의 식별 잠자는 숲속의 미녀 Transposon의 삽입

이 절차는 종양 형성을 유도하는 마우스의 삽입에 대한 전치를 매핑하여 새로운 종양 유전자 및 종양 억제 유전자를 식별하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 형질전환 마우스 모델에서 종양을 생성하고 채취하여 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 종양 DNA를 분리하고, 링커 매개 PCR을 수행한 다음, 증폭된 DNA 샘플의 염기서열을 분석하고 삽입 시 전치를 분석하는 것입니다.

궁극적으로 이 절차는 후보 종양 유발 유전자를 식별합니다. 수면 미용 트랜스포존을 사용하여 유전자 스크리닝을 위한 비편향과 함께 링커 매개 PCR을 사용하는 주요 이점은 암의 새로운 유전적 동인을 쉽게 식별할 수 있다는 것입니다. 항상 희생된 쥐의 외부에 70% 에탄올을 분사하여 해부를 시작합니다.

수집된 조직과 종양은 50-100mg 크기의 4개 섹션으로 나뉘어야 합니다. 10% 완충된 포르민의 한 부분을 18시간 동안 고정한 다음 70% 에탄올을 수정하십시오. 이 섹션은 h 및 e 염색 및/또는 면역조직화학에 사용할 수 있습니다.

나머지 부분을 액체 질소로 스냅 동결합니다. 이들은 냉동고에 보관하고 D-N-A-R-N-A 및 단백질 분리에 사용하여 냉동 종양 샘플에서 DNA를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 면도날로 조직을 잘게 다집니다.

다음으로, 1.5ml 튜브에서 1ml의 세포 용해 완충액과 1ml당 20mg의 5마이크로리터로 조직을 소화합니다. 프로테아제 K 용액을 혼합물을 철저히 와류시키고 표준 이소프로판올 기반 DNA 추출을 진행합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 링커를 어닐링하여 이 프로토콜을 시작합니다.

각 링커 용액 50마이크로리터를 농축 염화나트륨 2마이크로리터와 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 95도의 열 블록에 넣습니다. 5분 후 불을 끄고 실온으로 천천히 식히면 냉각 후 한 시간 이상 걸릴 수 있습니다.

항문 링커는 필요할 때까지 냉동실에 보관할 수 있습니다. Ali가 각 샘플에서 1마이크로그램의 DNA를 인용하여 96웰 플레이트 모두의 해당 웰로 2개의 96웰 플레이트를 준비합니다. 예를 들어, 샘플 1의 DNA 1마이크로그램을 두 웰 플레이트 중 하나의 웰 A에 배치합니다.

96 웰 플레이트 중 하나의 DNA는 우측 효소 NLA 3을 사용하여 분해되고 다른 96 웰 플레이트의 DNA 샘플은 좌측 효소 BFA 1을 사용하여 분해됩니다. DNA가 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 소화되도록 합니다. 다음날, 20 분 동안 효소를 비활성화하는 열로 소화를 완료하십시오.

이제 미니 루트 96 웰 플레이트를 사용하여 소화 반응을 청소합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 샘플을 미니 전리품으로 옮깁니다. 96 웰 플레이트.

미니 전리품 96 웰 플레이트를 진공 매니폴드에 놓습니다. 웰이 마를 때까지 플레이트에 진공을 적용합니다. 일반적으로 이 프로토콜 전체에서 15분입니다.

시료가 오염되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 96으로 작업할 때 웰 플레이트는 웰을 가능한 한 캡으로 덮고 원치 않는 액체가 한 방울 떨어지면 샘플이 손상될 수 있으므로 열린 웰 위로 피펫을 통과하지 않도록 합니다. 진공 매니폴드에서 미니 전리품 플레이트를 제거하고 완전히 마를 때까지 종이 타월로 플레이트 바닥을 막습니다.

미니 전리품에 DNA를 재현탁합니다. 96 웰 플레이트에 30마이크로리터의 이중 증류수를 각각 추가합니다. 미니 전리품 접시를 2분 동안 높게 설정된 궤도 셰이커에 놓습니다.

그런 다음 미니 전리품 상자 내용물을 깨끗한 96웰 플레이트에 옮깁니다. 링커 결찰 반응을 수행합니다. 충분한 양의 ligation buffer, 3.2 T 4 DNA ligase 단계의 kneeled linkers 및 시약 저장소의 물을 혼합하여 ligation 반응을 준비합니다.

멀티 채널 피펫을 사용하여 이전 단계에서 분해된 DNA 10마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 모든 웰에 대한 결찰 반응의 10 마이크로 리터를 Eloqua에 사용합니다. 어쨌든, 우물에는 DNA와 결찰 시약이 가득 들어 있습니다.

섭씨 16도에서 4시간에서 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 다음 날 아침. 섭씨 65도에서 10분 동안 T 4 리가아제를 비활성화하여 결찰을 종료합니다.

이전과 마찬가지로 미니 전리품 플레이트와 진공 매니폴드를 사용하여 결찰 반응을 청소하여 플레이트를 건조시킨 다음 완전히 건조될 때까지 플레이트 바닥을 닦아냅니다. DNA를 30마이크로리터의 이중 증류수에 재현탁합니다. 오비탈 셰이커에 2분 동안 올려놓고 미니 전리품 접시 내용물을 깨끗한 접시에 옮깁니다.

다음으로, bam H 1로 두 번째 DNA 분해를 수행하여 나머지 concat transposon을 파괴합니다. DNA를 섭씨 37도에서 3-6시간 동안 또는 하룻밤 동안 소화한 다음 이전과 동일한 절차에 따라 미니 전리품 플레이트를 사용하여 소화를 청소합니다. 전치에 대한 특이적 프라이머 및 링커에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 30 사이클 PCR을 수행합니다.

반응에는 링커가 있는 소화된 DNA의 3마이크로리터가 포함되어야 합니다. 다음으로 미니 루트를 사용하여 PCR 반응을 정리합니다. 이전에 수행된 96개의 웰 플레이트와 진공 매니폴드.

DNA를 30마이크로리터의 물에 재현탁시키고 현탁액을 깨끗한 96으로 옮깁니다. 2마이크로리터의 희석된 생성물을 사용하여 2마이크로리터의 PCR 반응 생성물을 148마이크로리터의 이중 증류수로 희석하여 진행하십시오. 100마이크로리터 용량의 프라이머의 중첩 버전을 사용하여 30주기 PCR을 수행합니다.

이 프라이머는 Illumina GA two X 기계용입니다. 각 샘플에는 PCR 실행에서 고유한 12 염기쌍 바코드가 있으며, AUM 브로마이드가 포함된 1% 겔에 각 제품의 45마이크로리터가 있습니다. 종양에 있는 다양한 transposon insertion의 앰플리콘을 나타내는 PCR 산물의 smear가 있어야 합니다.

앞서 설명한 진공 세척 방법을 사용하여 나머지 50마이크로리터의 PCR을 세척한 다음 DNA를 50마이크로리터의 물에 재현탁하고 진공 세척을 다시 수행합니다. 이제 Resus는 30마이크로리터의 TE에 DNA를 현탁시키고 깨끗한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 샘플의 DNA 농도를 측정합니다.

그런 다음 각 샘플의 DNA를 동일한 양으로 단일 튜브에 결합합니다. 각 샘플이 프로토콜을 사용하여 고유한 바코드 프라이머를 사용하여 생성되는 한 Illumina 실행의 단일 레인에서 수백 개의 DNA 샘플을 염기서열분석하는 것이 가능합니다. 성공적인 L-M-P-C-R은 1%gel에 이차 PCR 제품의 절반을 달린 후에 단 하나 종양에 있는 삽입에 수백의 전치를 증폭해야 한다, DNA의 얼룩은 이 확대를 대표한다.

LM PCR이 실패하면 DNA의 번짐이 없을 것입니다. 대신, Illumina GA two X 플랫폼의 단일 레인에서 1개에서 200개의 종양을 염기서열분석하는 DNA 염기서열 대역의 최종 밴드는 이 절차를 시도하는 동안 각각 100개의 염기쌍으로 구성된 3,000만 개 이상의 염기서열을 생성해야 합니다. 이 절차에 따라 오염이 발생하지 않도록 천천히 조심스럽게 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

새로 발견된 암의 유전적 동인에 대한 분석은 이러한 동인 중 어떤 것이 치료 대상이 될 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다.