선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

이 행동 기록 설정 및 프로토콜의 전반적인 목표는 멀티 카메라 비디오 획득 시스템을 사용하여 용해성 화합물에 대한 C Elegans의 집단 기반 화학감각 선호도를 정량화한 다음 자동화된 비디오 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 유전적 돌연변이에 대한 더 빠르고 표준화된 행동 분석을 가능하게 하여 C Elegans의 신경생물학 연구를 촉진할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 조건에서 여러 복제를 동시에 분석하는 동시에 용해성 신호에 대한 선충 개체군의 반응의 시간적 역학을 모니터링할 수 있다는 것입니다.

행동 챔버 어셈블리를 시연하는 것은 이 실험실의 직원 과학자인 Christopher Cronin이 될 것입니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 패브릭 커버, 카메라 마운트 바, 모서리 브래킷, 압출 바 및 카메라 마운트 어셈블리를 준비합니다. 중앙 바에 부착된 엔드 바부터 시작하여 카메라 스탠드와 홀스터를 카메라 마운트 어셈블리에 부착합니다.

다음으로, 동작 챔버 프레임을 조립합니다. 정사각형 폴리에스터 시트에 4개의 1피트 압출 알루미늄 막대를 부착하는 것으로 시작합니다. 패브릭 시트의 옴니의 두 개의 T-너트에 하나의 막대를 밀어 넣고 패브릭 너비를 따라 막대를 중앙에 놓습니다.

패스너를 조여 천 시트를 각 막대에 고정합니다. 4개의 부착된 알루미늄 막대가 위에 있는 작업 표면에 사각형 폴리에스터 시트를 펼칩니다. 그런 다음 각 막대의 각 끝에 하나씩 4개의 알루미늄 막대의 상단 표면에 8개의 모서리 브래킷을 밀어 넣습니다.

브래킷의 수직 다리가 막대 끝과 같은 높이가 되도록 모서리 브래킷을 막대에 놓고 나사를 T 너트에 조여 제자리에 고정합니다. 각 모서리에서 1피트 알루미늄 돌출부를 똑바로 세우고 두 모서리 브래킷 다리의 T-너트 위로 돌출부를 밀어 넣습니다. 그런 다음 패스너를 조여 수직 막대를 수평 막대에 고정하여 인접한 두 개의 수평 막대를 결합합니다.

H자형 카메라 마운트 어셈블리의 느슨한 T-너트를 프레임의 수직으로 밀어 넣습니다. H가 프레임의 각 모서리에 있는 모서리 브래킷 위에 놓이도록 완전히 미끄러지도록 합니다. 네 개의 모서리 브래킷 나사를 조여 카메라 마운트 어셈블리를 제자리에 고정합니다.

다음으로, 마지막 4 개의 1 피트 압출 알루미늄 바를 사용하여 챔버의 바닥 층을 조립합니다. 브래킷의 다리가 바 끝과 같은 높이가 되도록 모서리 브래킷을 배치하고 나사를 조여 제자리에 고정합니다. 그런 다음 직립 채널의 느슨한 T-너트를 사용하여 프레임 수직립 사이에 막대를 밀어 넣습니다.

모서리 브래킷의 상단 가장자리가 업라이트의 열린 끝보다 1인치 아래에 있도록 막대를 배치하고 모서리 브래킷 나사를 조여 제자리에 고정합니다. 다음으로, 4개의 직사각형 폴리에스터 시트의 T-너트를 직립 압출 바의 채널로 밀어 챔버의 측면을 덮고 패스너를 조여 제자리에 고정합니다. 챔버 내부에 접근하기 위한 도어로 한쪽을 선택하고 챔버 하단 층에 있는 두 개의 나사와 T 너트를 제거합니다.

각 모서리의 상단 끝에 플라스틱 캡을 씌워 완성된 프레임을 위한 발 역할을 합니다. 프레임을 오른쪽으로 돌리고 프레임 공간 레이어 내부의 슬라이드당 두 개의 패널 홀더를 삽입하고 비틀어 제자리에 고정합니다. 그런 다음 패널 홀더 위에 12 x 12인치 크기의 투명 아크릴 조각을 놓아 분석 플레이트를 위한 무대를 제공합니다.

마지막으로, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 카메라와 무대 템플릿을 배치합니다. 실험 전날, 28개의 빈 35mm 플레이트를 평평한 표면에 5개 이하로 쌓아 놓습니다. 각 분석 플레이트를 5ml의 선충 성장 배지 한천으로 채우고 분석 플레이트를 뚜껑을 연 상태로 실온에서 밤새 똑바로 건조시킵니다.

실험 당일에는 백라이트를 켜고 컴퓨터를 부팅한 다음 현미경 카메라의 비디오 캡처 소프트웨어를 실행합니다. 현미경 카메라를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어 창 상단에 있는 번호가 매겨진 카메라 썸네일을 클릭하여 view 카메라의 라이브 피드. 비디오 녹화 설정을 조정하려면 카메라 피드의 왼쪽 상단 모서리에 있는 비디오 형식 메뉴를 풀다운하고 MJPG 1280x1024를 선택합니다.

그런 다음 비디오 형식 메뉴 옆에 있는 폴더 메뉴를 풀다운하고 비디오 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 카메라 피드의 오른쪽 상단 모서리에 있는 자동 노출 아이콘을 클릭하고 자동 노출을 끕니다. 그런 다음 자동 노출 아이콘 오른쪽에 있는 LED 아이콘을 즉시 클릭하여 내장된 현미경 카메라 LED를 끕니다.

인접한 설정' 아이콘을 클릭하고 모노크롬을 선택합니다. 대비를 최대화하고 밝기를 조정합니다. 스테이지 플레이트 정렬 템플릿 위에 솔루션 배치 템플릿을 정렬하고 카메라 피드 왼쪽에 있는 타임랩스 비디오 녹화 아이콘을 클릭합니다.

지속 시간으로 5초를 입력하고 간격으로 1초를 입력하여 초당 1프레임으로 5초 보정 비디오를 녹화합니다. 5ml 유리 피펫을 사용하여 동기화된 웜 플레이트에 1.2ml의 선충 성장 배지 버퍼를 추가하고 플레이트를 부드럽게 교반하여 웜을 버퍼로 이동시킵니다. 플레이트에서 버퍼를 피펫으로 올리고 버퍼의 웜을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 분배합니다.

튜브를 1-2분 동안 그대로 두어 벌레가 바닥에 가라앉을 수 있도록 합니다. 그런 다음 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 튜브 바닥에 응집된 벌레 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 가능한 한 많은 세척 버퍼를 제거합니다. 튜브에 1ml의 깨끗한 선충 성장 배지 완충액을 다시 채우고 세척 절차를 두 번 더 반복합니다.

다음으로, 해부 현미경의 스테이지 위에 용액 배치 템플릿을 테이프로 붙입니다. 그런 다음 플레이트 정렬 템플릿의 양쪽에 양면 테이프 스트립을 놓습니다. 분석 플레이트의 둘레를 플레이트 정렬 템플릿의 원에 정렬하고 템플릿이 플레이트 바닥에 부착될 때까지 아래로 누릅니다.

그런 다음 분석 플레이트 템플릿 멤버 마커를 해부 현미경의 용액 배치 템플릿 멤버 마커에 맞춥니다. 다음으로, P2 피펫을 사용하여 각각 1사분면과 4사분면에 1마이크로리터의 M13 버퍼를 배치합니다. 새 팁을 사용하여 1마이크로리터의 10밀리몰 CuCl2 용액을 각각 2사분면과 3사분면에 배치합니다.

유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액 방울이 한천에 완전히 흡수된 후 세척된 벌레를 분석 플레이트로 옮깁니다. 원형 처리된 영역의 위와 아래 영역에 지렁이 한 방울을 떨어뜨립니다. 조직을 네 번 접고 뭉툭한 가장자리를 사용하여 분석 플레이트의 과도한 세척 버퍼를 흡수합니다.

즉시 템플릿 모서리의 번호를 정렬하여 동작 챔버의 현미경 카메라 아래에 분석 플레이트를 정렬합니다. 웜이 분석 플레이트에 적응할 때까지 2-3분 동안 기다립니다. 그런 다음 카메라 피드 왼쪽에 있는 타임랩스 비디오 녹화 아이콘을 클릭하고 지속 시간으로 10분을 입력하고 간격으로 1초를 입력하여 초당 1프레임의 10분 비디오를 녹화합니다.

마지막으로 시작을 클릭하여 비디오 녹화를 시작합니다. 각 비디오 프레임에 대해 preference index 함수는 각 관심 영역의 웜 픽셀 수를 계산하고 관심 영역의 총 픽셀 수 중 1픽셀의 백분율을 계산합니다. 다양한 유전자형 및 치료 쌍에 대해 얻은 선호도 지수 값이 여기에 나와 있습니다.

긍정적인 선호도 지수 값은 치료에 대한 매력을 나타내고 음의 선호도 지수 값은 반발을 나타냅니다. M13 완충 용액을 관심 대조군 영역과 실험 영역 모두에 배치했을 때 0.02의 선호도 지수를 얻었으며, 이는 공간 편향이 없음을 보여줍니다. 이 그래프는 또한 N2 웜이 구리 이온을 강력하게 피하여 선호도 지수가 0.67임을 보여줍니다.

또한, 감각 섬모 형성에 결함이 있는 osm-3와 ASH 매개 통각 반응에 결함이 있는 ocr-2 돌연변이는 회피 감소와 구리 이온에 대한 약간의 유인도 보여주었습니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 빠르면서도 원활하고 일관되게 작업하는 것이 중요합니다. 기록 설정 및 분석 프로토콜은 서로 다른 C Elegans의 감각 품종 간의 상호 작용에서 발생하는 집단 기반 행동 반응을 특성화하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.