Name: 의 식별 잠자는 숲속의 미녀 Transposon의 삽입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 배우세요 Sleeping Beauty 트랜스포존 삽입 매핑을 통해 생쥐 모델에서 새로운 종양 유발 유전자와 억제 유전자를 식별하는 방법을. 링커 매개 PCR과 시퀀싱을 활용한 이 기법은 암 유전학 연구에 유용합니다.

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저자는 프로토콜 위에서 설명한 개발에서의 도움 아이오와 대학에서 미네소타 대학에서 Branden의 Moriarity, 데이비드 Largaespada, 그리고 빈센트 켕에게 감사를, 그리고 아담 Dupuy 것입니다.

1. 사육 및 트렌스 제닉 동물의 고령화 <ol><li> 실험에 적합한 유전자 변형 생쥐의 변종을 선택합니다. 원하는 암 기원의 세포 것으로 세포에 Cre Recombinase을 표현 조건부 transposase 마우스, transposons의 concatamer을 품고 마우스 및 마우스, 전형적인 실험은 세 유전자 변형 라인을 사용합니다. 모델링되는 암 환자의 큰 비율에 알려진 돌연변이가있는 경우는 시작에서이 변이를 포함하는 것이 바람직 할 수 있습니다. 이 &quot;predisposing&quot;변이의 예는 다음과 활성화 Kras, 지배적 인 부정적 Tp53 또는 floxed Pten의 allele가 포함되어 있습니다. predisposing 돌연변이에 추가하여 모델은 더 나은 (1.3 참조) 인간의 암을 의미합니다. 여러 슬리핑 뷰티 transposase와 transposon 마우스는 국립 암 연구소 마우스 저장소 (에서하실 수 있습니다 <a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a> ). </li><li> 결국 가능한 경우 두 대립 유전자에 대한 homozygous 마우스를 얻기 위해 transposons을 품고 쥐 번식 조건 transposase 마우스. 귀하의 트리플 유전자 변형 실험 쥐 (그림 2)을 생성 할 수 Cre Recombinase을 표현 마우스로 품종 homozygous 자손합니다. 참고 : 취득 homozygous 마우스는 항상 가능하거나 이상적인 없습니다. 예를 들어, homozygous p53의 지배 부정적인 마우스는 훨씬 더 어려운 heterozygous 마우스보다 번식하려고합니다. 또한, litters이 번식 제도가 성공적으로 확인 Mendelian 유전학을 준수하는지 확인하기 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> 취약한 배경을 사용하는 경우, predisposing allele있는 마우스에 transposase있는 첫번째 품종 마우스. 동시에 번식 마우스는 transposons을 가진 마우스에 Cre Recombinase을 표현. 각 allele 가능한 경우에 대한 homozygous 쥐를 만듭니다. 마지막으로, 쿼드 러플 유전자 변형 실험의 anim를 생성하는 과거 2 번식 제도에서 homozygous 자손을 번식ALS. </li><li> 실험 동물뿐만 아니라, 마우스 제어 동료를 생성합니다. 제어 그룹은 일반적으로 만 세 대립 유전자 (그림 2) 중 두 가지를 상속 실험 사육에서 littermates로 구성되어 있습니다. 취약한 배경의 경우, 네 개의 대립 유전자 중에 세 등의 마우스도 필요합니다. </li><li> 종양 개발 및 / 또는 moribundity에 대한 일일 실험 및 제어 쥐를 모니터링 할 수 있습니다. 귀하의 기관 동물 관리 및 동물 축산의 사용위원회 (IACUC) 요구 사항을 따르십시오. 또한, 그것은 아직 죽어가는가되지 않은 경우 동물을 희생되는에 나이를 결정하는 것이 일반적입니다. 18 개월 쥐가 euthanized 할 것인지 전형적인 연령은 16 세입니다. </li></ol> 2. 트렌스 제닉 동물의 검시 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 그래 - 인감 Induc기 회의소 </td><td> 브레인 트리 과학 </td><td> EZ-177 </td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td></tr><tr><td> 10 % 포르말린 버퍼 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> HT501128-4L </td></tr></tbody></table> 표 1. 시약이 필요합니다. <ol><li> 마우스 죽어가는거나 결정 수명의 끝을 도달하면 IACUC 지침에 따라 CO 2 챔버를 사용하여 동물을 안락사시켜야. 일반적으로, 깨끗한 가스 챔버에 동물을 배치 가스 탱크를 열고 평방 인치 당 더 높은 5 이상 파운드를 읽어 조절기를 조정합니다. CO 2 코와 눈 자극 혐오감을 최소화하기 위해 천천히 입력하십시오. 동물의 심장이 더 이상 뛰고되지 않으며 눈에 접촉 할 때 응답하지 않는지 확인하십시오. </li><li> 70 %의 에탄올과 희생 마우스 스프레이 외관. </li><li> 장소 검시 보드에서 마우스 및 해부 핀으로 고정. 가위에게를 사용하여D 핀셋 마우스를 열고 장기를 제거합니다. 수집해야하는 장기 결정하는 것은 프로젝트에 따라 달라지게된다. 그러나, 이러한 기관은 종종 마우스가 죽어가는 이유에 중요한 통찰력을 제공으로 항상 비장과 간을 수집하는 것이 좋습니다. 또한 골수의 잠재력 분석을위한 흉골를 수집합니다. 또한, 항상 이상 나타나는 장기 나 조직을 수집 도움이됩니다. </li><li> 수집 조직 및 종양은 4 개의 섹션으로 구분해야합니다. 10 % 70 % 에탄올 다음 18 시간에 포르말린 버퍼에 하나의 섹션이 고정됩니다. 이 섹션은 H &amp; E 염색 및 / 또는 IHC 사용할 수 있습니다. 일반적으로 크기가 50-100 밀리그램있는 나머지 세 부분은, 액화 질소에 냉동 스냅 있습니다. 이러한 DNA, RNA 및 단백질 분리에 사용할 수 있습니다. </li><li> IACUC 가이드 라인에 따라 시체와 나머지 조직을 폐기합니다. </li></ol> 3. 종양의 게놈 DNA를 분리 <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;시약의 STRONG&gt; 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 단백질 강수량 솔루션 </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td></tr><tr><td> 세포 용해 버퍼 </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td></tr><tr><td> TE 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr></tbody></table> 표 2. 시약이 필요합니다. <ol><li> 잘게 깨끗한 면도날을 사용하여 냉동 종양 샘플을 (50-100 MG) 이기다. </li><li> 장소 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 조직을 다진 5 μl Proteinase K 솔루션 (20 MG / ML)가 포함 된 셀 용해 버퍼 1 ML를 추가합니다. </li><li> 철저하게 와동. </li><li> ° C 흔드는는 바람직 하루 아침에 적어도 4 시간, 250 rpm으로 설정 한 55 품다. </li><li> 1 μl RNase 솔루션을 (10 MG / ML) 추가 및 튜브 25 배를 반전. </li><li> 30 분에 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 3 분에 얼음에 배치하여 실내 온도에 차가운. </li><li> 333 μl 단백질 강수량 솔루션과 강력하게 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 14,000 rpm에서 10 분에서 원심 분리기. 단백질은 펠릿해야. 펠렛 다시 아주 작은, 소용돌이 인 경우 5 분 후 다시 원심 분리기에 얼음에 품다. </li><li> 깨끗한 15 ML의 원심 분리기 튜브로 표면에 뜨는 포함하는 DNA를 넣어. </li><li> 백퍼센트 이소프로판올의 동등한 볼륨을 추가하고 부드럽게 반전 50 회에 섞는다. </li><li> 3 분에 3,500 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 70 % 에탄올 1 ML을 추가하고 펠릿을 씻어 튜브를 여러 번 반전. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 에탄올과 함께 한물 펠릿을 전송합니다. </li><li> 4 ° C.에 5 분에 14,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 에탄올을 넣어, 공기 건조 (약 5-30 분)에 튜브를 반전. </li><li> Resuspend DNA Pellet는 TE의 50-500 μl에 DNA 펠렛의 크기에 따라 다릅니다. </li><li> 37 번 선택 부화는 ° C DNA를 resuspend합니다. </li><li> 장기 저장을위한 4 ° C 또는 -20 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 4. 종양에서 링커 매개-PCR 사용하여 게놈의 DNA <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> BfaI </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0568S </td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0125S </td></tr><tr><td> 96 잘 접시를 MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28,051 </td></tr><tr><td> QIAvac 96 진공 매니 폴드 </td><td> Qiagen </td><td> 19,504 </td></tr><tr><td> 멀티 MicroPlate 지니, 120V </td><td> 과학 산업 주식회사 </td><td> SI-4000 </td></tr><tr><td> 5 배 결합 버퍼와 T4 DNA ligase의 </td><td> Invitrogen </td><html><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> BamHI </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0136S </td></tr><tr><td> 25 MM dNTPs </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-034 </td></tr><tr><td> FastStart DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 </td><td> 로슈 </td><td> 12032929001 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Promega </td><td> V3121 </td></tr><tr><td> 태 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V4271 </td></tr><tr><td> TE 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 </td><td> Promega </td><td> H5041 </td></tr></tbody></table> 표 3. 시약이 필요합니다. 링커 시퀀스 BfaI 링커 + 5 &#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3&#39; BfaI 링커-5 &#39;Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG 3&#39;NH2 &quot;&gt; NlaIII 링커 + 5&#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 &#39; NlaIII 링커-5 &#39;Phos-GTCCCTTAAGCGGAGCC 3&#39; 프라이머 시퀀스 앞으로 차 PCR 오른쪽 (NlaIII) : SPL IRDR R1 한 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC SPL IRDR L1 한 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC : 기본 PCR 앞으로 쪽 (BfaI)를 왼쪽으로 오른쪽과 왼쪽 모두 측면에 대한 기본 PCR 역방향 : SPL Link1 한 GTAATACGACTCACTATAGGGC 차 PCR 앞으로 오른쪽 : Illumina barcoded 보조 프라이머 5 &#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa의 예 (N가 12 BP 바코드를 나타내는, 대문자의 순서는 Illumina 플랫폼에 필요한, ​​그리고 낮은 경우에 시퀀스는 transposon에 바인딩됩니다.) Illumina barcoded secon의 예 : 차 PCR 앞으로 곁을 떠나지dary 입문서 5&#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (N가 12 BP 바코드를 나타내는, 대문자의 순서는 Illumina 플랫폼에 필요한, ​​그리고 낮은 경우에 시퀀스는 transposon에 바인딩됩니다.) 오른쪽과 왼쪽 모두 측면에 대한 보조 PCR 역방향 : 링커 중첩 된 역 프라이머 5 &#39;CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC <ol><li> +를 단련하고 - BfaI의 linkers와 NlaII linkers 모두 linkers을 링커 - (100 μM)의 50 μl와 링커의 50 μl + (100 μM)를 혼합 의해 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 2 μl NaCl을 (5 M) 추가 할 수 있습니다. 95 5 분에 대한 ° C 열 블록의 장소. 가열 블록을 해제하고 (이 시간 이상 소요) 객실 온도에 천천히 시원한 보자. 필요한 때까지 냉각 한 후, annealed linkers는 -20 ° C의 냉동고에 저장 될 수 있습니다. </li><li> 종양 DNA의 두 aliquots, DNA 1 μg를 포함하는 각 나누어지는을 준비합니다. 하나 나누어지는이 지혜를 소화 될 것입니다transposon의 &quot;오른쪽&quot;끝으로 아슬 아슬합니다 헥타르 제한 효소. 두 번째 나누어지는이 transposon의 &quot;왼쪽&quot;마지막에 가까운 지경 제한 효소로 소화 될 것입니다. 이것은 모든 transposon 삽입 사이트를 증폭의 가능성을 최대화하기 위해 수행됩니다. </li><li> &quot;오른쪽&quot;사이드 효소 NlaII을 이용하여 하나 나누어지는의 종양 DNA를 소화하고 &quot;왼쪽&quot;쪽 효소 BfaI을 사용하여 다른 나누어지는에있는 종양 DNA 소화 : 효소 1 μl, 5 μl 10X 코 버퍼 # 4, DNA를 (결합을 1 μg) 50 μl의 총 볼륨에 ddH 2 O. 37 번 박 다이제스트 DNA ° 물 목욕이나 보육에 C. </li><li> 효소를 비활성화 가열 (BfaI = 80 ° C 20 분에, NlaIII = 65 ° C 20 분 용). </li><li> MinElute 96 잘 플레이트에 샘플을 배치하여 소화 샘플을 청소, 우물까지 약 15 분에 진공 매니 폴드 및 진공의 장소 플레이트는 건조 봐. </li><li> 모든 liqui를 제거하는 진공 매니 폴드 및 종이 타월로 96 잘 접시의 얼룩 바닥에서 판을 제거디 </li><li> 각도에 30 μl ddH 2 O를 추가하고 2 분 높은에 궤도 셰이커 세트에 흔들, 또는 20-40 배 아래로 피펫합니다. </li><li> 깨끗 96 잘 접시에 MinElute 96 잘 접시에서 우물의 전체 볼륨 (30 μl)를 전송합니다. </li><li> 단계 4.8 및 4.1 단계에서 linkers에서 소화 DNA와 링커 결합 반응을 수행합니다. 10 μl 소화 DNA, 4 μl 5 배 결합 버퍼, 5.5 μl annealed linkers (950 μg / μl), 0.5 μl T4 ligase를 (5 U / μl) 섞는다. </li><li> 16시 밤에 4 시간에 품다 ° C. </li><li> 10 분 동안 65 ° C에서 T4 DNA ligase를 비활성화의 가열. </li><li> 4.6 - MinElute 96 잘 접시와 같은 단계 4.5에 설명 된 진공 매니 폴드를 사용하여 결합을 청소하십시오. </li><li> 30 μl H 2 O에 Resuspend하고 깨끗한 96 잘 판에 전송할 수 있습니다. </li><li> concatamer transposons 남아 파괴하기 위해 두 번째 DNA의 소화를 수행합니다. 이 문제는 플라스미드 v를 잘라 효소를 사용하여 DNA 두 번째 절단에 의해 달성된다transposon concatamer를 포함하는 유전자 변형 쥐를 만드는 데 사용 된 ector DNA. </li><li> 다이제스트 DNA는 BamHI (왼쪽과 오른쪽 모두 측면)를 사용하여 : 믹스 단계 4.13, 5 μl 10X 코 버퍼 # 3, 0.5 μl BamHI (20 U / μl), 0.5 μl BSA (에서 링커 - 출혈도 잡았 DNA의 25 μl를 10 MG / ML ), 19 μl ddH 2 O. </li><li> 37 번 다이제스트 3-6 시간 또는 밤새 ° C. </li><li> 링커에 대한 transposon과 프라이머의 특정에 대한 특정 프라이머를 사용하여 기본 PCR을 수행합니다. 이러한 사용중인 transposon와 링커에 따라 달라집니다. 프리 머의 T2/Onc과 T2/Onc2 transposons에 대한 작업 위의 프라이머 표에 나열된. </li><li> 차 PCR : 5 μl 10X 버퍼, 2.0 μl MgCl2 (50 ㎜), 4 μl dNTPs (2.5 nm 정도), 1 μl 프라이머 1 (20 μM), 1 μl 프라이머 2 (20 μM), 0.25 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매 (5 U / ) μl, linkers있는 3 μl 소화 DNA (금액이 다를 수 있습니다), 최대 50 μl ddH 2 O. </li><li> PCR 프로그램 : 94 ° C 5 분, 94의 30주기 ° C 30에 초, 60 &amp; D예를 들어, 30 초에 C, 90 초 72 ° C. 72의 최종 확장 ° C 5 분에. </li><li> MinElute 96 잘 접시 위에 설명 된대로 진공 매니 폴드를 사용하여 PCR 제품을 청소하십시오. </li><li> 30 μl H 2 O에 Resuspend하고 깨끗한 96 잘 판에 전송할 수 있습니다. </li><li> 148 μl ddH 2 O로 단계 4.21에서 DNA의 2 μl를 diluting하여 (1)의 1:75 희석 ° PCR을 </li><li> 또한 Illumina GAIIx 기계뿐만 아니라 (이 프리 머의 예에 대한 위의 프라이머 표를 참조) 처리 각 종양 샘플에 대한 고유 12 기본 쌍 바코드에 필요한 순서를 가지고있는 프리 머의 중첩 된 버전을 사용하여 보조 PCR을 수행합니다. </li><li> 차 PCR : MgCl2을 갖춘 10 μl 10X 버퍼, 8 μl dNTPs (2.5 ㎜), 1 μl Illumina 보조 프라이머 (20 μM), 1 μl Illumina의 둥지 1 차 프라이머 (20 μM), 0.25 μl FastStart DNA 형성 촉매를 (barcoded 5 U / μl ), 차 PCR 희석 1:75에서 2 μl DNA, 최대 100 μl ddH 2 O. </li><li> PCR 프로그램 : 94 °, 2 분을위한 C, 90 초에 45 초, 72 ° C 30 초, 53 ° C에 94 ° C의 30주기. 72의 최종 확장 ° C 5 분에. </li><li> ethidium 브로마이드 (0.5 μg / ML)를 포함하는 1 % 아가로 오스 겔에서이 PCR 반응의 45 μl를 실행합니다. 종양의 여러 가지 transposon의 삽입 (그림 3)의 amplicons을 대표하는 PCR 제품의 &quot;비방&quot;이 있어야합니다. </li><li> MinElute 96 잘 접시 위에 설명 된대로 진공 매니 폴드를 사용하여 PCR 제품의 나머지 50 μl를 청소합니다. 우물에서 50 μl ddH 2 O를 배치 한 후 다시 진공 청소기로 청소하여 한 번 씻으십시오. </li><li> 30 μl TE에 Resuspend하고 깨끗한 96 잘 판에 전송할 수 있습니다. </li><li> 각 샘플에 DNA의 농도를 결정합니다. 하나의 1.5 ML의 microfuge 관 DNA의 동등한 양의 조화를 이루고 있습니다. 이 Illumina HiSeq 2000 시스템의 단일 차선으로 순서가되어있는 라이브러리 될 것입니다. 이 Illumina 실행의 단일 차선에서 순서 수백 종양을 할 수 있습니다. </li><li> 제출시퀀싱에 대한 모든 종양에서 DNA의 동등한 양을 포함하고있는 단일 관. 이는 기관이나 상업적으로 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 5. Transposon에 삽입 분석 <ol><li> transposon 삽입 데이터를 분석 소프트웨어는 소스 포지 (를 통해 무료로 다운로드 할 수 있습니다 <a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a> ). TapDance라는 프로그램은, Illumina 플랫폼과 라이브러리지도 텍스트 파일에 바코드에서 시퀀스 파일이 필요합니다. </li></ol>

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저자는 공개 할 수 없어요.

잠자는 숲속의 미녀 transposon 시스템을 사용하여 앞으로 유전자 화면은 원인 암 변이를 식별하는 방법을 제공합니다. 모든 predisposing 변이에 추가 Cre Recombinase를 제어 할 수있는 적절한 프로모터를 선택하면, SB 화면이 알려져 파악하고 새로운 후보 암 유전자 것입니다. SB 화면의 성공은 화면을 만들 때 선택한 마우스에 달려 있습니다. transposon를 들어, 우리는 서로 다른 염색체 7 일 종양 발생 transposons의 concatamer을 가진 두 개의 서로 다른 마우스 변종을 사용하는 것이 좋습니다. SB의 transposase을 활성화합니다 조직 별 Cre의 Recombinase을 선택할 때 조심스럽게 생각 사용해야합니다. Cre 효소가 모델로되는 암의 기원 세포되고 의심​​되는 세포 유형에서 활성화되어 있다는 증거가 있어야합니다. 성공적인 예는 Villin-Cr...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 그래 - 인감 유도 상공 회의소 </td><td> 브레인 트리 과학 </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10 % 포르말린 버퍼 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 강수량 솔루션 </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 용해 버퍼 </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE 버퍼 </td> &lt;TD&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> 96 잘 접시를 MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28,051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96 진공 매니 폴드 </td><td> Qiagen </td><td> 19,504 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 MicroPlate 지니, 120V </td><td> 과학 산업 주식회사 </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 5 배 결합 버퍼와 T4 DNA ligase의 </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mM dNTPs </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> 플래티넘 DNA 형성 촉매 </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 </td><td> 로슈 </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> 태 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE 버퍼 </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

의 식별<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em링커로 인한 pcr을 사용하여 고체 종양의&gt; transposon의 삽입

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

인간 종양의 게놈, proteomic transcriptomic, 그리고 epigenomic 분석은 일치하는 정상 조직에 비해 각 암 게놈 내에서 이상 수천이 있다는 것을 나타냅니다. 이러한 분석을 바탕으로 암은 하나의 많은 알려지지 않은 유전자 드라이버가 있다는 것을 분명하다. 불행하게도 이러한 드라이버는 직접 종양 형성에 기여하지 않는 게놈의 여객 이상의 훨씬 더 큰 숫자 안에 숨겨져 있습니다. 암 게놈의 또 다른 측면은 비슷 종양 유형에서 상당한 유전 이질성이 있다는 것입니다. 각 종양은 종양 형성 2 선택적 이점을 제공합니다 다른 변이를 가지고 있고, 할 수 있습니다. 여객 변이의 배경을 줄이면서 쥐 편견 앞으로 유전 화면을 수행하면, 종양을 생성하고 자신의 유전자 구성을 분석 할 수있는 도구를 제공합니다. 슬리핑 뷰티 (SB) transposon 시스템은 하나의 방법 3. SB 시스템은 모바일 v를 활용transposase 효소에 의해 게놈 전체에 삽입 할 수 ectors (transposons). 변이는 Cre Recombinase에 의해 활성화되는 조건 transposase의 allele의 사용을 통해 특정 세포 유형으로 제한됩니다. 대부분의 마우스 라인은 특정 조직에서 해당 표현 Cre의 Recombinase을 존재합니다. 조건부 transposase의 allele (예 : 훈제 연어 스톱 - 훈제 연어 - SB11)에 다음 줄 중 하나를 횡단함으로써, SB 시스템은 명시 적 Cre Recombinase 세포에서 활성화됩니다. Cre Recombinase은 소비세 정지 카세트를 의지 해당하므로 지정된 셀 유형에서 transposon의 mutagenesis를 활성화 transposase allele의 블록 식. 실험 쥐가 조건부 transposase의 allele, transposons의 concatamer 및 조직 별 Cre의 Recombinase의 allele을 가지고 있도록 SB 화면이 유전자 변형 생쥐의 세 변종을 사육에 의해 시작됩니다. 이 마우스는 종양 양식까지 연령에 허용들이 죽어가는이 될 수 있습니다. 마우스 했군요necropsied 및 게놈 DNA는 종양으로부터 격리되어 있습니다. 다음으로, 게놈 DNA는 링커로 인한-PCR을 받게 (LM-PCR)는 SB transposon을 포함하는 게놈 loci의 증폭의 결과.입니다 LM-PCR은 단일 종양의 4 transposon의 삽입을 포함하는 게놈 loci의 수백을 대표하는 고유 amplicons 수백하게됩니다 단일 종양을 수행했습니다. 모든 종양의 transposon의 삽입 분석하고 일반적인 삽입 사이트 (CISs)는 적절한 통계 방법 5를 사용하여 식별됩니다. CIS 내에서 유전자 oncogenes 또는 종양 억제 유전자가 될 가능성이 매우 높다고 있으며, 후보 암 유전자로 간주됩니다. 후보 암 유전자를 식별 할 수 SB 시스템을 사용의 장점은 다음과 같습니다의 순서는, 2 알려져 있기 때문에 1) transposon은 쉽게 전위는 거의 모든 세포 유형으로 이동하고 3) transposon이 가능하다 할 수 있습니다) 게놈에 위치 될 수있다 소개 모두 이득과 손실 기능 돌연변이 6. followiNG 프로토콜은 후보 암 유전자 (그림 1)을 식별하기 위해 SB transposon 시스템을 사용하여 앞으로 유전자 화면을 고안하고 실행하는 방법에 대해 설명합니다.

번식 체계가 설립 된 후, 브마다 19~21일 쓰레기를 생산해야합니다. 쓰레기 크기는 브 및 유전 배경의 연령에 따라, 5 사이 12 새끼를 달라집니다. 또한, 쓰레기의 유전자형이 번식 체계가 정확하고 성공적인 모두 있는지 확인하는 방법으로 Mendelian 유전학을 준수하는지 확인하십시오. 실험이 성공하기 위해서는 실험 동물의 종양 발병률은 제어 동물에서 종양 발생률보다 훨씬 커야한다. 더 &quot;predisposing&quot;돌연변이가 실험에 포함되지 않은 경우 제어 동물의 종양에 몇 가지가 있어야합니다. &quot;predisposing&quot;변이가 실험에 포함 된 경우,이 동물의 종양 발병률은 돌연변이와 SB 활동과 동물의 발생보다 훨씬 낮을 수 있습니다. LM-PCR은 단일 종양에 transposon의 삽입 수백 증폭해야합니다. 헥타르를 실행 한 후1 % 젤의 보조 PCR 제품의면이 증폭를 대표하는 DNA의...

편견 접근법을 사용하여 발암의 알 수없는 드라이버를 식별하는 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 사용<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em특정 조직으로 이동하는 임의의 mutagen으로&gt; transposon. 종양 형성을 유도 transposon의 삽입의 게놈지도는 소설 oncogenes와 종양 억제 유전자를 식별

의 식별<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em링커로 인한 PCR을 사용하여 고체 종양의&gt; Transposon의 삽입

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

이 절차는 종양 형성을 유도하는 마우스의 삽입에 대한 전치를 매핑하여 새로운 종양 유전자 및 종양 억제 유전자를 식별하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 형질전환 마우스 모델에서 종양을 생성하고 채취하여 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 종양 DNA를 분리하고, 링커 매개 PCR을 수행한 다음, 증폭된 DNA 샘플의 염기서열을 분석하고 삽입 시 전치를 분석하는 것입니다.궁극적으로 이 절차는 후보 종양 유발 유전자를 식별합니다. 수면 미용 트랜스포존을 사용하여 유전자 스크리닝을 위한 비편향과 함께 링커 매개 PCR을 사용하는 주요 이점은 암의 새로운 유전적 동인을 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 항상 희생된 쥐의 외부에 70% 에탄올을 분사하여 해부를 시작합니다.수집된 조직과 종양은 50-100mg 크기의 4개 섹션으로 나뉘어야 합니다. 10% 완충된 포르민의 한 부분을 18시간 동안 고정한 다음 70% 에탄올을 수정하십시오. 이 섹션은 h 및 e 염색 및/또는 면역조직화학에 사용할 수 있습니다.나머지 부분을 액체 질소로 스냅 동결합니다. 이들은 냉동고에 보관하고 D-N-A-R-N-A 및 단백질 분리에 사용하여 냉동 종양 샘플에서 DNA를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 면도날로 조직을 잘게 다집니다.다음으로, 1.5ml 튜브에서 1ml의 세포 용해 완충액과 1ml당 20mg의 5마이크로리터로 조직을 소화합니다. 프로테아제 K 용액을 혼합물을 철저히 와류시키고 표준 이소프로판올 기반 DNA 추출을 진행합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 링커를 어닐링하여 이 프로토콜을 시작합니다.각 링커 용액 50마이크로리터를 농축 염화나트륨 2마이크로리터와 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 95도의 열 블록에 넣습니다. 5분 후 불을 끄고 실온으로 천천히 식히면 냉각 후 한 시간 이상 걸릴 수 있습니다.항문 링커는 필요할 때까지 냉동실에 보관할 수 있습니다. Ali가 각 샘플에서 1마이크로그램의 DNA를 인용하여 96웰 플레이트 모두의 해당 웰로 2개의 96웰 플레이트를 준비합니다. 예를 들어, 샘플 1의 DNA 1마이크로그램을 두 웰 플레이트 중 하나의 웰 A에 배치합니다.96 웰 플레이트 중 하나의 DNA는 우측 효소 NLA 3을 사용하여 분해되고 다른 96 웰 플레이트의 DNA 샘플은 좌측 효소 BFA 1을 사용하여 분해됩니다. DNA가 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 소화되도록 합니다. 다음날, 20 분 동안 효소를 비활성화하는 열로 소화를 완료하십시오.이제 미니 루트 96 웰 플레이트를 사용하여 소화 반응을 청소합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 샘플을 미니 전리품으로 옮깁니다. 96 웰 플레이트.미니 전리품 96 웰 플레이트를 진공 매니폴드에 놓습니다. 웰이 마를 때까지 플레이트에 진공을 적용합니다. 일반적으로 이 프로토콜 전체에서 15분입니다.시료가 오염되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 96으로 작업할 때 웰 플레이트는 웰을 가능한 한 캡으로 덮고 원치 않는 액체가 한 방울 떨어지면 샘플이 손상될 수 있으므로 열린 웰 위로 피펫을 통과하지 않도록 합니다. 진공 매니폴드에서 미니 전리품 플레이트를 제거하고 완전히 마를 때까지 종이 타월로 플레이트 바닥을 막습니다.미니 전리품에 DNA를 재현탁합니다. 96 웰 플레이트에 30마이크로리터의 이중 증류수를 각각 추가합니다. 미니 전리품 접시를 2분 동안 높게 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.그런 다음 미니 전리품 상자 내용물을 깨끗한 96웰 플레이트에 옮깁니다. 링커 결찰 반응을 수행합니다. 충분한 양의 ligation buffer, 3.2 T 4 DNA ligase 단계의 kneeled linkers 및 시약 저장소의 물을 혼합하여 ligation 반응을 준비합니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 이전 단계에서 분해된 DNA 10마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 모든 웰에 대한 결찰 반응의 10 마이크로 리터를 Eloqua에 사용합니다. 어쨌든, 우물에는 DNA와 결찰 시약이 가득 들어 있습니다.섭씨 16도에서 4시간에서 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 다음 날 아침. 섭씨 65도에서 10분 동안 T 4 리가아제를 비활성화하여 결찰을 종료합니다.이전과 마찬가지로 미니 전리품 플레이트와 진공 매니폴드를 사용하여 결찰 반응을 청소하여 플레이트를 건조시킨 다음 완전히 건조될 때까지 플레이트 바닥을 닦아냅니다. DNA를 30마이크로리터의 이중 증류수에 재현탁합니다. 오비탈 셰이커에 2분 동안 올려놓고 미니 전리품 접시 내용물을 깨끗한 접시에 옮깁니다.다음으로, bam H 1로 두 번째 DNA 분해를 수행하여 나머지 concat transposon을 파괴합니다. DNA를 섭씨 37도에서 3-6시간 동안 또는 하룻밤 동안 소화한 다음 이전과 동일한 절차에 따라 미니 전리품 플레이트를 사용하여 소화를 청소합니다. 전치에 대한 특이적 프라이머 및 링커에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 30 사이클 PCR을 수행합니다.반응에는 링커가 있는 소화된 DNA의 3마이크로리터가 포함되어야 합니다. 다음으로 미니 루트를 사용하여 PCR 반응을 정리합니다. 이전에 수행된 96개의 웰 플레이트와 진공 매니폴드.DNA를 30마이크로리터의 물에 재현탁시키고 현탁액을 깨끗한 96으로 옮깁니다. 2마이크로리터의 희석된 생성물을 사용하여 2마이크로리터의 PCR 반응 생성물을 148마이크로리터의 이중 증류수로 희석하여 진행하십시오. 100마이크로리터 용량의 프라이머의 중첩 버전을 사용하여 30주기 PCR을 수행합니다.이 프라이머는 Illumina GA two X 기계용입니다. 각 샘플에는 PCR 실행에서 고유한 12 염기쌍 바코드가 있으며, AUM 브로마이드가 포함된 1% 겔에 각 제품의 45마이크로리터가 있습니다. 종양에 있는 다양한 transposon insertion의 앰플리콘을 나타내는 PCR 산물의 smear가 있어야 합니다.앞서 설명한 진공 세척 방법을 사용하여 나머지 50마이크로리터의 PCR을 세척한 다음 DNA를 50마이크로리터의 물에 재현탁하고 진공 세척을 다시 수행합니다. 이제 Resus는 30마이크로리터의 TE에 DNA를 현탁시키고 깨끗한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다.그런 다음 각 샘플의 DNA를 동일한 양으로 단일 튜브에 결합합니다. 각 샘플이 프로토콜을 사용하여 고유한 바코드 프라이머를 사용하여 생성되는 한 Illumina 실행의 단일 레인에서 수백 개의 DNA 샘플을 염기서열분석하는 것이 가능합니다. 성공적인 L-M-P-C-R은 1%gel에 이차 PCR 제품의 절반을 달린 후에 단 하나 종양에 있는 삽입에 수백의 전치를 증폭해야 한다, DNA의 얼룩은 이 확대를 대표한다.LM PCR이 실패하면 DNA의 번짐이 없을 것입니다. 대신, Illumina GA two X 플랫폼의 단일 레인에서 1개에서 200개의 종양을 염기서열분석하는 DNA 염기서열 대역의 최종 밴드는 이 절차를 시도하는 동안 각각 100개의 염기쌍으로 구성된 3,000만 개 이상의 염기서열을 생성해야 합니다. 이 절차에 따라 오염이 발생하지 않도록 천천히 조심스럽게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.새로 발견된 암의 유전적 동인에 대한 분석은 이러한 동인 중 어떤 것이 치료 대상이 될 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

여기에서는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포존 DNA를 사용하여 새로운 교모세포종(GBM)을 유도, 모니터링 및 분석하는 효율적이고 다재다능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하부의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

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여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

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종양 내 이질성, 온코스트림 및 침략의 공간 및 분자 특성화를 위한 신경교종 소구역의 레이저 캡처 미세 분해

전임상 테스트를 위해 일반적인 환자 돌연변이에 의해 유도되는 면역 능력이 있는 자가종양 모델을 활용하는 것은 면역 치료 테스트에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 일반적인 환자 돌연변이를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용하여 뇌종양 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하므로 정확하고 재현 가능하며 일관된 마우스 모델을 제공합니다.

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures(환자 돌연변이 시그니처를 나타내는 플라스미드 DNA의 전기천공법 기반 전달을 사용한 생체 내 뇌종양 모델링)

배우세요 Sleeping Beauty 트랜스포존 삽입 매핑을 통해 생쥐 모델에서 새로운 종양 유발 유전자와 억제 유전자를 식별하는 방법을. 링커 매개 PCR과 시퀀싱을 활용한 이 기법은 암 유전학 연구에 유용합니다.

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