsin EDTA 2밀리리터를 추가합니다. EB를 5초 동안 소용돌이치게 하고 섭씨 37도의 수조에서 8분 동안 EBS를 배양합니다. 그런 다음 5ml의 정지 용액을 넣고 EB를 원심분리합니다.

그런 다음 상등액을 흡입합니다. 5ml의 Collagenase II.Vortex에 EB를 5초 동안 다시 매달아 튜브를 부유시킨 다음 섭씨 37도의 수조에서 EB를 배양합니다. 60분 후 EB를 5초 동안 와류로 처리하고 5ml의 정지 용액을 추가합니다.

원심분리 후 상등액을 흡인하고 1ml의 FACS 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다. 40미크론 세포 여과기를 통해 세포를 통과시켜 해리되지 않은 세포 덩어리를 제거합니다. 항체 라벨링 및 CD34 양성 혈기 내피 전구 세포의 FACS 분리를 진행합니다.

FACS 분리 후 HE 배지에서 세포를 재현탁합니다. 50-microlit aliquots에 담긴 세포를 96-well low-adherence 배양 플레이트에 분배한 다음 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, 조혈전구세포는 6-10개의 세포 덩어리로 응집되어야 합니다.

재응집된 세포의 50-miroliter 부피를 24-well MAT 코딩 플레이트의 중앙으로 부드럽게 옮깁니다. 세포가 부착될 때까지 4-6시간 동안 멀티가스 인큐베이터에 플레이트를 부드럽게 놓습니다. 4-6시간 후 세포가 부착될 수 있도록 새로 준비된 HE 배지 1ml를 각 웰에 천천히 추가합니다.

조혈 세포가 보일 때까지 멀티가스 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 다음으로, 세포에서 HE 배지를 부드럽게 제거하고 40미크론 세포 여과기를 통과시켜 플로우 스루(flow-through)를 수집하여 최종 조혈 전구세포를 수확합니다. 나머지 부착 세포의 경우 세포에 0.5 밀리리터 0.25% 트립신 EDTA를 첨가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.

트립신화(Trypsinization) 후 각 웰에 0.5ml의 정지 용액을 추가합니다. 동일한 40미크론 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 모든 부착 및 비부착 세포를 함께 모으고 세포를 회전시킵니다. 2, 000 - 10, 000 FACS 분리 셀을 OP9 배지의 OP9 DL4 셀 중 하나의 웰에 추가합니다.

섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 4-5일마다 세포를 계대측정하려면 1ml의 피펫으로 세포를 분쇄합니다. 40미크론 필터를 통과시켜 덩어리를 제거합니다.

원심분리 후 배지를 흡인합니다. 2ml의 새로운 T 세포 배지에 세포를 다시 현탁시키고 새로운 OP9 DL4 세포에 놓습니다. 최소 21일간의 저온 배양 후 세포를 격렬하게 분쇄하고 40미크론 필터를 통과시켜 세포 파편을 제거합니다.

330 x G에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입한 다음 표준 유세포 분석을 계속합니다. 유세포분석은 IWP2 처리된 분화 배양이 뚜렷한 CD34 양성, CD43 음성 및 CD34 낮은 CD43 양성 집단을 산출한다는 것을 보여줍니다. 반면, CHIR로 처리된 분화 배양액은 분화 8일차에 CD43 양성 세포가 1% 미만입니다.

9일째에 분리된 IWP2 조건에서 유래한 원시 조혈 전구세포는 메틸셀룰로오스 분석에서 주로 원시 적혈구 및 골수성 전구세포를 생성합니다. CHIR99021 처리에서 파생된 CD34 양성 CD43 음성 집단은 내피 전구 세포뿐만 아니라 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, CD184 음성 혈원성 내피를 포함하는 이질적인 집단이며, FACS에 의해 분리될 때 처음에는 내피 유사 세포의 단층을 형성한 다음 내피에서 조혈로의 전이를 겪어 둥글고 굴절성, 비부착성 조혈 세포. 이러한 조혈 세포는 CD34 및 CD45의 발현에 대한 유세포 분석으로 평가할 수 있습니다.

EHT 분석에서 분리된 조혈 전구세포는 메틸셀룰로오스 분석에 사용될 수 있으며 크고 파열된 유사 적혈구 집락 형성 단위, 작은 적혈구 집락 형성 단위 및 골수성 전구세포를 생성할 수 있습니다. CHIR99021 유래 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, CD184 음성 조혈전구세포 및 IWP2 유래 CD34 양성, CD43 음성 조혈전구세포의 T-림프구 분석 전위에 대한 이러한 대표적인 유세포 분석은 입력 CD34 양성 집단 내에서 조혈 전위를 나타내는 CHIR 유래 전구세포에서 CD45 양성, CD56 음성, CD4 양성, CD8 양성 집단의 존재를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 만능 줄기 세포를 원시 또는 확정적인 양의 조혈 전구 세포로 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.