중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

이 실험 절차의 전반적인 목적은 소량의 시작 물질로부터 특정 DNA 분절을 충분한 양으로 증폭하는 데 사용되는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 또는 PCR의 과정을 보여주는 것입니다. 먼저, PCR 반응에 사용할 시약과 재료를 준비한 다음, 4가지 deoxy ribonucleotide, DNA 템플릿, 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함한 반응 혼합물을 구성합니다. 그 다음으로, 열 사이클링 조건을 설정하고 PCR 반응을 진행합니다.

그 후, 결과를 확인하여 반응이 성공적으로 이루어졌는지 판단합니다. 궁극적으로 중합효소 연쇄 반응은 원하는 크기의 특정 앰플리콘을 생성해야 합니다.

일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 연구자들은 각 가변 시약의 계산 값을 설정하는 데 다소 어려움을 겪을 수 있으며, 때로는 피펫팅이나 정확한 부피 측정, 특히 글리세롤이 포함된 polymerase의 취급 시 문제를 겪기도 합니다. 실험은 얼음 버킷을 새로 채운 상태에서 시작하십시오. 반응액의 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.

혼합물 및 시약. PCR 구성 성분을 얼음 위에 배치하여 완전히 해동합니다. 여기에는 DNA 템플릿 프라이머, 염화마그네슘 포함 또는 미포함 10 x 반응 버퍼가 포함된 DNA polymerase, deoxy nucleotide, 멸균수 및 염화마그네슘이 포함됩니다.

염화마그네슘이 포함되지 않은 완충액을 사용하는 경우 염화마그네슘이 필요합니다. 0.2 mL 박벽 PCR 튜브를 거치하기 위해 96웰 플레이트를 아이스 버킷에 넣습니다. 이제 작업대에 PCR 튜브와 캡을 준비합니다.

PCR 튜브 랙, 에탄올 내성 마커 및 마이크로 피펫 세트를 준비합니다. 항상 멸균 증류수를 사용하여 최종 부피가 50 µL가 되도록 반응 혼합물을 상세히 기록한 시약 표를 작성하십시오. 예를 들어, 마그네슘이 없는 완충액 5 µL, 10 mM dNTPs 1 µL 및 최적화된 4.0 mM 마그네슘을 사용합니다.

각 20 µM 프라이머 1 µL, 2 ng/µL 템플릿 0.5 µL, 그리고 폴리머라제 0.5 µL를 첨가하고, 나머지 33 µL는 멸균 증류수로만 채웁니다. 10 x 버퍼에 염화마그네슘이 포함되어 있지 않거나 PCR 최적화가 필요한 경우 염화마그네슘을 추가하십시오.

에탄올 내성 마커를 사용하여 각 반응 튜브에 PCR 튜브 라벨링을 진행하십시오. 먼저 계산된 양의 멸균수를 넣은 다음, 10 x 버퍼와 10 millimolar DN NTPs를 추가합니다. 본 반응에서는 염화 마그네슘을 이용하여 적정 실험을 수행합니다.

마그네슘 농도가 일정하지 않으므로, 각 PCR 튜브에 염화마그네슘을 개별적으로 첨가하고 멸균수로 부피를 10 µL로 맞춘 후, 최종 마스터 믹스 40 µL를 각 PCR 튜브에 첨가합니다. 50 µL 반응액과 염화마그네슘 농도를 맞추기 위해 DNA 템플릿과 프라이머를 계속해서 첨가합니다. 마지막으로, 1.8 mL 마이크로 퓨지 튜브에 50 µL 반응액당 0.5~2.5 units의 DNA polymerase를 첨가합니다.

대조군과 피펫팅 시 발생하는 손실분을 고려하여 충분한 양의 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 마이크로 피펫을 전체 솔루션 부피의 약 절반으로 설정하고, 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합합니다. 각 테스트 샘플에 대해 PCR 튜브에 마스터 믹스를 분주합니다.

이제 템플릿 DNA가 없는 음성 대조군을 위해 모든 시약을 넣고, 누락된 DNA 부피만큼 멸균수를 추가하여 보충합니다. 그런 다음 양성 대조군의 경우, 실험 PCR 샘플과 동일한 조건에서 알려진 단편을 증폭하는 템플릿 DNA 및 프라이머 세트를 사용합니다. PCR 열 사이클러는 반응 혼합물을 빠르게 가열 및 냉각시켜, 이중 가닥의 열 유도 변성, DNA 템플릿의 플러스 및 마이너스 가닥으로의 프라이머 결합, 그리고 PCR 산물의 신장을 가능하게 합니다.

사이클 시간은 일반적인 공식을 기준으로 템플릿의 크기와 DNA의 GC 함량에 따라 결정됩니다. 먼저 템플릿의 초기 변성을 수행한 후, 3단계 온도 사이클 프로그램을 25~35회 반복합니다. 이 사이클의 첫 번째 단계는 DNA 템플릿을 변성시키는 것입니다.

그다음, 프라이머의 겉보기 녹는점(melting temperature)보다 약 5 °C 낮은 어닐링 온도(annealing temperature)로 최적화하여 프로그래밍하고, 이어서 중합효소를 DNA 템플릿으로 이동시켜 PCR 산물을 합성하는 신장 단계를 설정합니다. 이제 사이클 횟수를 입력하십시오. 다음 프로그램을 설정합니다.

앰플리콘 합성을 완료하기 위해 연장 단계를 추가로 진행합니다. 마지막으로, 혼합물을 4°C로 냉각하는 종료 단계를 포함합니다. 표준 PCR 조건으로 원하는 앰플리콘을 얻지 못한 경우, 더 나은 결과를 얻기 위해 PCR 최적화가 필요합니다.

따라서 반응이 처음부터 제대로 진행되지 않았다면, 반응의 문제점을 파악하여 해결해야 합니다. 우선, 사람이 범한 실수가 원인이 아니었는지 확인하십시오. 이는 피펫팅 오류가 있었거나, 테스트 튜브 중 하나에 시약을 넣는 것을 잊었을 때 발생할 수 있습니다.

다음으로, 조건의 엄격도(stringency) 중 일부를 조정하여 써모사이클러(thermocycler) 설정을 변경하거나, 마그네슘 농도를 변경하는 대안적인 방법을 시도할 수 있습니다. 또한, 문제 해결을 위해 시약에 일부 첨가제를 추가해 볼 수도 있습니다. 또는, 초기 변성 시간을 대폭 늘리는 다목적 변형 방식인 핫 스타트 PCR(hot start PCR)을 고려해 보십시오.

그런 다음 AROS 겔 전기영동을 사용하여 S seia의 게놈 DNA로부터 GAL three 유전자를 PCR 증폭한 결과를 분리함으로써, 해당 시약 세트에 최적화된 마그네슘 이온 농도를 결정합니다. 참고로, 예상 크기인 2098 base pairs의 PCR 산물은 마그네슘 농도 2.5 millimolar부터 나타나기 시작하며, 4 millimolar에서 최적의 농도를 보입니다. 서로 다른 DNA 템플릿을 사용하여 원하는 PCR 산물을 뚜렷한 밴드로 증폭시키려면 2 millimolar의 마그네슘이 필요합니다. 반응의 엄격성(stringency)을 낮추어 실질적으로 최적 미달의 증폭 조건을 만들면 비특이적 산물들이 스미어(smear) 형태로 나타납니다.

또한, 반응의 전반적인 엄격성을 낮추면 앰플리콘 아이콘을 형성하는 데 필요한 마그네슘 이온의 양이 줄어듭니다. 따라서 변수들을 고려하여 PCR을 최적화하면 원하는 개별 산물을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 중합효소 연쇄 반응을 설정하고 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

목표는 각 PCR의 변수를 이해하고, 원하는 앰플리콘(amplicon)을 생성하기 위해 이러한 변수들을 어떻게 조절할 수 있는지 파악하는 것입니다.