Name: 선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans의 화학 감응도 선호 분석을 위한 자동화된 행동 기록 설정과 프로토콜을 통해 신경생물학 연구를 가속화하는 방법을 배우세요. 다중 카메라 비디오 획득 시스템과 자동 분석 소프트웨어를 사용하여 유전자 돌연변이체의 표준화된 행동 분석을 수행할 수 있습니다.

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일부 계통은 NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440)의 지원을받는 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)에 의해 제공되었습니다. 이 연구는 하워드 휴즈 의학 연구소 (Howard Hughes Medical Institute)에 의해 지원되며 PWS는 수사관입니다.

<ol><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li>
<li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+taste+bitter%3A+ASH+neurons%2C+QUI-1%2C+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li>
<li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHE-3%2C+a+cytosolic+dynein+heavy+chain%2C+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li>
<li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li>
<li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210(2013).</li>
<li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li>
<li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

프로토콜의 중요한 단계는 검정 플레이트가 서로 다른 실험 기간 동안 일관된 건조 수준을 유지하도록하는 것입니다. 건조 수준이 다르면 한천에 대한 용액의 확산 속도가 달라져 결과적으로 행동 결과가 달라집니다. 따라서, 분석 플레이트는 항상 실험 전에 오후에 신선하게 만들어야합니다. 분석 당 시험 된 웜의 수는 또한 치료법을 쉽게 비교할 수 있도록 규제되어야합니다. 참고로, 야생형 웜 4-10 알 / 얻었다 평균 H&gt; 분석 당 360 개 웜 상기 웜 동기화 프로토콜 (17)을 따라 경우를 낳는다. 어떤 돌연변이 계통의 돌연변이가 알을 낳지 못하는 경우, 알을 낳기 위해 더 많은 육식성 어른 벌레를 골라 대상 자 수에 도달시킵니다. 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 세척 프로세스 및 웜 배치 중에 웜을 부드럽게 처리하는 것입니다. 웜은 기계적 자극에 민감합니다.<html> 반전 및 산란 방지 18 . 또한 ROI를 정확하게 정의하고 비디오 분석을 진행하기 전에 특정 조명 조건에 대한 최적의 임계 값 상수 값을 결정하는 데주의를 기울여야합니다. 또한 마지막 실험이 실행 된 후 오랜 시간이 경과 한 경우 보정 및 임계 과정을 반복하는 것이 좋습니다. 이 방법의 한계는 작은 벌레 개체군을 분석하는데 적합하지 않다는 것입니다. 그러나 음식의 존재가 감각 거동에 미치는 영향을 결정하는 적절한 제어가 수행되면, 보존 분석과 같이 웜의 공간 탐색 위치를 제한하기 위해 음식을 활용하는 것도이 설정으로 가능합니다. 또한,이 방법은 근접 및 소량의 대조군과 실험용 용액 방울을 사용하기 때문에 자극 구배 탐색을 연구하기위한 것이 아닙니다. 멀티 웜 추적 및 단일 웜의 특징 추출을 가능하게 향후 e_content &quot;&gt;, 프로그래밍 소프트웨어는이 시스템을 19, 20에 통합 할 수 있습니다. 이러한 반전 속도 및 제공 할 것입니다 신체 굴곡의 진폭 단일 웜 행동의 미묘한 행동의 매개 변수를 기록 인구 통계 학적 분석의 맥락에서 개별 웜의 chemosensory 행동에 대한보다 자세한 그림입니다. 또한 게이지 크기가 적절한 주사기 바늘을 사용하여 투자 수익 (ROI)을 통해 구멍을 뚫고 습지에 한천을 주입하여 습관을 연구 할 수 있습니다 실험 화합물 또는 대조군 완충액과 함께 사용하면 습관성 연구 중에 필요한 시간보다 긴 기록 시간에 걸쳐 화합물의 표면 농도를보다 일관되게 유지할 수 있습니다.이 방법의 또 다른 잠재적 응용은 다른 선충류 종에 대해 비교 행동 연구를 수행하는 것입니다. 또한, 행동 챔버multimodal 자극에 행동 반응을 연구하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. optogenetic 애플 리케이션을 위해, 높은 강도의 LED 배열은 분석 중에 관심 뉴런을 선택적으로 활성화하기 위해 카메라 마운트 옆에 부착 할 수 있습니다. 가열 요소, 냉각 시스템 및 온도 센서를 설치하여 감각 작용에 대한 온도 영향을 연구 할 수도 있습니다. 또한 냄새 전달 시스템을 냄새 감지 및 화학 감각 양상 간의 상호 작용을 조사하기 위해 챔버 내부에 설치할 수 있습니다.

먹이를 찾는 동물은 여러 감각 양식의 입력을 통합하고 환경을 성공적으로 탐색하기 위해 적절한 행동 전략을 선택해야합니다. 외부 감각 입력이 어떻게 받아 들여지고 행동 선택을 유도하기 위해 신경 정보로 변환되는지를 이해하는 것은 신경 생물학 분야의 핵심 목표입니다. 유 전적으로 다루기 쉬운 선충류 인 C. elegans 는 감각 생물학 및 다중 모달 통합에 바탕을 둔 신경 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 유기체입니다. C. 엘레 간 스는 302 개의 뉴런 만 가지고 있지만 용해성 화합물, 휘발성 냄새 물질 및 주위 온도 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7을 비롯한 다양한 환경 적 자극을 감지하고 구별 할 수 있습니다. 그만큼선충 류 C. elegans는 식량 원천을 현지화하고 잠재적 인 위협에 스스로를 경고하기 위해 화학 감각기구에 크게 의존합니다. 따라서 C. elegans 의 놀라운 감각 기능을 뒷받침하는 유전 적, 세포 적 및 신경 학적 메커니즘을 분석하는 데 야생형 및 돌연변이 C. elegans의 화학 자극에 대한 반응을 스크리닝하도록 설계된 행동 분석이 중요한 역할을합니다. 가용성 화합물에 대한 반응을 분석하기 위해 세 가지 유형의 분석법, 즉 낙하 시험, 화학 주성 분석 및 보유 분석이 설명되었습니다. 낙하 시험에서 화합물의 작은 방울이 움직이는 벌레의 꼬리에 놓이고 액체가 전방 감각기구에 도달하면 앞뒤로 움직이거나 앞으로 움직이려는 웜의 결정은 4 점 입니다. 낙하 테스트는 실험 준비가 거의 필요하지 않으며 레이저로 작동되는 웜의 경우처럼 웜의 샘플 크기가 작은 경우 유용합니다. 그러나 하나의 웜으로 만한 번에 분석 할 수 있으며 실험자가 분석 기간 동안 존재해야하며, 낙하 시험은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 드롭 테스트는 샘플 내의 각 웜 간의 드롭 전달의 변화에 ​​취약하기 때문에 분석의 전체 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 낙하 테스트의 또 다른 한계는 벌레의 전방 운동으로부터의 화합물의 매력적 또는 중립적 인 효과를 구분할 수 없으므로 혐오 성 화합물에 대한 웜의 반응을 분석하는 데에만 사용될 수 있다는 것입니다. 수용성 화합물의 화성 분석은 일반적으로 두 개의 대향하는 사분면 한천 및 다른 두 사분면 8,9 혼입 대조액 혼입 실험 용액을 네 개의 사분면으로 한천 플레이트를 분할하는 것을 포함한다. 분석의 시작에서 웜을 포함하는 방울의 방울을 플레이트의 중앙에 놓고 웜의 수를<html> 각 사분면은 다른 시점에서 채점됩니다. chemotaxis assay는 각 분석에서 많은 수의 웜이 테스트되기 때문에 낙하 테스트에 비해 더 큰 통계력을 제공합니다. 그러나,이 방법의 하나의 한계는 주 화성 검정 플레이트의 제조가 다량의 실험 화합물을 필요로한다는 것이다. 이것은 ascaroside signaling molecule 10 의 경우와 같이, 제한된 수율로 복잡한 정제 과정이 필요한 화합물을 얻기 위해 대규모 행동 스크린을 수행하는 것을 어렵게 만듭니다. 또한 분석을 통한 웜의 수동 계산은 오류의 영향을 받기 쉽고 계산 과정에서 판의 섭동이 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 앞에서 언급 한 두 가지 방법과 달리 보관 분석은 점수 계산 과정에서 오류를 최소화하고 분석 중에 실험자의 간섭을 줄이는 머신 비전을 사용합니다<html> &gt; 11. 웜 동작의 비디오 레코딩에 대한 전산화 된 분석은 득점이 몇 개의 개별 시간 지점에서만 수행 될 때 놓칠 수있는 미묘한 행동 동학을 잠재적으로 나타낼 수 있습니다. 보유 분석에서 두 개의 용액 반점이 작은 원형 세균성 식품 패치의 반대편에 추가되고 그 다음에 식품 패치 중간에 적은 수의 웜이 배치됩니다. 웜의 행동은 비디오 녹화, 분석 및 선호 지수 값은 각 솔루션 영역의 총 웜 픽셀 수를 기반으로 계산됩니다. 매력적인 식품 패치의 존재가 각 분석에서 웜의 작은 개체군을 사용할 수는 있지만, 음식은 이전에 용해 방지제 12에 대한 회피 거동을 민감하게하는 것으로 나타났습니다. 또한, 웜은 단파장 빛에 대한 광 반응성 반응을 나타내며 동작 기록 설정에서 백색광을 방출하는 현미경 광원의 사용은 동작에 영향을 줄 수 있습니다s = &quot;xref&quot;&gt; 13. 이 논문에서 논의 된 방법의 목적은 population-based assay를 사용하여 C. elegans의 가용성 화합물 선호도를 기록하고 분석하는 것이다. 이를 위해 현재의 방법은 이전에 논의 된 세 가지 방법 모두를 통합하고 개선합니다. 그것은 웜의 큰 개체군을 검사 할 수있게하며 각 분석에서 사용되는 실험 용액의 양은 단지 소량입니다. 또한이 분석은 적외선 LED 백라이트가있는 맞춤형 밀폐 된 동작 챔버 내에서 수행되어 짧은 파장의 빛이 동작에 미치는 영향을 최소화합니다. 각 챔버에는 벤치 공간을 손상시키지 않으면 서 실험 처리량을 증가시키는 여러 대의 현미경 카메라가 장착 될 수 있습니다. 마지막으로, 비디오 분석 소프트웨어는 각 비디오에 대한 선호 지수 값뿐만 아니라 시간 경과에 따른 인구 행동 역학을 시각화하기위한 웜 점유도 플롯을 출력합니다. 챔버 설정과ssay 프로토콜은 악취 물질 또는 온도가 화학 감각적 인 행동에 미치는 영향과 같은 다중 모달 행동 반응을 연구하도록 추가로 수정할 수 있습니다. 이 문서에서는 행동 챔버 및 분석 프로토콜의 구성에 대해 설명합니다. 또한 알려진 수용성 방수제 야생 형 웜 및 화학 감각 결함이있는 돌연변이, 구리 이온 4의 반응을 분석하는이 방법의 유용성을 보여줍니다. 마지막으로 제공된 소프트웨어를 사용한 비디오 분석 프로세스가 자세히 설명됩니다.

<table><tbody><tr><td>알루미늄 T-슬롯 프레이밍 압출</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T101</td><td>단일 프로필, 1" 크기, 솔리드</td></tr><tr><td>브래킷</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T236</td><td>1" 길이 1" 높이의 단일 프로필 돌출용</td></tr><tr><td>컴팩트 엔드피드 패스너</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T139</td><td>1" (단일), 4개 팩</td></tr><tr><td>트위스트인 솔리드 패널 홀더</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T251</td><td>1" 고압출</td></tr><tr><td>플라스틱 엔드 캡</td><td>McMaster-Carr</td><td>47065T91</td><td>1" 고압출</td></tr><tr><td>광학 투명 캐스트 아크릴 시트</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K211</td><td>3/16" 두께, 12" x 12"</td></tr> <tr><td>비닐 코팅 폴리에스터 직물</td><td>McMaster-Carr</td><td>88505K57</td><td>0.027" 두께, 61" 너비, 검은색</td></tr><tr><td>황동 그로밋</td><td>McMaster-Carr</td><td>9604K22</td><td>거래 크기 0, 0.545" 외경</td></tr><tr><td>강철 와셔</td><td>McMaster-Carr</td><td>90107A029</td><td>1/4" 나사 크기</td></tr><tr><td>둥근 머리 나사</td><td>McMaster-Carr</td><td>90272A546</td><td>1/4" - 20 나사 크기, 1 - 1/2" 길이</td></tr><tr><td>표준 작동 백라이트</td><td>스마트 비전 조명</td><td>현지 공급업체 보기</td><td>8" x 8", 적외선 850nm</td></tr><tr><td>IVP-C1 Variable Control Pot</td><td>Smart Vision Lights</td><td>현지 공급업체</td><td></td></tr><tr><td>보기 T1 전원 공급 장치</td><td>스마트 비전 조명</td><td>현지 공급업체</td><td></td></tr><tr><td>보기 Dino lite Pro AM4113T</td><td>Dino-Lite 디지털 현미경</td><td>현지 공급업체</td><td></td></tr><tr><td>보기 MS09B 현미경 스탠드</td><td>Dino-Lite 디지털 현미경</td> 현지 <td>공급업체</td><td></td> 보기</tr></tbody></table>

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

선충류 인 Caenorhabditis elegans 의 단지 302 개의 뉴런으로 이루어진 소형 신경계는 다양한 행동 레퍼토리의 기초가됩니다. 이러한 행동의 근간을 이루는 신경 회로의 해부를 촉진하기 위해 강건하고 재현 가능한 행동 분석법의 개발이 필요합니다. 이전의 C. 엘레 간스 행동 연구는 가용성 화합물에 대한 C. 엘레 간스 의 반응을 조사하기 위해 &quot;낙하 시험&quot;, &quot;화학 주성 분석&quot;및 &quot;보유 분석&quot;의 변형을 사용했습니다. 이 글에서 설명한 방법은 앞서 언급 한 세 가지 분석법의 보완적인 장점을 결합하고자합니다. 간단히 말해, 각 검정 플레이트의 중간에있는 작은 원은 컨트롤과 실험 솔루션이 번갈아 배치 된 4 개의 사분면으로 나뉩니다. 웜이 추가 된 후, 분석 플레이트는 동작 챔버로로드되어 현미경 카메라가 처리 된 영역과 웜의 만남을 기록합니다. 그런 다음 자동화 된 비디오 분석이 수행됩니다.각 비디오에 대한 선호 지수 (PI) 값이 생성된다. 이 방법의 비디오 수집 및 자동 분석 기능은 실험자의 개입 및 관련 오류를 최소화합니다. 또한, 실험 화합물의 소량은 분석 당 사용되며 행동 챔버의 멀티 카메라 설정은 실험 처리량을 증가시킵니다. 이 방법은 유전 적 돌연변이와 새로운 화합물의 행동 스크린을 수행하는 데 특히 유용합니다. 그러나,이 방법은 대조구와 실험 용액 영역의 근접성으로 인해 자극 구배 탐색을 연구하기에 적합하지 않습니다. 소규모의 웜 집단 만 사용할 수있는 경우에도 사용해서는 안됩니다. 현재 형태의 가용성 화합물에 대해서만 반응을 분석하는 데는 적합하지만,이 방법은 multimodal 감각 상호 작용 및 optogenetic 연구에 적합하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 선충류의 화학 감응 반응을 분석하기 위해 적용될 수있다. </p&gt;

그림 3A 는 서로 다른 유전자형 및 치료 pairings에 대한 선호 지수 값을 보여줍니다. 환경 설정 지수 값 1은 실험 투자 수익 (ROI)에있는 솔루션에 대한 강한 매력을 나타냅니다. 선호 지수 값 -1은 강한 반발력을 나타냅니다. M13 버퍼 용액을 대조 ROI와 실험 ROI에 둘 때 선호 지수 0.02를 얻었으므로 ROI 중 어느쪽으로도 공간 편향이 없음을 나타냅니다. N2 웜 강하게 구리 이온이 강한 방수제 (보충 영화 1) 4- 있다는 이전의 결과를 확증 -0.67의 우선 지수에 기인하는 구리 이온을 피했다. 감각 섬모의 원위 세그먼트의 적절한 형성을 부족 OSM-3 변이체, A는 유의 구리 이온 (PI = -0.19) (15)의 회피 감소 하였다. ocr-2 돌연변이 체는 de<html> 구리 회피를 비롯한 많은 ASH 매개 성 침해 수용체 반응에서의 fective는 구리 이온 (PI = 0.19) ( 보충 영화 2 ) 16에 대한 유의미한 감소 회피 및 심지어 약간의 인력도 보입니다. 그림 3B 는 대표적인 웜 점유도를 보여주는데, 이는 각 비디오에서 시간에 따른 대조군의 웜 밀도와 실험적 ROI를 나타냅니다. 작도 영역의 색상이 어두울수록 ROI의 웜 픽셀 수는 커집니다. M13 완충액 대조군으로 처리 된 N2 웜에 대한 점유율 그래프는 두 ROI의 웜 수가 분석 전반에 걸쳐 유사 함을 보여줍니다. 그러나 구리 이온으로 처리 된 N2 웜의 점유 면적은 웜이 분석을 통해 실험 ROI를 강력하고 일관되게 피할 수 있음을 나타냅니다. gimg &quot;src =&quot;/ files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : Behavior Chamber Design의 사진 및 도식 표현. ( A ) 행동 챔버 설치의 정면도 (왼쪽)와 챔버 프레임의 상응하는 개략도 (오른쪽). 불투명 한 폴리 에스테르 시트는 바닥면을 제외한 모든면에 챔버를 둘러싸고있어 적외선 백라이트 패널을 통해 빛을 통과시킵니다. 숫자 1, 2 및 3은 (B)의 압출 레이어에 해당합니다. ( B ) 행동 챔버 프레임을 구성하는 압출 층의 평면도. 여기에는 상단 레이어 (1), 중간 카메라 마운트 어셈블리 레이어 (2) 및 하단 스테이지 레이어 (3)가 포함됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; 그림 2 : 솔루션 배치 및 플레이트 정렬 템플리트. ( A ) 솔루션 배치 템플릿에는 4 개의 사분면과 번호 정렬 표식이 있습니다. 대조 용액은 좌상 사상 및 우상 사분면에 놓고 실험 용액은 우상 및 좌하 사분면에 놓습니다. ( B ) 플레이트 정렬 템플릿은 비디오 레코딩 및 분석 동안 시야에서 웜의 폐색을 최소화하는 번호 정렬 마커 만 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> 그림 3 :이 분석을 사용하여 수집 된 데이터의 예. ( A ) 야생형 N2 및 C. elegans에 대한 특이도 (PI) 값 </e<html> M13 버퍼와 10mM의 CuCl 대 (2)에 응답하여 m&gt;. N2 웜은 M13 대조군 용액을 두 ROI에 모두 넣었을 때 대조군과 실험적 ROI 사이에 아무런 선호도를 나타내지 않았지만 구리 이온을 넣었을 때 실험적 ROI를 크게 피할 수있었습니다 (각각 PI = 0.02 및 -0.67). osm-3 (p802) 돌연변이와 ocr-2 (ak47) 돌연변이는 N2에 비해 구리 이온 회피가 유의하게 감소했다 (PI = -0.1 및 0.2). 각 유전자형 - 치료 쌍에 대해 N = 6 분석, 분석 당 360 벌레 이상, 오차 막대는 ± 1 SEM, *** p &lt;0.001, 일원 분산 분석 후 사후 Tukey 정직한 유의 차 (HSD) 검정이 뒤 따른다. ( B ) 대조 ROI에 M13 버퍼가 있고 실험 ROI에 구리 이온 (아래)이있는 N2 웜과 ROI 모두에서 M13 버퍼가있는 N2 웜에 대한 대표적인 웜 점유율입니다. 각 점유도 아래의 색상 스케일은 웜 픽셀 수를 나타냅니다.pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 영화 1 : 10 mM 구리 염화물에 대한 N2 웜의 행동 반응. 웜은 M13 버퍼 (왼쪽 위와 오른쪽 아래)가있는 컨트롤 사분면에 끌 리지만 M13 버퍼에 용해 된 구리 이온을 포함하는 사분면 (오른쪽 위 및 왼쪽 아래)을 강하게 피합니다. 비디오는 초당 1 프레임으로 기록되었으며 속도는 15 배 빨라졌습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 영화 2 : 10 mM 구리 염화물에 대한 ocr-2 (ak47) 벌레 의 행동 반응 . 웜은 M13 버퍼 (왼쪽 위와 오른쪽 아래)와 사분면을 가진 컨트롤 사분면에서 대략 동일한 정도로 로밍합니다M13 버퍼에 녹아있는 구리 이온 (오른쪽 위와 왼쪽 아래)이 기록 기간 동안 지속된다. 돌연변이 체는 녹음 시작시 구리 이온을 함유 한 사분면에 대해 약간의 선호도를 나타낸다. 비디오는 초당 1 프레임으로 기록되었으며 속도는 15 배 빨라졌습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 : 솔루션 배치 및 플레이트 정렬 템플리트. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 인구 기반 분석에서 가용성 화합물에 대한 선충류 인 Caenorhabditis elegans 의 선호도를 자동 분석 할 수있는 행동 기록 설정 및 프로토콜을 제시합니다. 이 기사에서는 비헤이비어 챔버의 구성, 동작 분석 프로토콜 및 비디오 분석 소프트웨어 사용에 대해 설명합니다.

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

본 행동 기록 설정 및 프로토콜의 전반적인 목표는 다중 카메라 비디오 획득 시스템과 후속 자동 비디오 분석을 사용하여 수용성 화합물에 대한 C. elegans 집단 기반의 화학 감각 선호도를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 유전자 변이체에 대해 더 빠르고 표준화된 행동 분석을 가능하게 함으로써 C. elegans 신경생물학 연구를 촉진할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수용성 신호에 대한 선충 집단 반응의 시간적 역동성을 모니터링하는 동시에, 동일한 조건 하에서 여러 반복 실험을 동시에 분석할 수 있다는 점입니다.행동 챔버 조립 시연은 본 연구실의 스태프 사이언티스트인 Christopher Cronin이 진행하겠습니다. 먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 패브릭 커버, 카메라 마운트 바, 코너 브래킷, 압출 바 및 카메라 마운트 어셈블리를 준비하십시오. 센터 바에 연결된 엔드 바로 시작하여, 카메라 스탠드와 홀스터를 카메라 마운트 어셈블리에 부착하십시오.다음으로, 행동 챔버 프레임을 조립합니다. 먼저 4개의 1피트 압출 알루미늄 바를 정사각형 폴리에스터 시트에 부착합니다. 바 하나를 패브릭 시트의 T-너트 2개에 밀어 넣어, 바가 패브릭 너비의 중앙에 오도록 맞춥니다.패스너를 조여 직물 시트를 각 바에 고정합니다. 사각형 폴리에스테르 시트를 작업 표면에 펼치고, 부착된 4개의 알루미늄 바를 그 위에 놓습니다. 그다음, 4개 알루미늄 바의 상단 표면에 코너 브래킷 8개를 각 바의 양 끝에 하나씩 끼웁니다.코너 브래킷의 수직 다리가 바의 끝부분과 일치하도록 바 위에 배치한 후, T-너트에 나사를 조여 고정합니다. 각 모서리에 1 foot 길이의 알루미늄 압출재를 수직으로 세우고, 두 코너 브래킷 다리에 있는 T-너트 위로 압출재를 끼웁니다. 그런 다음, 패스너를 조여 수직 바를 수평 바에 고정함으로써 인접한 두 수평 바를 연결합니다.H자형 카메라 마운트 어셈블리의 헐거운 T-너트를 프레임의 수직 지지대 아래로 밀어 넣으십시오. H자형 마운트가 프레임 각 모서리의 코너 브라켓 위에 닿을 때까지 완전히 내려가게 하십시오. 4개의 코너 브라켓 나사를 조여 카메라 마운트 어셈블리를 제자리에 고정하십시오.다음으로, 마지막 1피트 길이의 알루미늄 압출 바 4개를 사용하여 챔버의 하단 레이어를 조립합니다. 코너 브래킷의 다리 부분이 바의 끝단과 일직선이 되도록 배치하고 나사를 조여 고정합니다. 그런 다음, 프레임 수직 지지대의 채널에 T-너트가 느슨하게 들어간 상태로 바를 수직 지지대 사이로 밀어 넣습니다.코너 브래킷의 상단 가장자리가 수직 지지대의 열린 끝단에서 1인치 아래에 오도록 바를 배치하고, 코너 브래킷 나사를 조여 고정합니다. 다음으로, 4장의 직사각형 폴리에스테르 시트의 T-너트를 수직 압출 바의 채널 아래로 밀어 넣어 챔버의 측면을 덮고, 고정 장치를 조여 고정합니다. 챔버 내부로 접근하기 위한 도어로 사용할 한쪽 면을 선택하고, 챔버 하단 층에 있는 나사 2개와 T-너트를 제거합니다.완성된 프레임의 다리 역할을 하도록 각 모서리의 상단 끝에 플라스틱 캡을 씌웁니다. 프레임을 똑바로 세우고 프레임 공간 층 내부에 슬라이드당 2개의 패널 홀더를 삽입한 후, 돌려서 고정합니다. 그런 다음, 분석 플레이트를 놓을 스테이지가 되도록 패널 홀더 위에 12 by 12 inch 크기의 투명 아크릴 조각을 올립니다.마지막으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 카메라와 스테이지 템플릿을 배치합니다. 실험 전날, 28개의 빈 35 millimeter 플레이트를 평평한 표면에 5개 이하씩 쌓아 둡니다. 각 분석 플레이트에 5 milliliters의 nematode growth media agar를 채우고, 뚜껑을 연 상태로 똑바로 세워 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다.실험 당일에 백라이트를 켜고, 컴퓨터를 부팅한 후 현미경 카메라의 비디오 캡처 소프트웨어를 실행합니다. 현미경 카메라를 컴퓨터에 연결하고 소프트웨어 창 상단에 있는 번호가 매겨진 카메라 썸네일을 클릭하여 카메라의 라이브 피드를 확인합니다. 비디오 녹화 설정을 조정하려면 카메라 피드 왼쪽 상단의 비디오 형식 메뉴를 내려 MJPG 1280x1024를 선택합니다.다음으로, 비디오 형식 메뉴 옆의 폴더 메뉴를 내려 비디오 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. 카메라 피드의 오른쪽 상단에 있는 자동 노출 아이콘을 클릭하여 자동 노출 기능을 끕니다. 그런 다음, 자동 노출 아이콘 바로 오른쪽에 있는 LED 아이콘을 클릭하여 내장 현미경 카메라 LED를 끕니다.인접한 설정 아이콘을 클릭하고 monochrome을 선택하십시오. 대비를 최대화하고 밝기를 조정하십시오. 스테이지 플레이트 정렬 템플릿 위에 용액 배치 템플릿을 맞춘 다음, 카메라 피드 왼쪽에 있는 타임랩스 비디오 녹화 아이콘을 클릭하십시오.초당 1프레임의 속도로 5초 동안의 보정 영상을 촬영하기 위해 지속 시간은 5초, 간격은 1초로 입력합니다. 5 mL 유리 피펫을 사용하여 동기화된 벌레가 들어 있는 플레이트에 nematode growth media 버퍼 1.2 mL를 추가하고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 벌레들이 버퍼 속으로 섞이게 합니다. 플레이트에서 버퍼를 피펫으로 빨아들여 버퍼에 포함된 벌레들을 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다.벌레들이 바닥에 가라앉을 수 있도록 튜브를 1~2분 동안 그대로 둡니다. 그 다음, 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 튜브 바닥에 응집된 벌레 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 튜브 내의 세척 버퍼를 최대한 제거합니다. 튜브에 깨끗한 nematode growth media 버퍼 1 mL를 다시 채우고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.다음으로, 해부 현미경 스테이지 상단에 용액 배치 템플릿을 테이프로 고정합니다. 그런 다음, 플레이트 정렬 템플릿의 양쪽에 양면테이프 조각을 붙입니다. 어세이 플레이트의 외곽을 플레이트 정렬 템플릿의 원과 맞춘 후, 템플릿이 플레이트 바닥에 밀착될 때까지 누릅니다.그런 다음, 해부 현미경 상에서 분석 플레이트 템플릿 구성 요소의 마커를 용액 배치 템플릿 구성 요소의 마커에 맞춥니다. 이어서, P2 피펫을 사용하여 1사분면과 4사분면에 M13 buffer를 각각 1 µL씩 분주합니다. 새 팁을 사용하여 2사분면과 3사분면에 10 mM CuCl2 용액을 각각 1 µL씩 분주합니다.용액 방울이 한천에 완전히 흡수되면, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세척된 벌레를 분석 플레이트로 옮깁니다. 원형 처리 영역의 위쪽과 아래쪽 구역에 벌레 방울을 떨어뜨립니다. 조직을 네 번 접고 뭉툭한 모서리를 사용하여 분석 플레이트 위의 과잉 세척 완충액을 흡수합니다.템플릿 모서리의 숫자를 맞추어 행동 챔버 내 현미경 카메라 아래에 분석 플레이트를 즉시 배치하십시오. 벌레들이 분석 플레이트에 적응할 수 있도록 2~3분 동안 기다립니다. 그런 다음, 카메라 피드의 왼쪽에 있는 타임랩스 비디오 녹화 아이콘을 클릭하고, 지속 시간에 10분, 간격에 1초를 입력하여 초당 1프레임으로 10분 동안 비디오를 녹화하십시오.마지막으로 'start'를 클릭하여 비디오 녹화를 시작합니다. 각 비디오 프레임에 대해, 선호도 지수 함수는 각 관심 영역 내의 벌레 픽셀 수를 세고, 관심 영역의 전체 픽셀 수 중 해당 픽셀이 차지하는 비율을 계산합니다. 서로 다른 유전자형 및 처리 조합에 대해 얻은 선호도 지수 값이 여기에 표시됩니다.양수의 선호도 지수 값은 처리 조건에 대한 끌림을 나타내며, 음수의 선호도 지수 값은 거부 반응을 나타냅니다. 대조군과 실험군 관심 영역 모두에 M13 완충액을 배치했을 때 0.02의 선호도 지수가 얻어졌으며, 이는 공간적 편향이 없음을 입증합니다. 또한 이 그래프는 N2 벌레가 구리 이온을 강력하게 회피하여 0.67의 선호도 지수가 나타났음을 보여줍니다.또한, 감각 섬모 형성에 결함이 있는 osm-3와 ASH 매개 통각 반응에 결함이 있는 ocr-2 돌연변이체는 구리 이온에 대해 회피 반응이 감소하였으며 일부에서는 경미한 유인 반응까지 나타냈습니다. 본 프로토콜을 수행할 때는 신속하면서도 부드럽고 일관되게 작업하는 것이 중요합니다. 기록 설정 및 분석 프로토콜은 서로 다른 C. elegans 감각 변이체 간의 상호작용으로 인해 발생하는 집단 기반 행동 반응을 특성화하는 데 쉽게 응용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

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학습하세요 Caenorhabditis elegans의 화학 감응도 선호 분석을 위한 자동화된 행동 기록 설정과 프로토콜을 통해 신경생물학 연구를 가속화하는 방법을 배우세요. 다중 카메라 비디오 획득 시스템과 자동 분석 소프트웨어를 사용하여 유전자 돌연변이체의 표준화된 행동 분석을 수행할 수 있습니다.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

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