기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

이 방법의 전반적인 목표는 단계별 신호 조작 접근 방식을 사용하여 인간 만능 줄기세포의 분화를 원시 또는 확정적 조혈 프로그램으로 유도하는 것입니다. 이 방법은 인간 확정적 조혈 작용의 신호 및 전사 조절자를 이해하는 것과 같이 해당 분야의 많은 핵심 질문들을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단계별 조작을 즉각적으로 사용할 수 있다는 점입니다.

이 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Carissa Dege가 시연하겠습니다. 프로토콜을 시작하려면, 5% CO2 농도의 37°C 배양기에서 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 상에 70%에서 80% 밀도로 성장시킨, 미리 준비된 인간 다능성 줄기세포 라인(HPSCs)을 준비합니다. HPSC 배지를 흡입하여 제거하고, 각 웰에 37°C의 0.25% Trypsin EDTA 1 mL를 넣고 1분 동안 둡니다.

1분 후, Trypsin을 흡입하여 제거하고 각 웰에 1 mL의 스톡 배지를 첨가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어냅니다. 그런 다음, 각 웰에 1 mL의 세척 버퍼를 첨가합니다.

2 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여, 세포를 3~5회 파이펫팅하여 커다란 세포 덩어리를 풀어줍니다. 그 후 세포를 50 mL 원심분리관으로 옮깁니다. HPSCs를 330 x G에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, HPSC 배지를 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 재현탁된 HPSCs 2 mL를 MAT 코딩된 플라스틱웨어의 각 웰에 분주하고 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 24시간 후, 배지를 흡입하여 제거하고 37 °C의 0.05% Trypsin EDTA로 1분 동안 교체합니다.

Trypsin EDTA를 흡입하여 제거합니다. 스톡 배지 1 mL를 가하고 셀 스크레이퍼로 세포를 강하게 긁어냅니다. 그런 다음 세척 배지 1 mL를 추가합니다.

2mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포를 3회나 파이펫팅(triturate)하고, 이를 50mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 세포를 220 x G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후 배지를 흡입하여 제거하고, 세척 배지 20mL를 추가한 다음 5mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

원심분리와 흡입 후, 배아체(Embryoid Bodies, EBs)를 Day Zero 배지에 조심스럽게 재부유시킵니다. 10 mL 세롤로지 피펫을 사용하여 EBs가 포함된 분화 배지 2 mL를 저부착 6-웰 세포 배양 접시의 각 웰에 분주합니다. EBs를 37°C, 5% CO2, 5% O2 멀티가스 인큐베이터에 넣습니다.

24시간 후, Day One 배지 2 mL를 첨가합니다. 멀티가스 인큐베이터에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 18시간 후, 5 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 EB를 조심스럽게 수확하고 100 x G에서 5분 동안 원심분리합니다.

전체 배양물을 10 mL의 Iscove's Modified Dulbecco Medium 또는 IMDM으로 세척하고 혼합합니다. 잔해물을 제거하기 위해 배양물을 100 X G에서 5분 동안 다시 원심 분리한 후, 배지를 흡입하여 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 Day Two Media로 EB를 부드럽게 재현탁합니다.

그런 다음 6-웰 저부착 세포 배양 플레이트의 각 웰에 EB 2 mL씩을 분주합니다. Definitive 또는 primitive 조혈 전구세포를 특정하기 위해 3 µM의 CHIR99021 또는 IWP2를 각각 첨가합니다. 플레이트를 37°C 멀티가스 인큐베이터에서 30시간 동안 배양합니다.

30시간 후, 2mL serological pipette을 사용하여 EB를 50mL conical tube로 옮긴 뒤 330 x G에서 5분간 원심분리하여 분리합니다. EB를 부드럽게 재현탁하고 10mL의 IMDM으로 세척합니다. EB를 Day Three Media에 재현탁하여 저부착 6-well plate의 각 웰에 2mL씩 분주합니다.

세포를 37°C의 멀티가스 배양기에서 72시간 동안 배양합니다. 72시간 배양 후, 각 웰에 Day Six Media 2mL를 첨가합니다. 그런 다음 EB를 37°C의 멀티가스 배양기에서 48시간 동안 추가로 배양합니다.

분화 8일 차에 CHIR99021로 처리된 EB를 분리하고 다음 섹션으로 진행합니다. EB를 330 x G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거합니다.

다음으로 EB에 0.25% Trypsin EDTA 2 mL를 추가합니다. EB를 5초 동안 볼텍싱하고 37°C 항온수조에서 8분 동안 배양합니다. 그 후 정지 용액 5 mL를 추가하고 EB를 원심분리합니다.

그 다음 상층액을 흡입하여 제거합니다. Collagenase II 5 mL에 EB를 재현탁합니다. 튜브를 5초 동안 볼텍싱한 후, EB를 37 °C 항온수조에서 배양합니다. 60분 후, EB를 5초 동안 볼텍싱하고 정지 용액 5 mL를 첨가합니다.

원심분리 후, 상층액을 제거하고 세포를 1 mL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다. 40-micron 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 해리되지 않은 세포 덩어리를 제거합니다. 이어서 항체 표지와 CD34 양성 조혈성 혈관내피 전구세포의 FACS 분리를 진행합니다.

FACS 분리 후, 세포를 HE 배지에 재현탁합니다. 96-웰 저부착 배양 플레이트에 세포를 50 µL씩 분주한 다음 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침이면 조혈 전구세포가 6~10개의 세포로 이루어진 덩어리로 응집되어야 합니다.

재응집된 세포 50 µL를 24-well MAT-coded 플레이트의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다. 세포가 부착될 때까지 플레이트를 멀티가스 인큐베이터에 4~6시간 동안 조심스럽게 보관합니다. 세포 부착을 위해 4~6시간 후, 각 웰에 갓 준비한 HE 배지 1 mL를 천천히 첨가합니다.

조혈 세포가 보일 때까지 멀티가스 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 다음으로, 세포에서 HE 배지를 조심스럽게 제거하고 40-micron 세포 스트레이너에 통과시켜 여과액을 수집함으로써 확정 조혈 전구세포를 수확합니다. 남아있는 부착 세포의 경우, 세포에 0.5 milliliters 0.25% Trypsin EDTA를 첨가하고 37-degree Celsius 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다.

트립신 처리 후, 각 웰에 0.5 milliliters의 정지 용액을 첨가합니다. 동일한 40-micron 세포 스트레이너에 세포를 통과시켜 모든 부착 세포와 비부착 세포를 함께 모은 후 원심 분리합니다. OP9 배지가 담긴 OP9 DL4 세포 웰 하나에 FACS로 분리된 세포 2, 000~10, 000개를 첨가합니다.

37°C, 5% CO2 배양기에서 배양합니다. 4~5일마다 세포를 계代배양하려면 1 mL 피펫으로 세포를 파쇄합니다. 40 µm 필터로 걸러 덩어리를 제거합니다.

원심분리 후, 배지를 흡입하여 제거합니다. 세포를 2 mL의 신선한 T-cell 배지에 재현탁하여 신선한 OP9 DL4 세포 위에 접종합니다. 최소 21일 동안 저온 배양한 후, 세포를 강하게 파이펫팅하여 현탁하고 40 µm 필터에 통과시켜 세포 잔해를 제거합니다.

330 x G에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입한 후 표준 유세포 분석을 진행합니다. 유세포 분석 결과, IWP2 처리된 분화 배양물에서는 CD34 양성/CD43 음성 및 CD34 저발현/CD43 양성 집단이 뚜렷하게 나타납니다. 반면, CHIR 처리된 분화 배양물은 분화 8일 차에 CD43 양성 세포가 1% 미만으로 나타납니다.

IWP2 조건 하에서 유도되어 9일 차에 분리된 초기 조혈 전구세포는 메틸셀룰로오스 분석에서 주로 초기 적혈구 및 골수성 전구세포로 분화한다. CHIR99021 처리로 유도된 CD34 양성 CD43 음성 집단은 혈관 내피 전구세포뿐만 아니라 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, CD184 음성 조혈 내피세포를 포함하는 이질적 집단이며, 이를 FACS로 분리하면 초기에는 내피세포 유사 세포의 단층을 형성했다가 이후 내피-조혈 전환을 거쳐 둥글고 굴절률이 높으며 부착되지 않는 조혈세포가 된다. 이러한 조혈세포는 유세포 분석법을 통해 CD34 및 CD45의 발현을 평가할 수 있다.

EHT 분석에서 분리된 조혈 전구세포는 메틸셀룰로오스 분석에 사용할 수 있으며, 거대 적혈구 집락 형성 단위(burst-like, erythroid colony forming units), 소형 적혈구 집락 형성 단위 및 골수성 전구세포를 생성합니다. CHIR99021 유래 CD34 양성, CD43 음성, CD73 음성, CD184 음성 조혈 전구세포와 IWP2 유래 CD34 양성, CD43 음성 조혈 전구세포의 T-림프구 분석 잠재력에 대한 대표적인 유세포 분석 결과는, CHIR 유래 전구세포에서 CD45 양성, CD56 음성, CD4 양성, CD8 양성 군집의 존재를 보여주며, 이는 입력된 CD34 양성 군집 내의 조혈 잠재력을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 다능성 줄기세포를 원시 또는 definitive 조혈 전구세포로 분화시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.