면역 반응과 수면에서의 양적 측정 Drosophila

다음 실험의 전반적인 목표는 초파리의 수면과 면역 기능을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 감염된 파리의 운동 활동을 기록하여 감염된 파리가 균질화되고 희석되어 LB 한천 플레이트에 퍼진 후 두 번째 단계로 수면과 생존을 측정함으로써 달성됩니다. 성장하는 군체 형성 단위의 수는 파리가 감염을 제거하는 능력을 나타냅니다.

다음으로, NF kappa b luciferase reporter를 함유하는 전이유전자를 발현하는 감염된 파리를 luciferase의 기질인 luciferian을 함유하는 96 well plate에 첨가한다. 카파 B 루시페라아제의 실시간 측정은 감염 중 NF 카파 B 신호 경로의 활성화를 나타냅니다. 박테리아 제거 및 NF KB 리포터 활성은 면역 기능과 행동 사이의 분자 연결에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 측정입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하거나 일관성을 가지고 파리를 수동으로 감염시키는 방법을 배우는 데 시간과 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪습니다. QPCR과 같은 기존 방법에 비해 Lucifer 보고 기법의 주요 장점은 NF Kappa B 활성을 실시간으로 연속적으로 측정할 수 있다는 것입니다. 파리 : 늦은 학생이 단계적으로 진행한 초파리 배양을 3-4일 동안 배양하여 성인이 환경 조건에 적응할 수 있도록 합니다.

여기서 파리는 면역 반응과 행동에 대한 생체 시계의 영향을 제거하기 위해 일정한 빛 아래에 배치됩니다. 다음으로, 1-4일 된 파리를 활동에 로드합니다. 모니터는 예정된 감염 하루 전에 감염되기 최소 3일 전에 자신의 활동을 기록합니다.

멸균 피펫 팁이 있는 단일 SIA 콜로니를 선택하고 팁을 5ml의 LB 배지가 들어 있는 배양 튜브에 담궈 멸균 기술을 검증합니다. 박테리아가 없는 대조군 모의 배양을 만드는 것을 잊지 마십시오. 다음날 기하급수적 성장 단계에 도달할 때까지 밤새 박테리아를 성장시킵니다.

600나노미터에서 배양의 흡광도를 측정합니다. 두 번째 Q 수의사를 빈칸으로 포함합니다. 농도가 0.5에서 1 흡광 단위 하위 배양 사이이거나 필요에 따라 배양 시간을 연장할 때 준비됩니다.

이제 파리를 감염시킬 박테리아 용액을 준비하십시오. PBS로 박테리아를 600나노미터에서 0.1의 예상 흡광도로 희석합니다. 그런 다음 주입 제어를 위해 식용 색소를 추가합니다.

박테리아를 LB 배지로 교체하십시오. 두 용액을 모두 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 해부 현미경 아래에서 미세한 팁으로 주사 바늘을 만듭니다.

가는 집게를 사용하여 각 바늘의 끝을 부러뜨려 구멍이 흡입을 사용하여 주입 유체로 채울 수 있을 만큼 충분히 크지만 파리의 손상을 최소화할 수 있을 만큼 충분히 작도록 합니다. 주사기를 사용하여 튜브 길이의 3cc 플라스틱 주사기에 유리 바늘을 부착합니다. 주입 매체의 흐름은 수동으로 제어됩니다.

주사기 장치는 감염 및 제어 주입에 모두 사용되므로 주입 유체로 고무 튜브를 오염시키지 마십시오. Kim 물티슈를 사용하여 주입 매체의 흐름을 확인합니다. 성공적인 주사를 위한 두 가지 중요한 세부 사항은 최적의 바늘 크기와 바늘과 주사기 사이의 안전한 밀봉을 사용하는 것입니다.

주사 시스템이 완전히 준비되면 최소한의 이산화탄소를 사용하여 파리를 마취하고 신속하게 진행하여 5분 이상 마취된 파리가 없도록 합니다. 이제 등쪽 흉부의 비뚤어진 텔럼 위 영역에 유리 바늘을 찔러 파리를 주입합니다. 주입 매체가 플라이로 전달되는 것은 주입된 용액이 퍼짐에 따라 볼 수 있는 식용 색소에 의해 확인됩니다.

시작하기 전에 이 절차에 사용된 모든 재료가 적어도 하루 전에 오토클레이브되었는지 확인하십시오. LV 한천 배지로 10cm 페트리 접시를 준비합니다. 실험 당일, 파리를 마취하고 1.5ml 원심분리기 튜브에 파리를 넣습니다.

실험 조건당 각각 10마리의 파리로 구성된 최소 두 그룹을 준비합니다. 또한 특히 항생제 내성이 없는 박테리아 균주를 사용하는 경우 감염되지 않은 파리의 대조군을 준비하십시오. 적재된 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 400마이크로리터의 LB 매체를 각 플라이 로드 튜브에 추가합니다. 작은 껍질을 사용하여 파리를 균질화하고 오염을 방지하기 위해 화염 근처에서 이 작업을 수행합니다. 이제 절단 피펫 팁을 사용하여 균질액을 200 마이크로 리터 부피에서 10의 계수로 연속적으로 희석합니다.

균질산염이 sia 감염 직후에 하는 경우에, 1개에서 1000년까지 dilu를 만드십시오, 그러나 24 시간 동안, 감염 후에 균질산염은, 100, 000에 1개까지 만든다. 다음 씨앗, 균일 한 분포를 보장하기 위해 유리 공을 사용하여 10cm 판에 가장 큰 두 개의 dilu, 밤새 판을 배양합니다. 다음 날, 직접 관찰 또는 집락 계수 소프트웨어를 통해 플레이트에 있는 군체의 수를 세십시오.

그런 다음 플라이당 식민지 형성 단위의 수를 계산합니다. 이 분석은 적절한 시간에 kappa b luciferase 리포터를 운반하는 형질전환 파리를 사용합니다. 또한 이 분석에는 이전 섹션에서 설명한 바와 같이 주입을 위해 준비된 SCIA와 같은 배양된 박테리아가 필요합니다.

실험적 조명 조건에 맞게 파리를 조정합니다. 이 예에서는 생후 1일에서 4일 된 kappa b luciferase 파리를 5% 자당, 2% 한천 식품 배지가 들어 있는 바이알에 넣고 이틀 동안 일정한 빛에 둡니다. 이제 파리를 위한 96웰 마이크로플레이트를 준비합니다.

각 우물에 두 겹의 음식을 채웁니다. 매체 먼저, 300 마이크로 리터의 5 % 자당, 2 % 한천 용액을 각각 첨가하십시오. 고운 그물 천으로 접시를 잘 덮고 접시를 최대 한 시간 동안 완전히 건조시킵니다.

다음으로, 50%자당, 1%한천 및 2밀리몰 루시퍼를 포함하는 각 웰에 50마이크로리터의 상층을 추가합니다. Lucifer는 빛에 민감하기 때문에 접시를 어두운 곳에서 건조시키십시오. 플레이트의 빛 노출을 최소화하십시오.

한천이 식으면 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 가는 바늘을 사용하여 각 우물에 필름을 두 번씩 뚫습니다. 이 구멍은 공기 교환과 기체 마취를 가능하게 합니다.

다음으로, 플라이 로딩을 용이하게 하려면 날카로운 날과 직선 모서리를 사용하여 각 기둥 사이에 절단을 도입합니다. 이산화탄소로 파리를 마취시키고 각 우물에 한 줄씩 로드합니다. 파리가 필름에 끼어 생기면 개입하기 전에 스스로 벗어날 수 있는 기회를 주십시오.

마이크로 웰 플레이트를 8-24시간 동안 일정한 조명 아래에서 인큐베이터에 다시 넣습니다. 잘 결합된 파리를 마취하려면 저압 이산화탄소 라인에 부착된 마이크로 피펫 팁을 사용하십시오. 가스가 무해할 정도로 낮은 압력인지 확인하고 마이크로 피펫 팁을 통풍구 바로 위에 놓아 8명씩 개별적으로 파리를 마취합니다.

각 파리를 CO2 패드로 옮기고 이전과 같이 박테리아로 감염시킵니다. 그런 다음 각 플라이를 원래 웰로 되돌리고 마이크로플레이트를 다시 밀봉합니다. 정의된 조명 일정에 따라 온도가 조절되는 방에 있는 광도계를 사용하여 각 파리의 발광을 측정합니다.

플레이트를 스태킹 카세트에 로드하고 투명한 빈 플레이트 사이에 파리가 포함된 플레이트를 쌓아야 합니다. 제조업체의 사양에 따라 광도계를 프로그래밍하고 최소 24시간 동안 매시간 판독값을 수집합니다. 이 예에서 검출기는 10초 동안 각 웰을 판독하도록 프로그래밍되어 있습니다.

완료되면 데이터 파일을 스프레드시트로 내보내고 결과를 그래프로 표시하는 표준 분석을 수행합니다. 예제 데이터를 분석할 수 있습니다. 초당 할인은 우물당 3회 판독에서 평균화되었습니다.

Canton S 와일드 타입은 날아 다니며 맛있습니다. NF kappa B 유전자가 결핍된 E 20마리의 돌연변이 파리를 일정한 빛 속에서 두 개의 활동 모니터에 넣고 sia 감염시켰습니다. 이 예에서는 감염이 수면을 촉진했습니다.

렐리시 E 20 돌연변이가 감염 후 Canton s. Control 파리보다 수면 부족을 경험한 것이 분명했습니다. 이전의 발견과 일치하게, 렐리쉬 E 20 돌연변이체는 야생형 파리에 비해 감염에 빠르게 굴복했다.

대부분의 파리는 무균 대조군 주사에서 살아남았으며, 이는 파리가 주사로 인한 부상이 아니라 감염에 굴복했음을 나타냅니다. 렐리시 돌연변이가 너무 빨리 죽었기 때문에 감염 후 박테리아 부하를 보여주기 위해 광둥의 파리만 사용되었습니다. 시아는 감염 후 24시간 동안 계속해서 증식했습니다.

루시퍼의 기자 활동은 개별 파리와 데이터 포인트의 성공 간에 큰 차이를 보였습니다. 신호는 파리 내의 모든 조직에서 파생되지만 모든 조직이 동일한 양의 신호를 방출할 것으로 예상되지 않으며 파리가 이동함에 따라 검출기에 대한 조직의 가시성이 달라질 것으로 예상됩니다. 이 예에서는 파리를 감염시키고 처리된 대조군과 비교했습니다.

죽은 파리는 파리 그룹에 대한 분석에서 제외되었습니다. Kappa b Luciferase 기자 활동은 감염 후 꾸준히 증가하고 있습니다. Kappa b Luciferase 기자의 활동도 무균 부상 이후 꾸준히 증가했습니다.

최대 활동은 부상 후와 감염 후 모두 약 12시간이었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 면역 기능을 정량화하고 감염 후 SSO에서 수면을 취하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 수면, 생존, 시간, 박테리아 제거 및 un copy transcription 기자의 실시간 활동을 측정할 수 있습니다.