Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Bu prosedürün genel amacı, tasarlanmış kas dokuları oluşturmaktır. Bu, gerekli hücre sayısını elde etmek için önce uydu hücrelerinin veya bir miyoblast hücre hattının kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ankraj noktalarını yapmaktır.

Daha sonra, hücreler bir jel ile karıştırılır ve elde edilen karışım ankraj noktaları arasına dökülür. Son adım, hücreleri kas dokusuna farklılaştırmaktır. Sonuç olarak, hücrelerin kasılmalarını indüklemek için elektriksel stimülasyon kullanılabilir ve floresan boyama ve farklılaşmış kas hücrelerinde hücre iskeletinin sarkomerik organizasyonunu tespit etmek için floresan veya konfokal mikroskopi kullanılabilir.

Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kas hücrelerinin bu dokularda tek yönde hizalanmasıdır. Bu tekniğin aynı zamanda kas kaybından muzdarip hastalar için de etkileri vardır. Örneğin, gelecekte bu dokuları yapmak için hastanın kendi hücrelerini kullanırsak, bunlar nakil amacıyla kullanılabilir.

Bu yöntem, kas ve kas hasarının gelişimi hakkında fikir verir, ancak aynı zamanda rejeneratif tıp ve e vitro kültürlenmiş et gibi yeni uygulamalar için de fikir verir. Prosedürü göstermek, mirini izole etmek ve dondurmak için arian Yöntemler olacaktır. Miyoblast progenitör hücreleri başka bir yerde tanımlanmıştır.

Tam referanslar için lütfen yazılı protokole başvurunuz. Fare miyoblast progenitör hücrelerinin şişesini sıvı nitrojenden aldıktan sonra. Şişeyi çözülmesi için 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin.

Daha sonra, 25 santimetre karelik matrik jel kaplı doku kültürü şişesine 10 mililitre ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin. Hücreler çözülür çözülmez, şişenin içeriğini ortama ekleyin. Doku kültürü şişesinde, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Kuluçkanın üçüncü gününde, hücreleri tripsin, izasyon ve santrifüjleme ile hasat edin. 1000 RPM'de hücreleri daha sonra 75 santimetrelik ana jel kaplı bir doku kültürü şişesine geçirin, Flask hücreleri her üç günde bir bölün ve altıncı günde hücreleri 150 santimetre karelik matri jel kaplı bir doku kültürü şişesine geçirin. Dokuzuncu günde, hücreleri 150 santimetre kare matri jel kaplı doku kültürü şişesinden üçlü 150 santimetre kare matri jel kaplı doku kültürü şişesine veya üç adet 150 santimetre kare şişeye aktarın.

Kuluçka döneminin 12. gününde, hücreler bir kas yapısına tohumlanmaya hazırdır. Bu şemada gösterildiği gibi bir kenarı üçgen şeklinde olacak şekilde yaklaşık beş milimetre karelik Velcro segmentlerini keserek başlayın, Velcro'nun sadece yumuşak tarafı kullanılır. Daha sonra elastomeri kürleme maddesi ile 10'a bir oranında karıştırarak silikon yapıştırıcı hazırlayın.

Daha sonra, altı kuyulu bir kültür plakasının her bir oyuğuna iki parça Velcro yapıştırın, parçalar arasında yaklaşık 12 milimetre bırakın ve gece boyunca kurumaya bırakın. Ertesi gün, kuyucuklara% 70 etanol ekleyerek ve 15 dakika inkübe ederek kuyuları ve Velcro'yu sterilize edin. Daha sonra, kuyuları PBS ile üç kez durulayın.

Üçüncü yıkamayı kuyucuklarda bırakın ve plakayı 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve plakaları kullanıma hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne aktarın. Mililitre başına 3.2 miligram, kollajen ve% 0.02 steril asetik asit çözeltisi hazırlayın.

Kollajen solüsyonunu, daha önce buzdolabında çözülmüş olan matrigel solüsyonu ile birlikte buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, hücreleri tripsin, izasyon ve santrifüjleme ile hasat edin. Daha sonra hücre peletini büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve standart prosedürlere göre bir hücre sayımı gerçekleştirin.

Hücreler sayıldıktan sonra, hücreleri içeren tüpü doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Matris çözeltisi, çözeltilerin buz üzerinde aşağıdaki yüzdelerde karıştırılmasıyla hazırlanır,% 51.3 Kollajen çözeltisi% 0.2 molar sodyum hidroksit,% 8.6 matris jel ve% 39.9 büyüme. Orta. Nihai çözeltinin pembe renkte olduğundan emin olun, çünkü pH'daki bir artış hızlı asyona neden olabilir.

Nihai hacim, kaplanacak kuyu sayısına bağlıdır. Bu tablo 10 kasın hacimlerini göstermektedir. Hücrelerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun ve yapı başına 750.000 ila 1.250.000 hücreyi beş dakika boyunca 1000 RPM'de taze bir santrifüj tüpü santrifüjüne aktarın, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini küçük ama yeterli bir matris karışımı hacminde yeniden süspanse edin.

Daha sonra pelet tamamen yeniden süspanse edildiğinde, hücreleri kalan matris karışımı hacmine ekleyin. Şimdi, ön ısıtma plakalarını inkübatör borusundan 0,35 ila 0,4 mililitre hücre matrisi karışımında her bir Velcro parçasına aldıktan sonra. Ardından, karışıma bağlantı bölgeleri arasındaki merkezden boru sıkmaya başlayın ve Velcro'ya kadar uzatın.

Son olarak, iki Velcro ankraj arasındaki boşluğu doldurmak için jelin geri kalanını kullanın ve Velcro parçalarının etrafına pipetleyin. Plakayı örtün ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletin. Ardından tabağa hafifçe vurun ve jelin sert olup olmadığını görmek için görsel olarak inceleyin.

Eğer öyleyse, bulaşıklar nazikçe doku kültürü inkübatörüne aktarılabilir. İnkübatörde bir ila iki saat sonra, her bir jeli dört mililitre ön ısıtma büyüme ortamı ile hafifçe kaplayın. Daha sonra plakayı doku kültürü inkübatörüne geri koyun.

24 saat sonra, büyüme ortamını farklılaşma ortamı ile değiştirin. Medya değişikliğini her iki ila üç günde bir tekrarlayın. Olgun yönlendirilmiş kas lifleri, kültürün yedinci gününde belirgin olmalıdır.

Bu noktada, lifler elektriksel olarak uyarılabilir. İlk olarak, iyon optik plakadaki elektrotları 15 dakika boyunca %70 etanol ile sterilize edin ve 30 dakika UV ışığı altında kurutun. Daha sonra sterilize edilmiş elektrotları kültür plakasına yerleştirin, elektrotların bir plakanın altını gösteren bu resimde gösterildiği gibi kas yapısına paralel olarak yerleştirildiğinden emin olun, beyaz oklar elektrotların plakayı kapağıyla kapladığını ve doku kültürü inkübatörüne aktarıldığını gösterir.

İyon optik C pacer'ı uygun kablolarla bağlayın ve buradaki stimülasyon protokolünü uygulayın. Santimetre başına dört volt. İki hertz frekansında altı milisaniye darbesi kullanılır.

Elektrik stimülasyonu genellikle 48 saatlik bir süre için yapılır. Stimülasyon sırasında kültür ortamını her 24 saatte bir değiştirin. Bu görüntü, olgun bir kas yapısının tipik bir örneğini göstermektedir.

Dokunun boyutu yaklaşık sekiz milimetre uzunluğunda, iki milimetre genişliğinde ve 0,5 milimetre kalınlığındadır. Bu görüntü, tasarlanmış iskelet kası dokularındaki bir kas progenitör hücresinin tipik bir örneğini göstermektedir. Uyarılmamış aynalama biyo yapay kasların veya M bms'nin donmuş bölümleri.

Farklılaşmanın sekizinci gününde, kırmızı ile gösterilen sarkomerik alfa aktinin, yeşil ile gösterilen sarkomerik miyozin ve mavi ile gösterilen çekirdekler için boyandı. Sağdaki paneller kutulu alanların büyütülmüş halidir. Protokol ayrıca C iki C 12 hücresinde de kullanılabilir.

Bu görüntü, son resimde gösterildiği gibi boyanmış farklılaşmış C iki C 12 hücresini göstermektedir. Sarkomerik alfa aktinin kırmızı ile gösterilmiştir. Sarkomerik miyozin yeşil renkle gösterilir ve çekirdekler mavi renkle gösterilir.

Yine sağdaki paneller kutulu alanların büyütülmüş halleridir. Bu prosedürü denerken, her şeyi buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, geliştirildikten sonra gen ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri göstermek için kantitatif PCR gibi ek soruları yanıtlamak için başka yöntemler de uygulanabilir.

Teknik, araştırmacıların doku morfogenezinde mekaniğin rolünü incelemesinin yolunu açtı. Ayrıca tasarlanmış kalp kası modellerinin tasarımına da yardımcı oldu. Bu videoyu izledikten sonra, hidrojel bazlı bir iskele kullanarak tasarlanmış kas dokularının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.