Name: 중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 중합 효소 사슬 반응(PCR)의 기본 단계와 문제 해결 전략을 통해 DNA 증폭 최적화 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 연구자들이 효과적인 PCR 실험을 수행하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

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시약을 설정 및 젤류를 따르고하고 UCLA의 에린 샌더스에 영감,지도 및 지원을하고 원고를 교정을위한 UCLA의 크리스 Reddi에 대한 특별 감사합니다. 나는 또한 GAL3 유전자를 증폭하기 위해 효모 게놈의 DNA와 primers를 공급을위한 감사 Giancarlo Costaguta과 그레고리 S. 페인에게 싶습니다. 4 - 나는 또한 실험실 장비 및 숫자 2를 만들기 위해 사용되는 시약의 사진을내어 Bhairav​​의 샤 감사드립니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 HHMI (HHMI 그랜트 번호 52006944)에 의해 제공되었다.

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<li>Roux, K. H., Hecker, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+optimization+using+touchdown+and+stepdown+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">One-step optimization using touchdown and stepdown PCR.</a> Methods Mol. Biol. 67, 39-45 (1997).</li>
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<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239, 487-491 (1988).</li>
<li>Saiki, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+beta-globin+genomic+sequences+and+restriction+site+analysis+for+diagnosis+of+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.</a> Science. 230, 1350-1354 (1985).</li>
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나는 공개 할게 없다.

PCR은 생물 학적 과학 병기의 indispensible 도구가되었습니다. PCR은 genomes과 다양성뿐만 아니라, 더욱 생화 학적 분석을 위해 간단하게 복제 유전자에 대한 통찰력을 얻고, 구체적이고 정확한 임상 테스트를 수 있도록 생물학 자들이 genomes을 통해 권력을 양보하고, 새로운 기능과 하이브리드 유전자를 만들 수 있도록 과학의 진로를 변경했다. PCR 응용 프로그램은 자사의 강력한 힘을 가졌 과학자의 상상력에 의해 제한됩니다. 이 PCR의 새로운 특수 용도를 설명하는 많은 서적과 논문이 있으며, 많은는 생물 학적 과학의 차세대 걸쳐 개발됩니다. 그러나 관계없이 예상 접근법, 기본 프레임 워크는 동일 남아있다. PCR은 모든 과대에 DNA가 특정 세그먼트의 대량 생성의 체외 응용 프로그램입니다. PCR 실험을 설계하는 것은 사상과 인내가 필요합니다. 그림 3에 표시된 결과는 주요 채널 중 하나를 예시PCR을위한 최적화 전략을 디자인할 때 allenges. PCR 중 하나가 매개 변수가 변경되면 그것은, 그것은 또 다른 영향을 미칠 수 있습니다. 초기 PCR은 최적의 MG이 2.0 mm의 + 농도와 하위 최적 어닐링 온도 (58 ° C)에서 실시되었다 경우 예를 들어, 다음, 결과는 그림 3C에서 볼로 얼룩을 생산합니다. 얼룩을 해결하기위한 시도가 2.0 밀리미터 MgCl 2를 포함하는 반응과 PCR 조건을 설정하고 61 ° C.로 어닐링 온도를 조정 관련 됐을지도 몰라요 그러나, 같은 그림 3A에서 본,이 모든 제품을 얻을 수없는 것이다. 따라서, 그것은 오히려 가짜 결과를 해결할 때, 단일 반응을 한 농도를 추가하는 것보다, 시약을 적정하다 것이 좋습니다. 또한, PCR 실험을 최적화하는 데 필요한 가장 일반적인 조정 MG 2 + 농도를 변경하고 어닐링 온도를 수정하는 것입니다. 그러나 이러한 변화는 최소화하거나 탈선 결과를 폐기하다, additi의 적정하지 않을 경우ves 및 / 또는 같은 표 2-6에 설명된 사이클링 조건 프로토콜을 변경하는 문제를 줄일 수 있습니다. 다른 모든 실패하면 primers를 다시 디자인하고 시도 다시 시도하십시오.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매 Polymeras </td><td> 시그마 </td><td> D4545-25UN </td><td></td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Qiagen </td><td> 201,225 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ML 얇은 벽 튜브 PCR 튜브 </td><td> 바이오는 힘이에요 </td><td> 223-9469 </td><td></td></tr><tr><td> 0.2 ML 얇은 벽 튜브 모자 </td><td> 바이오는 힘이에요 </td><td> 223-9472 </td><td></td></tr><tr><td> TE 버퍼 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나트륨 소금의 이수화물 </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma-HCL </td><td> 시그마 </td><td> T-3253 </td><td></td></tr><tr><td> 사용자 정의 파지의 프라이머 </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG </td></tr><tr><td> 사용자 정의 파지의 프라이머 </td><td> Invitrogen </td><td colspan="2"> 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT </td></tr><tr><td> 사용자 정의 효모 프라이머 </td><td> 통합의 DNA 기술 </td><td colspan="2"> SacI-Gal3 (-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG </td></tr><tr><td> 사용자 정의 효모 프라이머 </td><td> 통합의 DNA 기술 </td><td colspan="2"> Gal3 (1848) - SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG에게 </td></tr><tr><td> 열전달 자전거 타는 사람 </td><td> 바이오는 힘이에요 </td><td> 170-9703 </td><td> 내 자전거 타는 사람 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> ISC BioExpress </td><td> 전자 3120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 겔 전기 영동 </td><td> Hoeffer 과학 계측기 </td><td> 모델 HE33 </td><td></td></tr><tr><td> 1킬로바이트의 DNA 사다리 </td><td> 뉴잉글랜드 BioLabs </td><td> N3232S </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 방사선 파워 팩 </td><td> 바이오는 힘이에요 </td><td> 164-5050 </td><td> PowerPac 기본 </td></tr><tr><td> 젤 닥 시스템 </td><td> Fotodyne 법인 </td><td colspan="2"> FOTO / 분석 탐정 FX 워크 스테이션 </td></tr></tbody></table>

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

생명 공학 발견의 황금 시대로 징계를 쇠뇌 기술 진보가 있었다. 예를 들어, 미생물학 분야는 과학자들이 처음으로 prokaryotes을 시각화 수 안톤 반 리웬허크와의 현미경의 출현으로 변모되었다. 중합 효소 사슬 반응 (PCR)의 개발 미치는 영향은 생물학에서 수많은 subdisciplines를 스팬과 분자 과학의 진로를 변경 이들 혁신 중 하나입니다. 이론 과정은 1971 년에 Keppe와 동료에 의해 제시된되었다; 전체 PCR 절차 주면 주식 회사에서 1985 년 동안 Kary Mullis에 의해 설명하고 실험적으로 적용되기 전까지는하지만, 그건 다른 14년했습니다. 이 기법의 자동화 및 개선은 세균의 Thermus aquaticus의, 따라서 이름이 DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소의 열 안정성의 DNA 중합 효소의 도입과 함께 진행. PCR은 포웨입니다시작하는 재료만을 소량 (즉, DNA를 템플릿이나 대상 시퀀스)의 DNA (즉, amplicon)의 특정 세그먼트의 충분한 공급을 생성할 수 rful 증폭 기술. 간단하고 일반적으로 문제가없는 반면, 가짜 결과를 생산하는 반응을 복잡하게 함정이 있습니다. PCR이 실패했을 때 그것은 아가로 오스의 젤에 대한 밴드의 사다리 또는 얼룩으로 나타 다양한 규모의 다수가 아닌 특정 DNA의 제품으로 이어질 수 있습니다. 가끔 제품이 전혀 나오지. 변이가 실수로 PCR 제품의 이질적인 인구 결과, amplicons에 소개되면 또 다른 잠재적인 문제가 발생합니다. 인내와 신중 문제 해결이 정리 및 문제 (들)을 해결하기 위해 고용하지 않는 경우 PCR 실패는 절망적이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 PCR의 기본 원리를 설명 대부분의 대상 시퀀스의 증폭집니다 방법론을 제공하고 반응을 최적화하기위한 전략을 제시합니다. 이 PCR 가이드, 일에 따라udents는 할 수 있어야합니다 : <ul><li> 종래의 PCR 실험에 대한 반응 및 열 사이클링 조건을 설정 </li><li> 다양한 반응 구성 요소의 기능과 PCR 실험에 미치는 전반적인 영향을 이해 </li><li> 어떤 DNA를 템플릿에 대한 PCR 실험을 설계하고 최적화 </li><li> 실패 PCR 실험 문제 해결 </li></ul>

PCR은 많은 분자 생물학 연구소의 일반적인 기법으로 부상하고있다. 여러 기존의 PCR 프로토콜에 대한 안내서가 여기에 제공됩니다. 각 반응은 독특한 실험, 제품이 다양 생성하는 데 필요한 최적의 조건이기 때문에. 반응의 변수를 이해하는 것은 크게함으로써 원하는 결과를 얻을 수있는 기회를 증가 문제 해결 효율성을 향상시킬 것입니다.

생명 과학 분야에서는 해당 학문을 발견의 황금기로 급격히 진입시킨 기술적 진보들이 있었습니다. 예를 들어, ... 분야의 경우...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 소량의 시작 물질로부터 특정 DNA 분절을 충분한 양으로 증폭하는 데 사용되는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 또는 PCR의 과정을 보여주는 것입니다. 먼저, PCR 반응에 사용할 시약과 재료를 준비한 다음, 4가지 deoxy ribonucleotide, DNA 템플릿, 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함한 반응 혼합물을 구성합니다. 그 다음으로, 열 사이클링 조건을 설정하고 PCR 반응을 진행합니다.그 후, 결과를 확인하여 반응이 성공적으로 이루어졌는지 판단합니다. 궁극적으로 중합효소 연쇄 반응은 원하는 크기의 특정 앰플리콘을 생성해야 합니다.일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 연구자들은 각 가변 시약의 계산 값을 설정하는 데 다소 어려움을 겪을 수 있으며, 때로는 피펫팅이나 정확한 부피 측정, 특히 글리세롤이 포함된 polymerase의 취급 시 문제를 겪기도 합니다. 실험은 얼음 버킷을 새로 채운 상태에서 시작하십시오. 반응액의 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.혼합물 및 시약. PCR 구성 성분을 얼음 위에 배치하여 완전히 해동합니다. 여기에는 DNA 템플릿 프라이머, 염화마그네슘 포함 또는 미포함 10 x 반응 버퍼가 포함된 DNA polymerase, deoxy nucleotide, 멸균수 및 염화마그네슘이 포함됩니다.염화마그네슘이 포함되지 않은 완충액을 사용하는 경우 염화마그네슘이 필요합니다. 0.2 mL 박벽 PCR 튜브를 거치하기 위해 96웰 플레이트를 아이스 버킷에 넣습니다. 이제 작업대에 PCR 튜브와 캡을 준비합니다.PCR 튜브 랙, 에탄올 내성 마커 및 마이크로 피펫 세트를 준비합니다. 항상 멸균 증류수를 사용하여 최종 부피가 50 µL가 되도록 반응 혼합물을 상세히 기록한 시약 표를 작성하십시오. 예를 들어, 마그네슘이 없는 완충액 5 µL, 10 mM dNTPs 1 µL 및 최적화된 4.0 mM 마그네슘을 사용합니다.각 20 µM 프라이머 1 µL, 2 ng/µL 템플릿 0.5 µL, 그리고 폴리머라제 0.5 µL를 첨가하고, 나머지 33 µL는 멸균 증류수로만 채웁니다. 10 x 버퍼에 염화마그네슘이 포함되어 있지 않거나 PCR 최적화가 필요한 경우 염화마그네슘을 추가하십시오.에탄올 내성 마커를 사용하여 각 반응 튜브에 PCR 튜브 라벨링을 진행하십시오. 먼저 계산된 양의 멸균수를 넣은 다음, 10 x 버퍼와 10 millimolar DN NTPs를 추가합니다. 본 반응에서는 염화 마그네슘을 이용하여 적정 실험을 수행합니다.마그네슘 농도가 일정하지 않으므로, 각 PCR 튜브에 염화마그네슘을 개별적으로 첨가하고 멸균수로 부피를 10 µL로 맞춘 후, 최종 마스터 믹스 40 µL를 각 PCR 튜브에 첨가합니다. 50 µL 반응액과 염화마그네슘 농도를 맞추기 위해 DNA 템플릿과 프라이머를 계속해서 첨가합니다. 마지막으로, 1.8 mL 마이크로 퓨지 튜브에 50 µL 반응액당 0.5~2.5 units의 DNA polymerase를 첨가합니다.대조군과 피펫팅 시 발생하는 손실분을 고려하여 충분한 양의 마스터 믹스 솔루션을 준비합니다. 마이크로 피펫을 전체 솔루션 부피의 약 절반으로 설정하고, 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합합니다. 각 테스트 샘플에 대해 PCR 튜브에 마스터 믹스를 분주합니다.이제 템플릿 DNA가 없는 음성 대조군을 위해 모든 시약을 넣고, 누락된 DNA 부피만큼 멸균수를 추가하여 보충합니다. 그런 다음 양성 대조군의 경우, 실험 PCR 샘플과 동일한 조건에서 알려진 단편을 증폭하는 템플릿 DNA 및 프라이머 세트를 사용합니다. PCR 열 사이클러는 반응 혼합물을 빠르게 가열 및 냉각시켜, 이중 가닥의 열 유도 변성, DNA 템플릿의 플러스 및 마이너스 가닥으로의 프라이머 결합, 그리고 PCR 산물의 신장을 가능하게 합니다.사이클 시간은 일반적인 공식을 기준으로 템플릿의 크기와 DNA의 GC 함량에 따라 결정됩니다. 먼저 템플릿의 초기 변성을 수행한 후, 3단계 온도 사이클 프로그램을 25~35회 반복합니다. 이 사이클의 첫 번째 단계는 DNA 템플릿을 변성시키는 것입니다.그다음, 프라이머의 겉보기 녹는점(melting temperature)보다 약 5 °C 낮은 어닐링 온도(annealing temperature)로 최적화하여 프로그래밍하고, 이어서 중합효소를 DNA 템플릿으로 이동시켜 PCR 산물을 합성하는 신장 단계를 설정합니다. 이제 사이클 횟수를 입력하십시오. 다음 프로그램을 설정합니다.앰플리콘 합성을 완료하기 위해 연장 단계를 추가로 진행합니다. 마지막으로, 혼합물을 4°C로 냉각하는 종료 단계를 포함합니다. 표준 PCR 조건으로 원하는 앰플리콘을 얻지 못한 경우, 더 나은 결과를 얻기 위해 PCR 최적화가 필요합니다.따라서 반응이 처음부터 제대로 진행되지 않았다면, 반응의 문제점을 파악하여 해결해야 합니다. 우선, 사람이 범한 실수가 원인이 아니었는지 확인하십시오. 이는 피펫팅 오류가 있었거나, 테스트 튜브 중 하나에 시약을 넣는 것을 잊었을 때 발생할 수 있습니다.다음으로, 조건의 엄격도(stringency) 중 일부를 조정하여 써모사이클러(thermocycler) 설정을 변경하거나, 마그네슘 농도를 변경하는 대안적인 방법을 시도할 수 있습니다. 또한, 문제 해결을 위해 시약에 일부 첨가제를 추가해 볼 수도 있습니다. 또는, 초기 변성 시간을 대폭 늘리는 다목적 변형 방식인 핫 스타트 PCR(hot start PCR)을 고려해 보십시오.그런 다음 AROS 겔 전기영동을 사용하여 S seia의 게놈 DNA로부터 GAL three 유전자를 PCR 증폭한 결과를 분리함으로써, 해당 시약 세트에 최적화된 마그네슘 이온 농도를 결정합니다. 참고로, 예상 크기인 2098 base pairs의 PCR 산물은 마그네슘 농도 2.5 millimolar부터 나타나기 시작하며, 4 millimolar에서 최적의 농도를 보입니다. 서로 다른 DNA 템플릿을 사용하여 원하는 PCR 산물을 뚜렷한 밴드로 증폭시키려면 2 millimolar의 마그네슘이 필요합니다. 반응의 엄격성(stringency)을 낮추어 실질적으로 최적 미달의 증폭 조건을 만들면 비특이적 산물들이 스미어(smear) 형태로 나타납니다.또한, 반응의 전반적인 엄격성을 낮추면 앰플리콘 아이콘을 형성하는 데 필요한 마그네슘 이온의 양이 줄어듭니다. 따라서 변수들을 고려하여 PCR을 최적화하면 원하는 개별 산물을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 중합효소 연쇄 반응을 설정하고 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.목표는 각 PCR의 변수를 이해하고, 원하는 앰플리콘(amplicon)을 생성하기 위해 이러한 변수들을 어떻게 조절할 수 있는지 파악하는 것입니다.

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우리는 우리가 5 Neandertal 개인의 전체 mitochondrial genomes을 재구성하는 데 사용되는 타겟으로 고대 DNA 시퀀스 검색의 방법을 제시한다. 현재 일 인간과 함께 이러한 시퀀스 비교 Neandertals가 장기 낮은 효과적인 인구의 크기 있다고 제안합니다.

프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기

이 비디오는 웰을 따라 그래디언트 어닐링 온도를 설정하는 프라이머의 어닐링 온도 최적화를 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응을 보여줍니다. 다양한 어닐링 온도의 효과는 반응 조건을 최적화하는 데 도움이 되는 증폭된 산물의 수율에 의해 결정됩니다.

최적의 어닐링 온도를 결정하기 위한 그래디언트 중합효소 연쇄 반응

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

디지털 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 이체와 DNA 복사 번호 이체의 고감도 검출을 위한 유용한 도구입니다. 여기, 칩에 튜브 형식으로 디지털 PCR를 사용 하 여 인간 게놈에 있는 드문 이체를 측정 하기 위한 주요 고려 사항을 설명 합니다.

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우리는 원형 RNA를 생성하는 리포터 유전자를 복제하고 분석합니다. 이러한 리포터 유전자는 선형 접합을 분석하고 Alu 요소를 포함하는 구성물보다 큽합니다. 원형 RNA를 조사하기 위하여는, 구조물은 세포로 형질 감염되고 결과 RNA는 선형 RNA의 제거 후에 RT-PCR를 사용하여 분석됩니다.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

여기서, β-est AID 시스템을 사용하여 효모 사카로마이세스 세레비시아에 관심 있는 단백질을 효과적이고 구체적으로 고갈시키기 위한 프로토콜을 제시한다.

특이적이고 효율적인 단백질 고갈을 달성하기 위한 튜닝 분해

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

잘 특성화 된 유전 부분은 새로운 유전 회로의 설계에 필요합니다. 여기에서는 유전 부분을 신속하게 특성화하기 위한 비용 효율적이고 처리량이 높은 방법을 설명합니다. 당사의 방법은 무세포 용해물, 복제를 방지하기 위한 선형 DNA, 처리량을 늘리고 반응량을 줄이기 위한 음향 액체 처리를 결합하여 비용과 시간을 줄입니다.

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Ugi 반응 빠르게 화합물의 다양한 라이브러리를 만들 수있는 편리한 방법으로 증명했다. 그것은 아민의 반응, 알데히드, 카르복실산 및 실온에서 메탄올에서 일반적으로 isonitrile을 포함한다. 이 비디오에서는, 우리는 여과 튜브와 메틀러 - 톨레도 MiniMapper 자동 액체 처리기는 시약 및 용매를 제공하기 위해 사용되었습니다 갖춘 48 슬롯 메틀러 - 톨레도 MiniBlock를 활용. 관심의 매개 변수는 농도, 용매 조성과 시약의 일부 초과되었습니다.

병렬 합성 및 자동 액체 처리를 사용하여 Ugi 반응의 최적화

학습하세요 중합 효소 사슬 반응(PCR)의 기본 단계와 문제 해결 전략을 통해 DNA 증폭 최적화 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 연구자들이 효과적인 PCR 실험을 수행하는 데 필수적인 기술을 제공합니다.

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

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