의 발달 프로세스 추적 및 정량화

이미지 분석 소프트웨어와 발생생물학을 활용하는 전반적인 목표는 생물학적 과정의 메커니즘 모델을 위한 정량적 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 돌연변이 표현형을 어떻게 정량적으로 분석할 수 있는가와 같은 발생생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 연구자가 편향되지 않은 방식으로 생물학적 과정 및 발생 현상의 변화를 식별할 수 있는 능력을 제공한다는 점입니다.

이 방법은 sea elegance의 발달 및 형태 형성을 이해하는 데 활용될 수 있지만, josepha와 같은 다른 모델 생물에도 적용 가능합니다. IOD를 이용한 세포 형태의 재구성 과정은 본 실험실의 박사 과정 학생인 CINA Leman이 시연하겠습니다. IM MOD 프로그램을 설치한 후, eunuch shell을 열고 IM mod 창에 Im mod를 입력하십시오. 3D 모델을 생성할 적절한 원시 데이터가 포함된 파일을 선택하고, 정보 창을 사용하여 zap 창 내 객체의 하단과 상단 위치를 지정하십시오.

정보 창에서 다시 한번 세포 외곽선을 따라 그려 각 세포의 상단 평면에 첫 번째 컨투어를 생성하며, 이때 각 세포마다 새로운 객체를 생성해야 합니다. 그런 다음 Z축으로 스크롤하여 각 Z 평면에 대해 새로운 컨투어를 생성하고, 이어서 각 세포에 대해 새로운 객체를 생성합니다. 모델에 적합한 수의 세포 외곽선을 모두 그린 후, 모델 뷰 창을 열어 객체와 컨투어를 점검하십시오.

그런 다음 모델 뷰 툴바에서 편집과 객체를 선택하십시오. 모든 세포를 채워진 닫힌 객체로 모델링할 수 있는 해당 편집 창이 열립니다. 그리기 데이터 유형은 메쉬로, 그리기 스타일은 채우기로 선택하십시오.

메싱(meshing)을 클릭하고 캡(cap) 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 필요한 만큼 객체를 선택하고 메쉬(mesh)를 클릭하십시오. 그러면 프로그램이 컨투어 스택으로부터 솔리드 객체를 생성합니다.

뷰 창의 Z 스케일을 변경하여 필요에 따라 Z 샘플링 인자를 조정하십시오. 그런 다음 편집 메뉴에서 뷰를 선택하여 3D 객체를 회전시키고, 형광 타임랩스 기록에서 객체를 추적하기 위해 적절하게 세포의 스냅샷이나 동영상을 저장하십시오. 먼저 NDR을 사용하여 원시 데이터를 TIFF 파일로 변환하십시오.

그런 다음 파일을 엽니다. In end drop에서 2D 뷰어 아이콘을 선택하고 데이터 메뉴에서 fit range 아이콘을 클릭하여 히스토그램을 조정합니다.

파일, 이름, 이미지, 세트, 채널을 선택하고 X, Y, Z 해상도를 설정한 후 X, Y, Z 값을 입력하십시오. 핵을 주석 처리하려면 관심 평면으로 이동하여 다시 2D 뷰어를 선택하십시오. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 계통(lineage)을 선택하고 새 계통(new lineage)을 선택하십시오.

관심 있는 핵을 클릭하고 드래그하여 표시합니다. 그런 다음 해당 핵을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 입자 이름 변경(rename particle)을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 입자의 이름을 입력한 후, 화살표 아이콘을 드래그하여 원의 직경을 변경합니다.

다음으로, 오른쪽 아이콘을 클릭하여 핵의 중심 평면을 표시하십시오. 그 후 시간과 평면을 이동하기 위해 하단 도구 모음에서 프레임과 Z 옵션을 선택하고, 추적 중인 세포가 분열할 때까지 핵을 표시하는 원의 위치나 크기를 적절히 조정하십시오. 세포 분열이 관찰되면 딸핵을 표시하고 윈도우 아이콘을 클릭하여 가계도로 전환하십시오.

사용자는 세 개의 핵을 동시에 표시하고 계보(lineage) 옵션에서 연관 부모(associate parent)를 선택합니다. 이후 모든 세포의 추적이 완료되면 파일 이름을 클릭하고 채널을 전환합니다. 입자 이미지 속도 대칭 소프트웨어(particle image velocity symmetry software)를 사용하여 피질 흐름을 정량적으로 분석하기 위해 세포 분열 잔해를 표시합니다.

pif lab에서 새로운 이미지 파일을 불러오고 시퀀싱 스타일 1, 2, 2, 3을 선택하십시오. 다음으로, 원하는 이미지 시퀀스가 포함된 디렉토리로 이동하십시오.

이미지를 선택하고 추가를 클릭하여 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 분석 설정에서 제외 항목을 선택합니다. ROI 마스크와 사용 버튼을 선택하십시오.

분석 설정에서 이미지의 불필요한 부분을 비활성화하기 위해 현재 프레임에 마스크를 그립니다. 다시 PIF 설정을 선택하고, 원하는 PIF 알고리즘으로 고속 푸리에 변환 윈도우 변형(fast Fourier transformation window deformation)을 선택합니다. 첫 번째 패스의 경우, interrogation area 값을 64 pixels로 입력하고 두 번째 패스의 스텝은 32로 설정합니다.

심문 영역 값(interrogation area value)을 32 pixels로, 스텝(step)을 16으로 입력하십시오. 그런 다음 윈도우 변형(window deformation) 드롭다운 메뉴에서 linear를 선택하고, 서브 픽셀 변위 추정(sub pixel displacement estimation)을 위해 Gaussian two by three point 방법을 선택하십시오. 이제 분석(analysis) 메뉴에서 analyze를 선택하고, 후처리(post-processing)에서 analyze all frames를 선택하십시오. 후처리(post-processing) 메뉴에서 vector validation을 선택한 다음, 플롯(plot) 메뉴에서 모든 프레임에 7의 표준 편차 필터 임계값(standard deviation filter threshold)을 적용하십시오.

파생 파라미터를 선택하십시오. 데이터 수정 후 벡터, 프레임당 픽셀을 수정하고, 벡터의 매끄러움(smoothness)과 하이패스 필터(high pass filter)를 조정하십시오. 모든 프레임에 이러한 조정을 적용한 후, 사용 프레임을 1부터 마지막까지로 설정하십시오.

마지막으로 calculate mean vectors 버튼을 클릭하여, 방금 시연한 것과 같이 야생형 C. elegans 성체의 생식샘 굴곡 부위에 집중하여 모든 프레임의 평균 벡터를 측정합니다. 현미경 데이터를 통해 생식세포의 3D 모델이 생성되며, 이를 통해 이색성 타임랩스 현미경 관찰법을 이용하여 세포가 cus의 원위부에서 근위부 팔로 이동하는 동안 발생하는 세포 크기의 변화를 분석할 수 있습니다. 히스톤 융합 단백질과 비근육성 마이오신을 NDR로 표지하여 얻은 모델은 세포 분열 잔해 상속의 정형화된 패턴을 보여줍니다.

또한, 라인 데이터를 통해 각 세포 L과 세포 분열 잔해의 궤적 및 세포 분열 타이밍과의 상관관계를 본 실험에서 얻을 수 있습니다. 예상대로, 야생형 배아와 Rho GTPase 활성화 단백질인 RGA-3가 결핍된 배아 사이의 피질 극성 흐름 역학의 차이를 평가하기 위해, 높은 시간 분해능의 피질 비근육 마이오신 II 단기 타임랩스 현미경 관찰을 수행하였습니다. 야생형 배아의 흐름은 주로 배아의 장축을 따라 나타났습니다.

PIP 분석에서 쉽게 알 수 있듯이, RGA three RNA 간섭 배아의 흐름은 이 축과 직교했습니다. 복잡한 객체의 수동 분할과 배아 발달 과정 중의 세포 추적 방법을 제대로 익히면, 세포 및 객체 추적을 수행하는 동안 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명된 세 가지 도구를 사용하여 분석하는 동안 객체를 놓치지 않도록 적절한 시간 해상도를 설정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

변동성에 관한 의문에 답하거나 단순히 서로 다른 배아를 비교하기 위해 통계 분석을 수행할 수도 있습니다. 정량적 이미지 분석 소프트웨어를 구현함으로써 본 연구진을 포함한 발생 생물학자들은 전례 없는 수준의 세밀함으로 발생의 형태 형성 기전을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 정량적 이미지 분석을 수행하기 위해 다양한 소프트웨어 도구 세트를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.