중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략
May 22nd, 2012
PCR은 많은 분자 생물학 연구소의 일반적인 기법으로 부상하고있다. 여러 기존의 PCR 프로토콜에 대한 안내서가 여기에 제공됩니다. 각 반응은 독특한 실험, 제품이 다양 생성하는 데 필요한 최적의 조건이기 때문에. 반응의 변수를 이해하는 것은 크게함으로써 원하는 결과를 얻을 수있는 기회를 증가 문제 해결 효율성을 향상시킬 것입니다.
이 절차의 전반적인 목표는 소량의 출발 물질에서 특정 DNA 세그먼트를 충분히 공급하는 데 사용되는 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR과 관련된 단계를 입증하는 것입니다. 먼저 PCR 반응에 사용할 시약과 재료를 조립한 다음 4개의 데옥시 리보뉴클레오티드, DNA 템플릿, 프라이머 및 DNA 중합효소를 포함한 반응 혼합물을 설정합니다. 다음 프로그램, 열 순환 조건을 만들고 PCR 반응을 실행합니다.
이것에 따라. 결과를 확인하여 반응이 성공적이었는지 확인합니다. 궁극적으로 중합효소 연쇄 반응은 원하는 산물 크기의 특정 앰플리콘을 생성해야 합니다.
일반적으로 이 프로토콜을 처음 접하는 개인은 각 가변 시약의 계산을 설정하는 데 약간의 어려움을 겪을 수 있으며, 때로는 피펫팅, 정확한 부피, 특히 글리세롤이 있는 중합효소에 문제가 있습니다. 갓 채운 얼음 양동이로 실험을 시작합니다. 반응이 오염되지 않도록 장갑을 착용하십시오.
혼합물 및 시약. PCR 성분을 얼음 위에 올려 완전히 해동합니다. 여기에는 DNA 템플릿 프라이머, 염화마그네슘이 있거나 없는 DNA 중합효소 10 x 반응 버퍼, 데옥시 뉴클레오티드, 멸균수 및 염화마그네슘이 포함됩니다.
염화마그네슘이 없는 완충액을 사용하는 경우 염화마그네슘이 필요합니다. 96웰 플레이트를 얼음 양동이에 넣고 0.2ml 두께의 얇은 벽 PCR 튜브용 홀더로 사용합니다. 이제 작업대에 PCR 튜브와 캡을 장착하십시오.
PCR 튜브 랙, 에탄올 내성 마커 및 마이크로 피펫 세트. 50마이크로리터의 최종 부피를 얻기 위해 항상 양자 멸균 증류수와의 반응 혼합물을 자세히 설명하는 시약 표를 작성하십시오. 예를 들어, 마그네슘이 없는 5마이크로리터의 완충액, 1마이크로리터의 10밀리몰 DN NTP 및 최적화된 4.0밀리몰 마그네슘을 사용합니다.
각 20 마이크로 몰 프라이머의 1 마이크로 리터, 마이크로 리터 당 2 나노 그램의 0.5 마이크로 리터. 그리고 0.5마이크로리터의 중합효소에는 33마이크로리터의 멸균수만 필요합니다. 염화마그네슘이 10 x buffer에 존재하지 않거나 PCR 최적화에 필요한 경우 추가합니다.
각 반응 튜브에 에탄올 내성 마커로 PCR 튜브에 라벨을 부착합니다. 먼저 계산된 양의 멸균수를 추가한 다음 10 x 버퍼와 10 밀리몰 DN NTP를 추가합니다. 이 반응을 위해 염화마그네슘으로 적정을 수행하고 있습니다.
마그네슘 농도가 일정하지 않기 때문에 염화마그네슘을 PCR 튜브에 개별적으로 첨가하고 부피를 멸균수로 10마이크로리터로 정규화하여 최종 마스터 믹스 40마이크로리터가 각 PCR 튜브에 추가됩니다. 50 마이크로리터 반응과 염화마그네슘을 완료하려면 DNA 템플릿과 프라이머를 계속 추가합니다. 마지막으로, 1.8 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 50 마이크로 리터 반응 당 0.5-2.5 단위의 DNA 중합 효소를 첨가합니다.
제어 및 피펫 전달 손실을 수용할 수 있을 만큼 충분한 마스터 믹스 용액을 준비하십시오. 마이크로 피펫터를 총 용액 부피의 약 절반으로 설정하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 각 테스트 샘플에 대해 Eloquent Master는 PCR 튜브에 혼합합니다.
이제 template DNA가 없는 negative control의 경우 모든 시약을 추가하고 멸균수를 사용하여 누락된 DNA 부피를 보상합니다. 그런 다음 양성 대조군의 경우 실험용 PCR 샘플과 동일한 조건에서 알려진 단편을 증폭하는 템플릿 DNA 및 프라이머 세트를 사용합니다. PCR 열 cyclers는 반응 혼합물을 급속하게 가열하고 냉각해, 이중의 열에 의하여 유도된 변성, DNA 템플렛의 플러스와 마이너스 물가에 뇌관의 DNAA 무릎을 꿇는 DNA 및 PCR 제품의 신장을 허용하
.사이클링 시간은 템플릿의 크기와 일반 공식에 대한 DNA의 GC 함량을 기반으로 합니다. 템플릿의 초기 변성으로 시작한 다음 3단계 온도 주기 프로그램을 25-35회 시작합니다. DNA 주형을 변성시키는 이 주기의 첫번째 단계.
그런 다음 프라이머의 명백한 용융 온도보다 약 섭씨 5도 이하의 프라이머를 무릎 꿇는 최적의 프로그램을 진행한 다음 신장 단계를 수행하여 중합효소를 DNA 템플릿으로 가져오고 PCR 산물을 합성합니다. 이제 사이클 수를 입력하십시오. 다음 프로그램.
앰플리콘 합성 완료를 위한 확장된 신장 단계. 마지막으로, 혼합물을 섭씨 4도로 냉각하는 종결 단계를 포함합니다. 표준 PCR 조건에서 원하는 앰플리콘을 얻지 못하는 경우 더 나은 결과를 얻기 위해 PCR 최적화가 필요합니다.
따라서 반응이 처음에 작동하지 않으면 반응 문제를 해결하려고 합니다. 그래서 먼저, 문제가 사람의 실수가 아닌지 확인하고 싶습니다. 이는 피펫팅 오류가 있거나 테스트에 시약을 추가하는 것을 잊은 경우 시험관 중 하나에 발생할 수 있습니다.
다음으로, 조건의 일부 엄격성을 변경하여 thermocycler의 설정을 변경하거나 마그네슘 농도를 변경할 수 있는 또 다른 대체 방법을 시도할 수 있습니다. 문제를 해결하기 위해 시약에 몇 가지 첨가제를 추가해 볼 수도 있습니다. 또는 hot start PCR을 초기 변성 시간이 급격히 증가하는 다목적 변형으로 간주합니다.
AROS 젤 전기 이동법은 그 때 S seia의 게놈 DNA에서 GAL 3 유전자의 PCR를 시약의 이 세트를 위한 최선 마그네슘 이온 농도를 결정하기 위하여 결심하기 위하여 이용됩니다, 주, 예상된 크기의 PCR 제품. 2098의 염기쌍은 분리된 밴드로 원한 PCR 제품의 다른 DNA 템플렛 확대에 4 밀리몰에 최선 농도를 가진 2.5 밀리몰의 마그네슘 농도에서 시작하는 나타납니다 밀리몰 마그네슘. 효과적으로 차선의 증폭 조건으로 반응의 엄격성을 줄이면 비특이적 산물의 번짐이 생성됩니다.
또한, 반응 감소의 전반적인 엄격성으로 인해 앰플리콘 아이콘을 형성하기 위해 더 적은 양의 마그네슘 이온이 필요합니다. 따라서 변수를 염두에 두고 PCR을 최적화하면 원하는 개별 제품을 생산할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 중합효소 연쇄 반응을 설정하고 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
목표는 각 PCR의 변수를 이해하고 원하는 앰플리콘을 생성하기 위해 변수를 조작하는 방법을 이해하는 것입니다.
개요
이 기사는 효소 연쇄 반응(PCR) 기술에 대한 종합적인 가이드를 제공하여 DNA를 성공적으로 증폭하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다. PCR 결과를 해결하고 최적화하기 위해 반응 변수를 이해하는 중요성을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 분자 생물학
- 유전학
- 생명공학
배경
- PCR은 DNA 증폭을 위해 널리 사용되는 방법입니다.
- 각 PCR 반응은 고유하며 특정 조건이 필요합니다.
- 구성 요소와 그 역할을 이해하는 것이 성공의 핵심입니다.
- 일반적인 문제에는 피펫팅 오류 및 시약 계산이 포함됩니다.
연구 목적
- PCR 반응 설정에 필요한 단계를 시연합니다.
- 일반적인 PCR 문제에 대한 문제 해결 팁을 제공합니다.
- 반응 조건 최적화의 중요성을 강조합니다.
사용된 방법
- PCR 시약 및 재료 준비.
- 정확한 부피로 반응 혼합물 설정.
- DNA 증폭을 위한 열 주기 조건 프로그래밍.
- 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 제품을 분석합니다.
주요 결과
- DNA 단편의 성공적인 증폭이 이루어졌습니다.
- 마그네슘 이온 농도 최적화가 결과를 개선했습니다.
- 일반적인 문제 해결 전략이 식별되었습니다.
- 반응 조건의 변동이 결과에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
결론
- PCR 구성 요소를 이해하는 것이 효과적인 문제 해결에 필수적입니다.
- 조건 최적화는 PCR 성공을 크게 향상시킬 수 있습니다.
- 향후 실험은 더 나은 결과를 위한 기술 개선에 집중해야 합니다.
