Name: 의 발달 프로세스 추적 및 정량화 C. 엘레 오픈 소스 도구를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 C. elegans 발달 과정을 오픈 소스 도구로 추적하고 정량화하는 방법을. 3D 세포 모형 재구성과 피질 수축 흐름 분석을 통해 돌연변이 표현형을 객관적으로 분석할 수 있습니다.

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C. 1. 준비 엘레 배아는 시간 경과 현미경을위한 마이크로 비드를 사용하여 <ol><li> M9 버퍼의 드롭에 웜 픽 (백금선)를 사용하여 임신하는 성인 웜을 전송하고 격렬하게 교반 한 다음 이쑤시개 / 피펫 팁 상에 장착 눈 래시를 사용 M9의 인접 드롭 각 웜 전사 제에 의해 박테리아를 닦아 또는 뾰족한 유리 모세관을 사용합니다. </li><li> , HPO 4, 5g의 NaCl M9 버퍼 (1 L M9 버퍼 3g의 KH 2를 포함 PO 4, 6 g의 2- 나에 20 ㎛의 직경의 폴리스티렌 비드 10 배를 함유하는 분산액을 희석하고, 오토 클레이브 (20 분, 120 ℃ 이후 C)는,) 1 M 황산 용액의 추가 1 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 얇은 유리 모세관의 모든 유형에서 입으로 피펫을 확인합니다 (예를 들어, 포인트 모세 혈관이나 모세 혈관 주사 바늘을 ​​당겨하는 데 사용 용융), 고무, 실리콘 또는 유사한 재료 튜브 (이상적으로 투명)의 약 0.5 m 길이의 조각, 200 μl를피펫 팁, 200 ㎕의 PCR 용 튜브의 뚜껑, 작은 주사기 소수성 필터 (예., 0.2에서 0.45 사이 μm의 공경 15-50mm 직경 나일론, PTFE 또는 유사한 물질 필터), 및 1,000 μL 피펫 팁 . 입 피펫이 유형의 생물학적 물질은 실험자에 접촉 얻을 수 없다는 것을 보장한다. </li><li> 튜브 내로 제 팁 200 μL 피펫 팁을 삽입하여 피펫을 조립하여 사용 모세관의 직경과 일치 중심 천공을 가지고 PCR 튜브의 뚜껑을 끼우. 매우 지적 송곳 또는 제제 바늘 천공을 생성하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 얇은 모세관을 그리고 구멍에 삽입합니다. 튜브의 다른 쪽 끝으로 필터를 삽입하고 (그림 1) 입 조각으로 1000 μL 피펫 팁을 삽입합니다. </li><li> 깨끗한 면도날이나 메스와 외음부에 가로 벌레를 절단하여 임신하는 성인을 해부하다. 참고 : 일반적으로, 많은 배아 전자됩니다절단 후 xpulsed. 초기 배아가 필요한 경우, 이들은 때때로 눈 래시 또는 뾰족한 바늘을 사용하여 도체로부터 방출되어야한다. </li><li> 입 피펫을 사용하여이 드롭으로 24x60 mm 커버 유리와 이식란 상에 희석 폴리스티렌 비드 분산 (~ 4 μL)의 피펫 한 방울. </li><li> 조심스럽게 작은 (예를 들어, 18 × 18 또는 20 × 20 mm)를 배치 드롭 위에 유리를 커버하고 드롭이 완전히 퍼져 가지고 있는지 확인하십시오. 참고 : 드롭도 작은 커버 유리의 가장자리를 터치하는 것만으로는 충분하지 작아야한다. </li><li> 액화 바셀린으로 마운트를 밀봉. 24x60 mm 커버 슬립 측에 침지 기름 한 방울을 추가하고 &#39;시간 경과 현미경&#39;섹션을 진행합니다. </li></ol> 성인 C. 2. 준비 엘레 동물 시간 경과 현미경은 나노 비드를 사용하는 주 : 일반적으로, 성인 동물을 장착하기위한 프로토콜 (REF)에서 프로토콜의 적응이다. 18.이 프로토콜로, 그것은 성인 동물의 장기 경과 공 초점 현미경 검사를 수행 할 수있다. <ol><li> 1.5 %를 준비 M9 버퍼에 아가로 오스 솔루션 (/ V W), 종기 (1 분, 물 목욕이나 전자 레인지에서 100 ° C). 이 장 및 / 또는 생식선의 부품 압출로 이어질 수 있기 때문에 아가로 오스의 높은 농도의 사용은 권장되지 않습니다. </li><li> 이 현미경 슬라이드 각에 테이프의 2 ~ 3 층을 스틱. 테이프로 두 슬라이드 사이의 테이프없이 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 피펫 팁을 사용하고 중간 슬라이드의 중심에서 뜨거운 아가로 오스 솔루션의 한 방울을 배치합니다. 이 양쪽에 테이프 층에 의해 지원 될 수 있도록 신속하게 드롭에 다른 슬라이드를 배치합니다. 이 약 10mm 직경의 원형과 평면 한천 패드를 작성합니다. </li><li> 패드 상 (V) / W (2.6 %로 희석) 100 nm의 비드 용액 한 방울을 넣어. 웜 픽업과 드롭에 1-10 청소 성인 웜을 전송합니다. 보호 해주는에 설명 된대로 18 × 18 mm의 커버 유리와 바셀린과 인감ocol 1. </li></ol> 3. 시간 경과 현미경 <ol><li> 현미경 슬라이드 또는 커버 유리 샌드위치에 침지 기름 방울을 넣어. 샘플을 찾기 위해 낮은 배율 (배 또는 10 배 렌즈)에서 시야를 사용합니다. 참고 : 예를 들어, (C를 배아 엘레 간스를 위해 특히) 가능한 한 푸른 빛에 노출을 제한 / 찾을 시편에 초점을 대신 시야를 사용하는 에피 형광 현미경을 사용하지 마십시오. </li><li> 높은 배율 (40 배 또는 60 배 목표)로 변경, (중앙 평면 또는 수집 소프트웨어에 따라 샘플의 위 / 아래 비행기를) 초점에 샘플을 가져. </li><li> 1 μm의 간격 (30) 평면에 샘플링 간격을 설정마다 1 분을 기록했다. 자동화 xy- 또는 XYZ 스테이지를 사용할 경우, 다수의 반점은 한 세션에 기록 될 수있다. 형광 이미징로 전환하고 초점을 다시 확인합니다. 참고 : 약간 긴 노출 시간을 사용하지 않고, 높은 레이저 파워를 사용하지 않도록하십시오매우 낮은 강도에서. 측정은 역학 범위 작물 포화를 방지하기 위해 이미지 수집 프로그램 또는 ImageJ에에 하나, 바로 이미지를 획득하고 과도한 방사선 노출을 의미한다. </li><li> 시간 경과 시리즈를 녹음 시작합니다. 참고 : 아티팩트를 분석 제외 샘플 검사 사이의 길이 (3-10 분) 시간 간격으로 시작하여 점차적으로 원하는 간격에 시간 샘플링을 증가시킵니다. 통계 분석을 수행 할 때 두 경우 모두 발달 타이밍뿐만 아니라 엔드 포인트는 비슷해야합니다. 또한, 광독성 및 생존율을 평가하는 것이 필요하다. 따라서 장기적으로 시간 경과 현미경 후 마운트에서 표본을 복구하고 라이브 / 개발을 계속 여부를 확인합니다. </li></ol> 4. IMOD와 3D 셀 형상 모델을 재구성 참고 : http://bio3d.colorado.edu/imod/ : IMOD 소프트웨어가 IMOD 웹 페이지에서 사용할 수 있습니다. 소프트웨어의 설치는 설명이다이 d를. 윈도우 OS를 사용하는 경우, 유닉스 툴킷은 또한 IMOD 웹 페이지에 패키지로 찾을 수있는, 설치해야합니다. 또한, IMOD 웹 페이지 (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html)에 사용할 수있는 뛰어난 컴파일 3dmod 소개가있다. <ol><li> 유닉스 쉘을 열고 &quot;IMOD&quot;를 입력. IMOD 창이 열립니다. 3D 모델을 생성 할 수있는 원시 데이터 (이상적으로 적층 TIF 또는 이와 유사한 것)을 사용하여 파일을 선택합니다. </li><li> 정보 창 (최대 및 스크롤 도구 아래)를 사용하여 ZAP 창에서 개체의 하단과 상단을 찾습니다. </li><li> 세포 윤곽을 추적 시작합니다. 중요한 것은, 각 셀은 하나의 객체인지 확인하십시오. 각 셀의 상단면과 함께 시작 창 정보를 이용하여이 첫 번째 형상을 만든다. Z에서 아래로 스크롤하여 각 Z 평면을위한 새로운 윤곽을 만들 수 있습니다. </li><li> 3 차원 모델링에 필요한만큼의 세포에 대해서도 똑같이. 새로운 세포로 시작할 때 새로운 객체를 생성하는 것을 잊지 마십시오. 엔OTE는 : 윤곽 추적 및 여러 유용한 플러그인을위한 여러 가지 방법이 있습니다. 자세한 내용은 IMOD 웹 페이지 및 온라인 자습서를 방문하십시오. 여기에 도시 한 경우, 기본 설정이 사용되었다. </li><li> 개체 및 윤곽을 검사 할 수있는 &quot;모델보기&quot;창을 엽니 다. </li><li> &quot;객체&quot;- &quot;모델보기&quot;도구 모음에서 &quot;편집&quot;을 선택합니다. 각각의 편집 창이 열립니다. </li><li> &quot;데이터 형식을 그리기&quot;와 &quot;도면 스타일&quot;로 &quot;입력&quot;으로 &quot;메시&quot;를 선택, 작성 및 폐쇄 개체로 세포를 모델링합니다. 창의 왼쪽에있는 스크롤 선택에서 &quot;메싱&quot;을 클릭합니다. 오른쪽 아래에있는 선택의 옵션 &quot;모자&quot;를 확인합니다. 필요한만큼 많은 개체를 확인하고 &quot;모든 메쉬&quot;을 클릭합니다. 이 프로그램은 윤곽의 스택에서 고체를 생성합니다. Z - 샘플링 인자는 &quot;보기&quot;창에서 &quot;Z 스케일&quot;을 변경하여 조정할 수있다. </li><li> 이동 / 3D의 objec을 회전T ( &quot;편집&quot;- &quot;보기&quot;) 및 스냅 샷 또는 동영상을 저장 ( &quot;파일&quot;- &quot;스냅 티파니로 ...&quot;또는 &quot;영​​화 / 몽타주&quot;). </li></ol> Endrov 5. 추적 형광 표지 된 구조 참고 : 셀 아이디 (예를 들어, H2B, PH-PLC-D1) 및 세포 분열 남은 마커 (예 : 대한 핵 또는 플라즈마 막 마커 변형을 사용하여, 세포 분열의 잔재를 추적하기 위해, NMY-2, 젠-4 ). 핵 또는 플라즈마 막 마커는 세포 분열의 남은 상속 세포 결정하는 것이 중요하다. <ol><li> 빠른 로딩 및 사용의 용이성을 위해, 원시 데이터 (ImageJ에에서, 예) TIFF 파일로 변환 할 수있다. 다음, 오픈 Endrov 및 파일을로드 파일 메뉴에서 &quot;로드 파일&quot;옵션을 선택하여 분석한다. 도구 모음에서 &quot;2D 뷰어&quot;아이콘을 클릭합니다. </li><li> 오른쪽 아래 모서리에 ( &quot;맞춤 범위&quot;아이콘을 파란색 아이콘을 클릭하여 막대 그래프를 조정Endrov 화면). &quot;파일 이름&quot;- - &quot;Imageset에&quot;를 -에 &quot;데이터&quot;를 이동하여 XYZ 해상도를 설정합니다 &quot;채널&quot;- &quot;XYZ 해상도를 설정합니다.&quot; X 및 Y 해상도가 0.2 μm의 경우 예를 들면 X, Y, Z와, 5, 5, 1의 값을 입력하고 Z. 모든 샘플 1 ㎛ </li><li> 핵 주석의 경우, 관심의 평면으로 이동 &quot;2D 뷰어&quot;을 클릭합니다. 드롭 다운 메뉴에서 &quot;리니지&quot;를 선택하고 &quot;새 계보&quot;를 선택합니다. </li><li> 클릭하고 핵에 드래그하여이를 표시 할 수 있습니다. 핵의 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 &quot;입자 이름 바꾸기&quot;를 선택합니다. 증가 또는 원의 직경을 감소하기 위해, 마크 원의 왼쪽에 표시되는 화살표 아이콘을 드래그합니다. 핵의 중심 평면을 표시하려면 오른쪽 아이콘을 클릭합니다. 세포막 마커를 사용하는 경우, 큰 구 셀의 대부분을 커버 할 것이다 그려있다. </li><li> 시간과 평면으로 진행하려면, &quot;프레임&quot;과 &quot;Z&quot;를 선택하단 도구 모음에서 옵션을 설정합니다. 다음 시점에 가고 후 따라서 핵 마크 원의 위치 나 크기를 조정한다. 추적 세포가 분열 할 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 세포 분열이있을 때, 딸이 핵을 표시하고 &quot;리니지 뷰어&quot;로 전환합니다. 이것은 상단 도구 모음에서 &quot;윈도우&quot;아이콘을 클릭하여 선택할 수 있습니다. 마크 동시에 세 개의 핵, 상단 도구 모음에서 &quot;리니지&quot;옵션에 가서 &quot;준 부모&quot;를 선택합니다. </li><li> 셀 추적이 완료되면, 트래킹 셀 분할 잔여 마킹 채널로 전환. 채널을 전환하려면 도구 모음의 왼쪽 하단에있는 파일 이름을 클릭합니다. 핵에 대해 전술 한 바와 같이 세포 분열의 찌꺼기 (또는 다른 구조)이 추적 될 수있다. </li><li> &quot;리니지&quot;- - &quot;편집&quot;편집 될 혈통 번호를 클릭하여 종료 후 소프트웨어로 복귀 할 때, &quot;2D 뷰어&quot;로 이동하는 것이 필요하다. </리&gt; </ol> 6. PIVlab과 두피 액토 마이 오신 흐름 분석 참고 : PIVlab은에서 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어입니다 : http://pivlab.blogspot.de/은; 그것은 PIVlab_GUI을 입력하여 matlab에 명령 줄 환경 내에서 호출 할 수 있습니다. PIVlab 작업 할 때, 그것은 별도의 폴더에 이미지 시리즈를 저장하는 것이 좋습니다. <ol><li> &quot;파일 메뉴&quot;에서 새로운 세션을 시작합니다. &quot;로드 이미지&quot;버튼을 클릭하여 이미지 파일을로드합니다. </li><li> , 시퀀싱 스타일 1-2, 2-3 ...를 선택하고 원하는 이미지의 순서를 포함하는 디렉토리로 이동합니다. 이미지를 선택하고 &quot;추가&quot;버튼을 가져 오기를 클릭합니다. </li><li> &quot;분석 설정&quot;으로 이동하여 &quot;제외 (투자 수익 (ROI), 마스크)&quot;를 선택합니다. 또는 키를 눌러 &quot;Ctrl 키 + E&quot;. 이미지 / S (배아 외부 즉, 영역)의 원치 않는 부분을 비활성화하려면 &quot;현재 프레임에 대한 마스크 (들)을 그립니다&quot;버튼을 사용합니다. </li><li> &quot;PIV 설정&quot;을 선택 FR&quot;분석 설정&quot;메뉴를 OM. 또는 키를 눌러 &quot;Ctrl + S를&quot;. 원하는 PIV 알고리즘으로 &quot;FFT 윈도우 변형&quot;을 선택합니다. 주 : 고속 푸리에 변환 (FFT)의 계산 비용을 줄일 수 있지만, 신호는 물론 잡음 위 연구 입자의 변위 (6.5 참조) 분석 반 패스 영역을 초과하지 않는 경우이다 권장 만한다. </li><li> 연속 된 이미지 사이의 강도 간 상관 관계에 대한 질문의 영역 세 가지 패스에 대해 다음 값을 입력 : 1 패스 : 심문을 64 픽셀의 영역을 32 패스 2 단계 : 심문 32 픽셀의 영역을 16 단계 . 드롭 다운 메뉴 창 변형에서 &quot;선&quot;을 선택합니다. 서브 픽셀 변위 추정 가우스 2 * 3 점법을 선택한다. </li><li> 선택 &quot;분석!&quot; 분석 메뉴와 버튼을 사용에서 분석을 시작하기 위해 &quot;모든 프레임을 분석&quot;. </li><li> 후 처리를 들어 &quot;&quot;벡터 유효성 검사 &quot;를 선택, 후 처리 &quot;메뉴 7 표준 편차 (표준 편차) 필터 임계 값을 설정하고 모든 프레임에 적용됩니다. </li><li> &quot;플롯&quot;메뉴에서 &quot;데이터를 수정 / 매개 변수를 유도&quot;를 선택합니다. 드롭 다운 메뉴에서 &quot;벡터 [PX / 프레임]&quot;를 선택합니다. 벡터와 하이 패스 필터의 부드러움을 조정하고 모든 프레임에 적용됩니다. </li><li> 모든 프레임의 평균 벡터를 계산 1 &quot;중고 프레임&quot;으로 설정하려면 다음 말을하고 &quot;평균 벡터를 계산&quot;버튼을 클릭합니다. </li></ol>

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</ol>

CP 연구실에서의 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(EXC 115; FOR 1756) 및 LOEWE 연구 클러스터 유비퀴틴 네트워크. CP는 유럽 연합 프레임워크 프로그램 7(마리 퀴리 액션 프로젝트326632)의 지원을 받습니다.

개발 물체 추적을 통해, 특히 핵 추적, 그것은 C. 중앙 패터닝 메커니즘을 규명 할 수 있었다 엘레은 1,23,24를 배아. 더 높은 처리량이 전략을 확대, 추가적인 패턴 규칙을 발견하고 패턴을 추론하는 방법을 방법은 드 노보 (10) 규칙을 제안 최근에 가능했습니다. 많은 돌연변이를 들어, 그러나, 정확한 패터닝 결함은 여전히​​ 알려져 있지 않다. 여기에 설명 된 방법은 자신의 해명하는 수단이 될 수있는 도구입니다. 중요한 것은, 많은 다른 모델 시스템은 다 같은 불변 개발을 수행하지 않지만 것을 최근 몇 년 동안 명백 해졌다 간스, 물체 추적 및 정량적 트래킹 데이터 분석 발달 메커니즘과 질병의 메카니즘을 식별하는 중요한 도구이다. 이 중 하나를 너무 될 경우 여기에 표시된 방법은 상황에 특히 적합하다각각 상업적 소프트웨어 툴을 구현하는 더욱 복잡한 ...

형광 단백질, 유전자 공학, 광학 현미경, 컴퓨터 소프트 및 하드웨어의 지속적인 개선과 함께, 그것은 전례가없는 시공간 해상도에서 많은 모델 생물의 개발을 기록 할 수있게되었습니다. 이 연구진은 이전에 해결 될 수없는 질문을하거나 간과 측면을 검색하기 위해 알려진 개발 프로세스를 재 방문 할 수 있습니다. 이 진행은 철저한 측정 및 통계 분석에 의해 정량적 모델로 질적, 비공식적 모델 변환을 목표로 양적 발달 생물학의 분야를 촉발했다. 트래킹 셀과 세포 내 구조는 배아 발달, 신경계 활성, 또는 세포 분열 1-12 정량적 모델을 도출하는 것이 가능했다. C의 초기 개발 과정에서 세포 분열의 잔재를 추적하여 엘레 배아, 우리는 그들이 스테레오를 따르는 것이 밝혀 최근 수경로를 입력하고 구성하는 중요한 편광는 13,14 요인. 여기에, 프로토콜은 양적 발달 생물학 비 전문가를위한 접근에 접근 할 것을되게됩니다. 초점은 표준 공 초점 현미경과 컴퓨터에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 가능한 세 개의 직선 앞으로 자유롭게 사용할 수있는 도구에 놓여있다. 이들은 3D 셀 형상을 생성하는 프로토콜, 세포 분열 잔재를 추적 프로토콜 및 정량적 피질 액토 마이 오신 역학을 설명하는 프로토콜을 포함한다. 선충 C. 엘레가 실시 케이스로 사용하지만, 여기에 기술 된 방법과 도구 등 다른 생물학적 예를 들어 모델, 배양 세포, 조직 외식, organoids 또는 타원체, 다른 배아에 질문의 다양한 적합 일반적으로, 여기에 표시된 분석 중 일부는 (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index 인기있는 오픈 소스 도구 ImageJ에 수행 할 수 있습니다.HTML; 또는 피지, 다른 정량 분석​​을위한 많은 플러그인을 사용할 수있는 ImageJ에 버전, http://fiji.sc/Fiji을) &#39;배터리 포함&#39;. 그러나, 프로그램은 여기서 설명하는 특정 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다. 우선, IMOD, 화상 처리는, 모델링 및 디스플레이 스위트 전자 또는 광학 현미경 (15)로부터 시리얼 섹션들의 3D 재구성을 위해 사용될 수있다. IMOD는 어떤 방향에서 3D 데이터를보기위한 도구가 포함되어 있습니다. 둘째, Endrov, ImageJ에 플러그인 호환성 16, 네트워크 또는 확장 플러그인 구조의 기초 (다른 사람들) 트랙의 이미지 분석, 데이터 처리, 및 주석을 수행하도록 설계된 자바 프로그램. 그것은 140 이미지 처리 작업과 모델 및 원시 데이터를 개별적으로 표시되는 확장 사용자 인터페이스가 포함되어 있습니다. 소스 코드는 https://github.com/mahogny/Endrov에서 찾을 수 있습니다. 셋째, PIVlab, M정량적 및 정 성적으로 입자 유동장 (17)을 분석 할 수 있도록 사용자를 디지털 입자 화상 속도계 애 트랩 용 도구. 이 프로그램의 사용은 처리 도구 상자 (http://mathworks.com) 이미지를 포함하는 MATLAB 라이센스가 필요합니다. PIVlab 정량적 흐름을 설명하기위한 프로그램이다. 이 이미지 쌍 또는 시리즈 내의 속도 분포, 크기, 소용돌이, 발산, 또는 전단을 계산합니다. 이를 위해 가장 가능성 입자 변위를 유도 이미지 쌍 (프로토콜 부분에서 소위 &#39;패스&#39;) 이미지의 작은 영역을 상호 연관. 이 교차 상관은 직접적인 상호 상관 또는 각각 고속 푸리에 변환 (FFT)을 사용하여 공간 또는 주파수 영역에서 분석 될 수 상관 행렬을 산출한다. 여기에 사용 된 장비는 Nipkow ( &#39;방사&#39;) 디스크, EMCCD, 488 및 561 nm의 표준 솔리드 구비 도립 현미경 인상태 레이저 및 석유 또는 물에 침수 목표 아포 크로 매트 20 배 공기 또는 40 배 또는 60 배 계획 /. 그러나, 다른 영상 방식으로 시간 경과 이미징을 수행하는 것이 가능하다, 예를 들면, 포인트 - 투, 라인 - 또는 컨벌루션 또는 구조화 결합 시트 주사 레이저 기반 현미경 멀티 광자 현미경뿐만 아니라, 에피 형광 현미경 조명. Nipkow 디스크 시스템을 사용하는 이점은 스트리밍 모드 (연속 이동 및 Z 차원 물체의 스캐닝)을 사용할 경우 특히, 매우 빠른 화상 취득한다. 또한 분해능을 향상시키기 위해, EMCCD 앞 1.5 배 확대 증량제를 사용할 수있다.

<table><tbody><tr><td>실체 현미경</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td> Polybead 폴리스티렌 미세구체 <td>해부 및 장착을 위한 실체 현미경</td></tr><tr><td>,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>배아 장착</td></tr><tr><td>20 &micro; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리비드 폴리스티렌 마이크로스피어,&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>성인 동물 장착</td></tr><tr><td>0.1 &마이크로; m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>성인 동물 장착</td></tr><tr><td>커버 유리 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>배아 / 성인 장착</td></tr><tr><td>커버 유리 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>배아 장착</td></tr><tr><td>메스</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>배아 해부</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>구강 피펫용 튜브</td></tr><tr><td>30mm PTFE 멤브레인 필터</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>구강 피펫용 필터</td></tr><tr><td>모세관 튜브</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>구강 피펫용 피펫 팁</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>배아/성체 장착</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>성인 동물 장착</td></tr><tr><td>Potassium-di-hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 버퍼</td></tr><tr><td>디 나트륨 - 수소 인산</td>염 <td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 버퍼</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 버퍼</td></tr><tr><td>VisiScope 스피닝 디스크 컨포칼 시스템</td><td>Visitron 시스템</td><td>n / a</td><td>컨포칼 현미경</td></tr></tbody></table>

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; c. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

정량적으로 개발 프로세스를 캡처하는 것은 돌연변이의 표현형을 식별하고 설명하는 기계적인 모델과 키를 유도하는 것이 중요하다. 여기 프로토콜은 배아와 성인 C. 제조되게됩니다 엘레 장단기 시간 경과 현미경 동물과 발달 과정의 추적 및 정량 방법. 제시된 방법은 모든 C.에 기초 쉽게 사용되는 현미경 시스템의 독립적 실험실에서 구현 될 수 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터에서 사용할 수 있으며 오픈 소스 소프트웨어에 간스 균주. 모델링 소프트웨어 IMO​​D를 이용하여 3 차원 셀 형상 모델의 재구성, - 형광 표지 된 세포 내 구조물 다목적 이미지 분석 프로그램 Endrov 및 PIVlab를 사용하여 피질 수축 흐름 분석을 사용하여 수동으로 추적 (시분 디지털 입자 화상 유속계 MATLAB에 대한 도구) 표시됩니다. 그것은 T 이러한 방법도 배포 할 수있는 방법을 설명합니다O를 정량적으로 소포 흐름의 추적, 추적 다른 모델, 예를 들면, 세포 추적 및 계보의 다른 발달 과정을 캡처합니다.

프로토콜 2, 3, 4, 야생형 C. 생식선에서의 시간 경과 이미징을 사용하여 엘레 성인이 수행 (변형 OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, 파이-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)), 생식 세포 프로모터에서 막 마커를 발현하는 ). 생식선의 회전을 중심으로, 생식 세포의 3D 모델은 현미경 데이터 (그림 2)에서 생성됩니다. 이 모델은, 세포의 통과는 기단 아암 선단을 형성하는 동안 셀 크기의 변화를 분석 할 수 우축의 조직 및 우축 개별 세포의 접점의 크기를 보여준다 (도 HTTP 참조 : //www.wormatlas한다. 조직 / 자웅 동체 / 세균 % 20line / Germframeset.html). 다음으로, 프로토콜 1, 3, 5 C. 장기간 경과 현미경을 수행하는 데 사용되는 itIs37 [파이-1P :: mChe...

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

이미지 분석 소프트웨어와 발생생물학을 활용하는 전반적인 목표는 생물학적 과정의 메커니즘 모델을 위한 정량적 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 돌연변이 표현형을 어떻게 정량적으로 분석할 수 있는가와 같은 발생생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 연구자가 편향되지 않은 방식으로 생물학적 과정 및 발생 현상의 변화를 식별할 수 있는 능력을 제공한다는 점입니다.이 방법은 sea elegance의 발달 및 형태 형성을 이해하는 데 활용될 수 있지만, josepha와 같은 다른 모델 생물에도 적용 가능합니다. IOD를 이용한 세포 형태의 재구성 과정은 본 실험실의 박사 과정 학생인 CINA Leman이 시연하겠습니다. IM MOD 프로그램을 설치한 후, eunuch shell을 열고 IM mod 창에 Im mod를 입력하십시오. 3D 모델을 생성할 적절한 원시 데이터가 포함된 파일을 선택하고, 정보 창을 사용하여 zap 창 내 객체의 하단과 상단 위치를 지정하십시오.정보 창에서 다시 한번 세포 외곽선을 따라 그려 각 세포의 상단 평면에 첫 번째 컨투어를 생성하며, 이때 각 세포마다 새로운 객체를 생성해야 합니다. 그런 다음 Z축으로 스크롤하여 각 Z 평면에 대해 새로운 컨투어를 생성하고, 이어서 각 세포에 대해 새로운 객체를 생성합니다. 모델에 적합한 수의 세포 외곽선을 모두 그린 후, 모델 뷰 창을 열어 객체와 컨투어를 점검하십시오.그런 다음 모델 뷰 툴바에서 편집과 객체를 선택하십시오. 모든 세포를 채워진 닫힌 객체로 모델링할 수 있는 해당 편집 창이 열립니다. 그리기 데이터 유형은 메쉬로, 그리기 스타일은 채우기로 선택하십시오.메싱(meshing)을 클릭하고 캡(cap) 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 필요한 만큼 객체를 선택하고 메쉬(mesh)를 클릭하십시오. 그러면 프로그램이 컨투어 스택으로부터 솔리드 객체를 생성합니다.뷰 창의 Z 스케일을 변경하여 필요에 따라 Z 샘플링 인자를 조정하십시오. 그런 다음 편집 메뉴에서 뷰를 선택하여 3D 객체를 회전시키고, 형광 타임랩스 기록에서 객체를 추적하기 위해 적절하게 세포의 스냅샷이나 동영상을 저장하십시오. 먼저 NDR을 사용하여 원시 데이터를 TIFF 파일로 변환하십시오.그런 다음 파일을 엽니다. In end drop에서 2D 뷰어 아이콘을 선택하고 데이터 메뉴에서 fit range 아이콘을 클릭하여 히스토그램을 조정합니다.파일, 이름, 이미지, 세트, 채널을 선택하고 X, Y, Z 해상도를 설정한 후 X, Y, Z 값을 입력하십시오. 핵을 주석 처리하려면 관심 평면으로 이동하여 다시 2D 뷰어를 선택하십시오. 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 계통(lineage)을 선택하고 새 계통(new lineage)을 선택하십시오.관심 있는 핵을 클릭하고 드래그하여 표시합니다. 그런 다음 해당 핵을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 입자 이름 변경(rename particle)을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 입자의 이름을 입력한 후, 화살표 아이콘을 드래그하여 원의 직경을 변경합니다.다음으로, 오른쪽 아이콘을 클릭하여 핵의 중심 평면을 표시하십시오. 그 후 시간과 평면을 이동하기 위해 하단 도구 모음에서 프레임과 Z 옵션을 선택하고, 추적 중인 세포가 분열할 때까지 핵을 표시하는 원의 위치나 크기를 적절히 조정하십시오. 세포 분열이 관찰되면 딸핵을 표시하고 윈도우 아이콘을 클릭하여 가계도로 전환하십시오.사용자는 세 개의 핵을 동시에 표시하고 계보(lineage) 옵션에서 연관 부모(associate parent)를 선택합니다. 이후 모든 세포의 추적이 완료되면 파일 이름을 클릭하고 채널을 전환합니다. 입자 이미지 속도 대칭 소프트웨어(particle image velocity symmetry software)를 사용하여 피질 흐름을 정량적으로 분석하기 위해 세포 분열 잔해를 표시합니다.pif lab에서 새로운 이미지 파일을 불러오고 시퀀싱 스타일 1, 2, 2, 3을 선택하십시오. 다음으로, 원하는 이미지 시퀀스가 포함된 디렉토리로 이동하십시오.이미지를 선택하고 추가를 클릭하여 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 분석 설정에서 제외 항목을 선택합니다. ROI 마스크와 사용 버튼을 선택하십시오.분석 설정에서 이미지의 불필요한 부분을 비활성화하기 위해 현재 프레임에 마스크를 그립니다. 다시 PIF 설정을 선택하고, 원하는 PIF 알고리즘으로 고속 푸리에 변환 윈도우 변형(fast Fourier transformation window deformation)을 선택합니다. 첫 번째 패스의 경우, interrogation area 값을 64 pixels로 입력하고 두 번째 패스의 스텝은 32로 설정합니다.심문 영역 값(interrogation area value)을 32 pixels로, 스텝(step)을 16으로 입력하십시오. 그런 다음 윈도우 변형(window deformation) 드롭다운 메뉴에서 linear를 선택하고, 서브 픽셀 변위 추정(sub pixel displacement estimation)을 위해 Gaussian two by three point 방법을 선택하십시오. 이제 분석(analysis) 메뉴에서 analyze를 선택하고, 후처리(post-processing)에서 analyze all frames를 선택하십시오. 후처리(post-processing) 메뉴에서 vector validation을 선택한 다음, 플롯(plot) 메뉴에서 모든 프레임에 7의 표준 편차 필터 임계값(standard deviation filter threshold)을 적용하십시오.파생 파라미터를 선택하십시오. 데이터 수정 후 벡터, 프레임당 픽셀을 수정하고, 벡터의 매끄러움(smoothness)과 하이패스 필터(high pass filter)를 조정하십시오. 모든 프레임에 이러한 조정을 적용한 후, 사용 프레임을 1부터 마지막까지로 설정하십시오.마지막으로 calculate mean vectors 버튼을 클릭하여, 방금 시연한 것과 같이 야생형 C. elegans 성체의 생식샘 굴곡 부위에 집중하여 모든 프레임의 평균 벡터를 측정합니다. 현미경 데이터를 통해 생식세포의 3D 모델이 생성되며, 이를 통해 이색성 타임랩스 현미경 관찰법을 이용하여 세포가 cus의 원위부에서 근위부 팔로 이동하는 동안 발생하는 세포 크기의 변화를 분석할 수 있습니다. 히스톤 융합 단백질과 비근육성 마이오신을 NDR로 표지하여 얻은 모델은 세포 분열 잔해 상속의 정형화된 패턴을 보여줍니다.또한, 라인 데이터를 통해 각 세포 L과 세포 분열 잔해의 궤적 및 세포 분열 타이밍과의 상관관계를 본 실험에서 얻을 수 있습니다. 예상대로, 야생형 배아와 Rho GTPase 활성화 단백질인 RGA-3가 결핍된 배아 사이의 피질 극성 흐름 역학의 차이를 평가하기 위해, 높은 시간 분해능의 피질 비근육 마이오신 II 단기 타임랩스 현미경 관찰을 수행하였습니다. 야생형 배아의 흐름은 주로 배아의 장축을 따라 나타났습니다.PIP 분석에서 쉽게 알 수 있듯이, RGA three RNA 간섭 배아의 흐름은 이 축과 직교했습니다. 복잡한 객체의 수동 분할과 배아 발달 과정 중의 세포 추적 방법을 제대로 익히면, 세포 및 객체 추적을 수행하는 동안 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명된 세 가지 도구를 사용하여 분석하는 동안 객체를 놓치지 않도록 적절한 시간 해상도를 설정하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.변동성에 관한 의문에 답하거나 단순히 서로 다른 배아를 비교하기 위해 통계 분석을 수행할 수도 있습니다. 정량적 이미지 분석 소프트웨어를 구현함으로써 본 연구진을 포함한 발생 생물학자들은 전례 없는 수준의 세밀함으로 발생의 형태 형성 기전을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 정량적 이미지 분석을 수행하기 위해 다양한 소프트웨어 도구 세트를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

우리는 기록하고 계량화 할 수있는 비디오 속도 추적 현미경 시스템을 개발...

C. elegans 추적 및 행동 측정

이 비디오는 경기장에서 웜의 움직임을 기록하기 위해 비디오 및 추적 소프트웨어를 사용하는 방법을 설명합니다. 예제 프로토콜은 에탄올 노출이 웜 이동에 미치는 영향을 측정합니다.

C. 예쁜꼬마선충 이동 추적: 웜의 이동을 평가하는 방법

에 주문형 운동을 유도하는 반자동 마이크로 전기 유체...

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

우리는 넓은 필드의 보기 선 충 추적 플랫폼 (WF-NTP), 꼬마 선 충의 큰 인구의 높은 처리량 phenotypic 특성을 가능 하 게를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 미묘한 행동 변화 돌연변이 체 긴장 또는 확장성 패션에서 약물 치료에 대 한 응답에서 특성을 사용할 수 있습니다.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

배우세요 C. elegans 발달 과정을 오픈 소스 도구로 추적하고 정량화하는 방법을. 3D 세포 모형 재구성과 피질 수축 흐름 분석을 통해 돌연변이 표현형을 객관적으로 분석할 수 있습니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화

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