교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

이 절차의 전반적인 목표는 성체 등뿌리 신경절 뉴런 또는 DRG 뉴런을 사용하여 포유류 축삭 재생을 연구하기 위한 체외 모델을 확립하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 마우스에서 DRG를 해부한 다음 단일 세포로 해리함으로써 수행됩니다. 그런 다음 해리된 뉴런을 전기천공법으로 형질주입하고 며칠 동안 배양하여 유전자 발현을 유전적으로 조작합니다.

마지막 단계는 추가적인 하룻밤 배양을 위해 뉴런을 재현탁 및 재조정하는 것입니다. 궁극적으로, 현미경 기반 축삭돌기 길이 분석은 유전적으로 조작된 뉴런에서 축삭돌기 재생을 연구하는 데 사용됩니다. 이 기술에 사용된 세포 소련 현탁액 및 반복 단계의 주요 장점은 이미 유전적으로 조작된 뉴런에서 축삭돌기 성장을 분석할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 기능 손실에 특히 유용합니다 : RNI 접근법을 사용하여 관심 유전자를 하향 조절하는 연구는 제 연구실의 박사후 연구원 인 Dr.Sfu가 될 것입니다. 신경 배양 커버 슬립을 준비하려면 먼저 10% 염산으로 밤새 목욕시킵니다. 다음날 음파는 증류수에 한 시간 동안 가열합니다.

20분 단위로 세 번 청소한 커버 슬립을 70% 에탄올에 보관하고 사용하기 전에 자연 건조시킵니다. 다음으로 코팅하면 건조 된 커버가 미끄러집니다. 웰당 하나의 슬립과 100마이크로리터의 코팅 용액이 있는 다중 웰 플레이트를 설정합니다.

섭씨 37도에서 1-2시간 동안 교반 없이 플레이트를 배양합니다. 배양 후 코팅 용액을 제거하고 멸균 된 XPBS로 커버를 세 번 씻습니다. 완전히 마취 된 6-10 주 된 성인 마우스를 희생 한 후, 고통스러운 감각에 반응하지 않습니다.

먼저 등쪽 피부를 제거합니다. 둘째, 부속 조직을 포함하여 목에서 꼬리까지의 모든 척추뼈를 잘라냅니다. 마지막으로 조직 내부에 부착된 모든 내부 장기를 제거합니다.

제거된 척추를 XPBS 1개로 2-3회 헹군 다음 복부 쪽이 위로 향하게 해부 플레이트에 고정합니다. 감각 신경이 노출되도록 근육을 조심스럽게 제거합니다. 요추 수준에서 DRG와 연결된 신경은 가장 두껍고 쉽게 찾을 수 있습니다.

따라서 대부분의 실험에서는 요추 DRG만 채취합니다. 작은 가위로 중심선을 따라 각 척추뼈를 자르고 추간판을 조심스럽게 제거하여 척추뼈를 분리합니다. L 1부터 시작하여 집게를 사용하여 각 척추를 분리하고 요추 DRG를 해부합니다.

척수 쪽으로 각 요추 신경을 추적하여 겸자로 DRG를 찾습니다. L 2에서 L 6에 대해 이 과정을 반복합니다. 다음으로, 스프링 가위를 사용하여 고립된 DRG에서 말초 신경, 등쪽 및 복부 뿌리를 잘라냅니다.

필요한 경우 em EM 배지로 채워진 냉각된 1.5ml 퍼지 튜브에 DRG를 보관하십시오. 동일한 절차를 사용하여 다른 척추 수준에서 DRG를 채취할 수 있습니다. 모든 DRG를 수집한 후 MEM 배지를 1ml로 교체하고 콜라겐분해효소 용액을 주입한 다음 DRG를 섭씨 37도에서 90분 동안 배양합니다.

다음으로, 콜라겐 분해 효소 용액을 500 마이크로 리터의 1 x triple E express 분해 용액으로 교체하고 두 번째 분해 후 15-20 분 동안 튜브를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 용액을 5% FBS를 함유한 1ml의 준비된 배지로 교체하여 DRG를 세척하고 DRG를 소용돌이치며 침전시킵니다. 이 세척을 반복하십시오.

계속하기 전에 두 번 단계를 수행합니다. 마지막 세척을 제거한 후 600마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 조직을 트라이로 만듭니다. 1000 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 이 작업을 20-30회 수행한 후 tri는 해리되지 않은 조직이 마이크로 fuge 튜브의 바닥까지 가라앉도록 합니다.

세포 현탁액만 10ml 멸균 튜브로 옮기고 600마이크로리터의 배양 배지를 더 추가합니다. 대부분의 조직이 해리될 때까지 트라이 스텝을 반복합니다. 현탁액에는 뉴런 세포와 비뉴런 세포가 모두 포함되어 있습니다.

전형적으로, 대략 50, 000의 세포는 1개의 전기천공법 반응을 위해 충분히 6개의 dgs에서 모아지고, 6개의 dgs의 해리된 세포를 분리기하고 가능한 한 다량 상등액을 버린다. 그런 다음 DNA 플라스미드 또는 SI RNA를 함유한 100마이크로리터의 트랜스펙션 용액에 200마이크로리터의 피펫 팁을 통해 3-4번의 부드러운 스트로크로 세포를 재현탁합니다. 현탁액을 electroporation, vete에 옮기고, electroporation 후에 세포를 전기화했습니다.

즉시 FBS를 함유한 500마이크로리터의 따뜻한 배양 배지를 VETE에 추가합니다. Resus 현탁액 및 리플레팅 배양이 필요한 대부분의 실험에서 플라스틱 배양 접시의 뉴런은 웰당 10-20, 000개의 세포를 가지고 있습니다. 그러나, electroporation 직후에 축삭 성장을 시험하기 위하여는, 신경세포는 3개에서 5개, 우물 당 000개의 세포에 입히는 유리제 덮개 미끄러짐에 직접 도금될 수 있다.

4시간의 세포 배양 후 뉴런은 기질에 부착됩니다. 트랜스펙션 용액으로 오염된 배지를 500마이크로리터의 신선한 가열 배지로 부드럽게 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. DNA 플라스미드의 유전자 발현 분석은 전기천공법 후 몇 시간 만에 가능합니다.

그러나 새로운 축삭 성장에서 유전자 발현의 하향 조절을 분석하려면 더 긴 배양 시간이 필요합니다. 고밀도 플레이트에서 3일 동안 배양한 후, 배지를 1ml의 예열 새 배지로 교체하고 피펫을 6-10회 부드럽게 스트로크하여 뉴런을 용액으로 플러시합니다. 그런 다음 비 신경 세포는 플레이트에 부착 된 상태로 유지되고 재현 유 된 뉴런을 마이크로 fuge 튜브로 옮기고 10-15 번 부드럽게 T하여 세포 덩어리를 해리합니다.

배양 3일 후 부착된 뉴런의 현탁액을 더 쉽게 사용할 수 있도록 초기 배양 전 배양 접시의 코팅은 1, 2, 3시간으로 제한됩니다. S 현탁 단계에서 우리는 일반적으로 세포가 배양 접시 플레이트에서 분리되었는지 관찰하기 위해 도립 현미경으로 세포를 지속적으로 확인합니다. 새로 준비된 덮개 위의 뉴런은 다음날 낮은 밀도로 미끄러져 새로운 축삭 성장을 분석합니다.

추가된 세포외 성장 인자(extracellular growth factor)가 없는 경우, 성체 DRG 뉴런은 일반적으로 축삭돌기를 성장시키기 시작합니다. 처음 도금한 후 48시간이 지나면 축삭돌기는 종종 분지 형태를 보입니다. 대조적으로, 재도금된 뉴런은 도금 후 몇 시간 만에 축삭을 확장하기 시작하고 축삭은 감소된 분지로 늘어납니다.

이러한 결과는 재도금된 뉴런이 생체 내에서 재생되는 뉴런의 특성과 유사한 특성을 공유한다는 것을 시사합니다. 이 접근법을 사용함으로써, 기능 손실 연구를 사용하여 성체 DRG 뉴런의 축삭 성장에서 축삭 재생 관련 전사 인자 참조 JU의 역할을 조사했습니다. 시험관 내.

그 결과, cgen의 서로 다른 영역을 표적으로 하는 4개의 서로 다른 irna 그룹의 전기천공법이 성인 DRG 뉴런에서 cgen의 단백질 수준을 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다. 형질주입 3일 후, 뉴런을 재플레이팅하고 하룻밤 동안 배양했을 때, cgen knockdown에서 축삭 성장이 크게 감소했습니다. 이러한 결과는 배양된 성체 DRG 뉴런이 성체 뉴런에서 축삭돌기 성장을 연구하는 데 유용한 모델 시스템을 제공한다는 것을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 transfection과 배양을 해부하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 성인은 또한 in vitro에서 막 사고 재생을 연구하기 위해 신경절 뉴런을 뿌리를 뽑아야 합니다.