Name: 교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 성체 마우스 DRG 뉴런을 이용한 축삭 재생의 유전 연구 방법입니다. 전기천공법으로 유전자 조작 후 현미경 분석으로 축삭 재생을 평가하는 이 기술은 기능 상실 연구에 유용합니다.

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이 작품은 NIH (R01NS064288)와 크레이그 H. Neilsen 재단 FZ의 보조금에 의해 지원되었다.

1. Coverslips, 문화 매체, 및 소화 효소의 작성 <ol><li> 12-mm 라운드 # 1 유리 coverslips이의 연결을 문화를 위해 사용됩니다. 10 % HCL은 하룻밤 사이에 3 회 (20 분 / 시간)에 증류수와 탈이온수와 초음파 세척을 다음과 coverslips가 청소됩니다. 청소 coverslips는 향후 사용을위한 70 %의 에탄올에 저장됩니다. 각 실험 전에 coverslips는 공기가 문화 판으로 건조와 배치됩니다. </li><li> 코트에 마른 coverslips, 100 μg / ML 폴리-D-라이신 및 10 μg / ML Laminin 작업 솔루션을 포함하는 코팅 용액을 100 μl은 각 coverslip 위에 추가되고 문화 판은 37 ° C 배양기로 전송됩니다. 1-2 시간 후에 코팅 용액이 제거되고 coverslips는 무균 1X PBS로 3 회 씻어하고 있습니다. </li><li> 문화 매체, 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하는 것은 5퍼센트 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 1X-스트렙토 마이신 솔루션 (penicil 500 단위로 보충된다린 및 스트렙토 마이신 500 μg), 1X GlutaMAX - 나 보충 및 antimitotic의 시약은 20 μm의를 포함하는 5 - 플루오로 -2 - deoxyuridine 및 20 μm의 유리딘 (FDU / R). 혈청이없는 배지의 경우 FBS가 보충 B27로 바뀝니다. </li><li> collagenase이 솔루션은 1 밀리그램 / ML의 작동 농도를 만들기 위해 collagenase에게 MEM과 분말을 해소하여 준비가되어 있습니다. 트립신은 1X TrypLE 익스프레스가 사용됩니다. </li></ol> 2. 성인 마우스 DRG의 신경의 해부와 수확 <ol><li> 6 euthanizing 후 - 10 주 된 성인 마우스로, 지느러미 피부를 제거하고 전체 척추를 잘라. 1 X PBS ~ 3 배로 제거된 척추 씻으십시오. </li><li> 복부 측면까지와 해부 접시에 제거된 척수 열을 핀과 조심스럽게 해부 현미경으로 감각 신경을 폭로하기 위해 근육을 제거합니다. 목재 수준에서 DRGs에 연결된 신경을 찾아낼 두꺼운하​​고 쉽습니다. 따라서 대부분의 실험을위한 요추에만DRGs가 수확됩니다. </li><li> 작은 가위로 중심선을 따라 각 척추골로 잘라 조심스럽게 척추 디스크를 제거합니다. 척수를 노출 각 척추골을 분할하기 위해 집게를 사용하여. </li><li> 목재 DRGs를 해부하려면 포셉 각 목재 용기를 들어 관련 허리 DRGs을 (L1에서 L6까지) 찾습니다 척수쪽으로 추적. </li><li> 첨부 말초 신경, 스프링 가위로 지느러미와 복부 뿌리에서 각 DRG를 자르면 얼음에 위치 MEM 매체와 microfuge 튜브에 저장합니다. 다른 척수 수준 (예 : 흉부 DRGs)에서 더 많은 DRGs는 유사한 방법으로 필요한 경우에 해부를 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 소화와 성인 마우스 DRG의 신경 세포의 분리 <ol><li> 모든 해부 DRGs를 수집 후, 1 ML의 collagenase 솔루션 MEM 미디어를 교체하고 90 분 동안 37 ° C에서 microfuge 튜브를 품어. </li><li> 그래서 500 μl 1X TrypLE 익스프레스와 collagenase 용액 교체37 lution하고 품어 ° C에서 15-20 분. </li><li> TrypLE 익스프레스 솔루션을 제거하고 3 회 1 ML 준비한 배지 (5 % FBS를 포함)로 DRGs 씻는다. </li><li> 600 μl 배지를 추가하고 부드럽게 한 ML 파란색을 사용하여 20-30 회 조직을 씹다 아래로까지 피펫 및 피펫 팁은 졸업했습니다. </li><li> 분쇄 후 비 dissociated 조직은 microfuge 하단으로 정착하고 10 ML 멸균 튜브에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. 또 600 μl 배지를 추가하고 대부분의 조직은 dissociated 때까지 분쇄 단계를 반복하십시오. 얻은 세포 현탁액은 뉴런과 비의 연결 세포가 모두 포함되어 있습니다. 대부분의 경우, 6 DRGs (~ 5 x10 4)에서 세포 하나 electroporation 반응에 사용됩니다. </li></ol> 4. Electroporation을 통한 신경 세포의 유전자 조작 <ol><li> 의 DNA plasmids (~ 10 μg으로 마우스 뉴런에 대한 Amaxa의 nucleofection 솔루션을 혼합하여 transfection 솔루션을 준비) 나 siRNA를 oligos이 (~ 0.2 nmol) 각 transfection 100 μl의 최종 볼륨을 만들 수 있습니다. </li><li> 상온에서 7 분을위한 680 rpm으로 dissociated 세포를 원심 분리기, 그리고 가능한 한 많이 뜨는 버리고. 준비된 transfection 솔루션을 추가하고 부드럽게 다시 중단 전지 200 μl 피펫 팁으로 3-4 회를 아래로 피펫합니다. </li><li> electroporation의 cuvette에 transfection 솔루션과 혼합 세포 현탁액을 전송하고 Amaxa Nucleofector 시스템 프로그램 G-013을 사용하여 세포를 electroporate. </li><li> electroporation 후 즉시 사전 예열 500 μl를 추가 (37 ℃) cuvette하여 원하는 세포 밀도에 코팅된 배양 접시에 모든 솔루션 (~ 600 μl)를 전송에 FBS를 포함한 배지. 다시 정지하고 다시 도금을 필요로 실험 내용은 뉴런은 고밀도 (10000-20000 세포 /도)에서 플라스틱 배양 접시에 직접 배양해 있습니다. 직접 축삭의 성장을 검사 실험 내용은 뉴런은 도금 ont 있습니다낮은 밀도 (3000-5000 세포 / 음)로 코팅된 유리 coverslips을 O. 배양기 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 문화 접시를 놓습니다. </li><li> 뉴런은 기판에 부착했을 때 도금 후 네 시간은 부드럽게 500 μl 신선하고 사전 예열 문화 매체와 문화 매체 (Amaxa의 nucleofection 솔루션을 포함) 교체, 그리고 (37 ° C에서 추가적인 문화를 위해 배양기에 플레이트를 반환 , 5 %) 2 공동. FBS를 포함하는 두 문화 매체 또는 혈청이없는 매체는이 단계에서 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 축삭의 성장 분석을위한 Culturing 성인 DRG 뉴런 <ol><li> 의 DNA plasmids으로 transfected 뉴런 들면, 유전자의 - 관심의 표현 (예 EGFP) electroporation 후 몇 시간 일찍 볼 수 있습니다. siRNAs로 transfected 뉴런의 경우, 우리는 일반적으로 내생 단백질의 충분한 파괴를 허용하도록 3~4일 기다립니다. 교양 뉴런은 직접 vario에서 축삭의 성장 분석에 해결할 수 있습니다우리에게 시간은 포인트 (1-4일 electroporation 이후)하거나 다시 중단 및 축삭 regrowth를 (아래) 분석을 다시 도금. </li><li> RNAi - 중재 손실 기능 연구의 경우 교양 뉴런이 다시 정지 수 있으며 axons은 타겟 단백질이 이미 소진되는 뉴런에서 regrow 수 있도록 다시 도금. 이렇게하려면 문화 판에서 연결된 뉴런을 다시 정지를 6-10 번 1 ML 미리 예열 신선한 매체와 피펫 부드럽게 위아래로 고밀도 교양 뉴런의 옛 문화 매체를 교체하십시오. 이외의 연결을 세포 (예 Schwann 세포) 뉴런보다 문화 접시에 많은 어깨를 첨부하기 때문에 다시 중단 전지는 주로 뉴런 있습니다. </li><li> microfuge 튜브로 다시 정지 뉴런을 전송하고 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 세포 대단히 짧은 시간을 다시 떼어 놓다하기 10-15 번 씹다. </li><li> 저밀도 (3000-5000 세포 / 음)과 문화를 하루아침에 새롭게 준비 coverslips쪽으로 재 판 다시 dissociated 뉴런 (16-24 시간). </li></ol> 6. 고정, Immuno-염색법과 형광 이미징 <ol><li> 매체를 대기음하고 실온 15-20 분 세포를 해결하기 위해 4 % paraformaldehyde (PFA) (물론 200 μl /)를 추가합니다. 고정된 세포 그러면 3 회 대한 1X PBS로 씻어 있습니다. </li><li> PBS를 대기음하고 실온에서 60 분 대한 고정 뉴런에 차단 솔루션 (1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 및 1X PBS에 2.0 % 정상 염소 혈청)을 추가합니다. </li><li> 라벨 axons에게, 뉴런 안티 neurofilaments 또는 방지 βIII tubulin 항체와 immuno-묻은입니다. 이렇게하려면 각 coverslip에 대한 parafilm에 대한 일차 항체 용액 (-βIII의 tubulin 항체에 대한 1:1200 희석)의 30μl 방울을 넣으십시오. coverslips를 반전하고 실온에서 60 분 동안 일차 항체 용액에 넣어. </li><li> 원래 문화 판에 coverslips 반환하고 3 번을 1X PBS로 그들을 씻는다. </li><li> 보조에 대해 동일한 절차를 반복합니다tibody. </li><li> 3 회 동안 증류수로 coverslips 씻어 다음 마운팅 솔루션 (예 : 골드 Antifade을 연장)와 함께 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다. </li><li> 스테인드 뉴런은 디지털 카메라가 설치된 모든 형광 현미경 시스템과 몇 군데하실 수 있습니다. 축삭의 길이는 측정 및 이미징 분석 소프트웨어로 분석된다. </li></ol> 7. 대표 결과 모든 부가 세포 성장 인자의 부재에서, 성인 DRG의 뉴런은 보통 첫번째 도금 후 axons 48 시간 재배를 시작합니다. axons은 종종 측쇄 morphologies를 (그림 1)를 보여줍니다. 대조적으로 다시 도금 뉴런은 도금 후 axons에게 단 몇 시간을 연장하기 시작하고 axons는 훨씬 줄어들 분기 (그림 2)와 함께 연장하다. 이러한 결과는 다시 도금 뉴런은 에어컨 lesioned 뉴런의 사람들에게 유사한 속성을 공유하는 것이 좋습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 최근 수행한 손실에게의 기능은 체외 연구에서 성인 DRG 뉴런의 축삭의 성장에서 축삭 재생 관련된 전사 인자 C-6월의 역할을 검토합니다. 결과는 C-6월의 다른 지역 (ON-TARGETplus) 대상으로 4 개의 siRNAs의 그룹의 electroporation은 현저하게 (그림 3) 삼일 transfection 후 성인 DRG의 뉴런에서 9 C-6월의 단백질 수준을 감소했다. 9 :; C-6월의 최저의 뉴런에서 뉴런들이 다시 도금 및 교양 있었다 하룻밤, 축삭의 성장이 크게 (262.32 ± 15.69 μm의, 그림 3시-C-6월 348.37 ± 16.21mm 제어) 감소했다. 이러한 결과는 그 교양 성인 DRG의 뉴런은 성인 뉴런의 축삭의 성장을 공부하는 유용한 모델 시스템을 제공 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> 그림 1. 성인 마우스 DRG의 뉴런은 3 일 동안 저밀도에서 배양해. 뉴런은 안티 물들일되었습니다 - 식사와 침대ETA, III의 tubulin 항체. 대부분 axons는 측쇄 morphologies 표시합니다. 스케일 바 : 125 μm의. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> 그림 2. 문화 3 일 후에 신경을 DRG 다시 도금 성인 마우스. () 성인 DRG의 뉴런은 3 일 동안 고밀도로 배양해. (B) 재 도금 성인 DRG의 뉴런은 하룻밤을위한 저밀도에서 배양해되었다. 대부분의 축삭은 작은 축삭 분기와 길쭉한 morphologies를 표시합니다. 스케일 바 : B에 A와 125 μm의 250 μm의 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> 그림 3. 체외에서 성인 DRG의 신경 세포의 축삭의 성장에 C-6월의 역할. C-6월 siRNAs의 electroporation 후 뉴런을 DRG 성인 마우스에서 C-6월의 () 서양 얼룩 분석. 그 결과 C-6월의 현저하게 감소 수준을 보여줍니다. (B) EGFP로 transfected 제어 뉴런은 다시 도금 및 야간 문화 후에도 긴 axons 자랐습니다. (C) 공동 트랜스C-6월 siRNAs하고 다시 도금 및 야간 문화가 후에 성인이 DRG 뉴런에서 EGFP 장애의 축삭의 성장 fection. 빨간색 : Tuj-1 염색법, 녹색 : EGFP. 스케일 바 : 125 μm의. 이러한 결과는 Saijilafu 외 년에 출판되었습니다. 9.

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<li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li>
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<li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16(2002).</li>
<li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li>
<li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53(2010).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

성인 DRG의 뉴런 이렇게 어른 동물로 축삭 재생을 연구하는 유용한 시스템을 제공 robustly 생체내 및 시험 관내에서 말초 신경 손상 후 자신의 axons을 다시 생성. 성인 DRG의 신경 세포의 체외 배양에서 분자 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이되고있는 작품 축삭 재생이 규제된다. culturing 성인 마우스 DRG 뉴런의 체외 프로 시저에 현재 재생 축삭 성장의 신속하고 효과적인 유전자 연구를 가능하게 표현했습니다. 그것이 axons가 타겟 단백질이 이미 소진되어있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있기 때문에 재 정지하고 다시 도금 절차 손실 기능 연구에 특히 유용합니다. 또한, 다시 도금 교양 DRG의 뉴런 따라서 체외에서 축삭 재생을 연구하는 많은 생리적 관련성 접근 방법을 제공 생체내 컨디셔닝 병변 효력을 모방한 것이었 지요. 성인 DRG ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 브롬화 수 소산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5 - 플루오로 -2 - deoxyuridine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> 유리딘 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 로슈 </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE 익스프레스 </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX - 나 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> 유리 coverslips (# 1) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24도 세포 배양 플레이트 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040 - 이력서 </td></tr><tr><td> 멸균, 증류수 및 탈이온수 </td><td> Mediatech </td><td> 25-055 - 이력서 </td></tr><tr><td> 마우스 뉴런 Nucleofector와 electroporation 키트 </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> C-6월에 대한 ON-TARGETplus siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> 안티 - βIII tubulin 항체 (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> 골드 Antifade 마운팅 솔루션을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

이곳은 중추 신경계 (CNS)에서 성숙한 뉴런이 성숙 CNS의 1,2의 축삭의 성장과 적대적인 환경을 지원하는 줄었 본질적인 기능으로 인해 부상 후 자신의 axons을 다시 생성 수 없다고 알려져있다. 반대로, 말초 신경 계통의 성숙한 뉴런 (PNS)는 부상 3 후 즉시 재생. 성인 지느러미 루트 신경절 (DRG) 뉴런이 잘 말초 신경 부상 후 robustly 재생하는 것으로 알려져 있습니다. 주변 목표 및 척수쪽으로 뻗어 있고 중앙 지점 innervating 말초 지점 : 각 DRG 신경 세포는 세포 소마의 어느 지점이 axonal 가지로 하나 축삭을 자랍니다. 실질적인 축삭 재생의 DRG 주변 axons 결과의 부상은 척수 중앙 axons 반면 부상 이후 저조한 재생. 주변 axonal 부상 척수 부상 (프로세스 조절 장애라고도 함), 중앙 axons의 중생 이전에 발생하는 경우에는 greatl입니다y는 4 개선. 또한, DRG 뉴런의 중심 axons은 척수에 corticospinal의 axons 내림차순 같은 적대적인 환경을 공유할 수 있습니다. 함께, 그것은 성인 DRG의 신경 세포의 축삭 재생을 제어하는​​ 분자 메커니즘은 CNS의 축삭 재생을 향상시키기 위해 무력화 할 수있는 가상있다. 그 결과, 성인 DRG의 뉴런은 현재 폭넓게 재생 축삭의 성장은 5-7 공부를 모델 시스템으로 사용됩니다. 여기에서 우리는 체외에서 축삭 재생의 유전 연구에 사용할 수있는 성인 DRG 신경 세포 문화의 방법을 설명합니다. 이 모델의 성인에서는 DRG의 신경 세포는 유전자 electroporation-매개 유전자 transfection 6,8 통해 조작됩니다. DNA를 플라스미드 또는시 / shRNA, 이러한 방식은 성인 DRG의 뉴런의 축삭의 성장에있는 유전자의 이익의 역할을 조사하기 위해 모두 이득과 손실 함수 실험을 수있는 뉴런을 transfecting함으로써. 뉴런은시 / shRNA으로 transfected 때, 타겟 내생 단백질입니다일반적으로 손실 기능 연구가 덜 효과​​적으로 만드는, 시간 강력한 축삭의 성장 이미 문제가 발생한 기간 동안 문화 3-4일, 후에 고갈. 이 문제를 해결하기 위해서 여기 설명한 방법은 axons가 타겟 단백질의 부재에있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있도록 transfection 후 다시 중지하고 다시 도금 단계가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 성인 DRG 뉴런 9 축삭의 성장을 중재로 축삭 재생 - 관련 유전자, C-6월의 역할을 공부 체외 모델에서 이것을 사용하는 예제를 제공합니다.

<em&gt; 체외에서</em교양 성인 마우스 지느러미 루트 신경절의 신경 세포를 사용하여 축삭 재생의 유전자 연구&gt; 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 조작을받은 뉴런의 축삭의 재 성장을 허용하는 re-suspension/re-plating 단계를 포함합니다. 이 방법은 RNAi 기반의 단백질 분해를 사용하여 축삭 재생의 손실 기능 연구에 특히 유용합니다.

중추신경계(CNS)의 성숙한 뉴런은 내재적 능력의 저하로 인해 손상 후 축삭을 재생할 수 없다는 사실이 잘 알려져 있습니다...

본 절차의 전반적인 목표는 성체 후근신경절(dorsal root ganglion) 뉴런 또는 DRG 뉴런을 사용하여 포유류 축삭 재생 연구를 위한 인비트로(in vitro) 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 마우스에서 DRG를 적출한 후, 이를 단일 세포로 해리합니다. 그 다음 해리된 뉴런을 전기천공법으로 형질전환시키고 며칠 동안 배양하여 유전자 발현을 유전학적으로 조작합니다.마지막 단계는 뉴런을 재현탁하고 재팽창시켜 하룻밤 동안 추가 배양하는 것입니다. 최종적으로, 현미경 기반의 축삭 길이 분석을 통해 유전적으로 조작된 뉴런의 축삭 재성장을 연구합니다. 이 기술에서 사용되는 세포 재현탁 및 반복 단계의 주요 장점은 이미 유전적 조작이 이루어진 뉴런의 축삭 성장을 분석할 수 있다는 점입니다.이 기술은 RNI 접근법을 사용하여 관심 유전자의 발현을 억제하는 기능 상실 연구에 특히 유용하며, 본 절차는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Dr.Sfu가 시연할 것입니다. 신경세포 배양용 커버슬립을 준비하려면, 먼저 10% hydrochloric acid에 하룻밤 동안 담가 두십시오. 다음 날, 증류수에서 1시간 동안 초음파 세척을 수행하십시오.세척된 커버슬립을 70% ethanol에 20분씩 세 차례 담가 보관하고, 사용 전 공기 중에서 건조시킵니다. 다음으로 건조된 커버슬립을 코팅합니다. 멀티웰 플레이트의 각 웰에 커버슬립 한 장과 100 µL의 코팅 용액을 넣습니다.플레이트를 흔들지 않은 상태로 37°C에서 1~2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 코팅 용액을 제거하고 커버슬립을 멸균된 1X PBS로 3회 세척합니다. 통증 반응이 없는 전신 마취된 6~10주령의 성체 마우스를 희생시킨 후,먼저, 등 쪽 피부를 제거합니다. 둘째, 부착된 조직을 포함하여 목부터 꼬리까지의 모든 척추를 절단하여 분리합니다. 마지막으로, 조직 내부에 부착된 모든 내부 장기를 제거합니다.제거한 척주를 1XPBS로 2~3회 헹군 후, 복측이 위로 오도록 해부판에 고정합니다. 감각 신경이 드러나도록 근육을 조심스럽게 제거합니다. 요추 수준에서 DRG에 연결된 신경들이 가장 굵으며 쉽게 찾을 수 있습니다.따라서 대부분의 실험에서는 요수 DRG만을 채취합니다. 작은 가위로 각 척추의 중앙선을 따라 절개하고, 추간판을 조심스럽게 제거하여 척추체를 분리합니다. L1부터 시작하여 포셉을 이용해 각 척추를 벌리고 요수 DRG를 해부하여 적출

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는, 우리는 함께 축삭의 성장에 glial 세포 이질의 영향을 연구하는 새로운 방법을...

새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

출처: Cheah, M., et al. 등뿌리 신경절 주사(Dorsal Root Ganglion Injection)와 등뿌리 크러시 손상(Dorsal Root Crush Injury)은 감각 축삭 재생의 모델입니다. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 바이러스 현탁액을 배측근신경절(DRG)에 주입하고 마취된 쥐에서 등쪽 뿌리 분쇄를 통해 제어된 축삭 손상을 유도하는 단계별 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 DRG를 노출시키고, 축삭 재생을 촉진하기 위해 성장 촉진 바이러스 벡터를 전달하고, 감각 신경 손상 및 재생을 모델링하기 위해 척수에 대한 축삭 연결을 절단하는 것이 포함됩니다.

배근 신경절 주입 및 등뿌리 크러시 손상을 사용하여 쥐의 감각 축삭 재생 모델링

출처: Portela-Lomba, M., et. al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2020). 이 비디오는 불멸의 인간 후각 외피 신경교세포와 공동 배양된 축삭 절제술된 쥐 망막 신경절 뉴런(RGN)에서 축삭 재생의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. RGN은 붉은색 솜씨와 녹색 축삭돌기가 있는 면역 표지되어 있습니다. 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 캡처되었으며 축삭 및 축삭 재생 지수가 있는 뉴런의 비율은 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

출처: Li, Q. et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 축삭 재생을 연구하기 위해 마우스 DRG 뉴런의 전기천공 매개 형질감염을 보여줍니다. DRG 뉴런에 핵산 구조물을 전달하고, 좌골 신경 손상을 유도하고, 축삭 재생을 평가하는 단계를 간략하게 설명합니다.

감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 마우스 등근 신경절의 전기천공 매개 형질감염

도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

이 프로토콜은 감각 축삭 재생을 연구하기 위한 모델로 성체 쥐에서 바이러스 벡터와 동시 등쪽 뿌리 압착 손상과 함께 등뿌리 신경절(DRG) 주사를 사용하는 것을 제시합니다. 이 모델은 감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 유전자 요법의 사용을 조사하는 데 적합합니다.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

배우세요 성체 마우스 DRG 뉴런을 이용한 축삭 재생의 유전 연구 방법입니다. 전기천공법으로 유전자 조작 후 현미경 분석으로 축삭 재생을 평가하는 이 기술은 기능 상실 연구에 유용합니다.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

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