Name: 강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 마우스 호흡기 역학 측정을 위한 강제 진동 기술을 사용한 flexiVent 시스템 활용법. 메타콜린 흡입 후 기도 반응성을 정량적으로 평가하여 폐 기능을 종합적으로 분석하는 정확한 실험 방법론을 제공합니다.

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TKMcG는 캐나다 흉부 학회에서 재학 의해 지원됩니다. 저자의 공헌 모든 저자는 원고의 개념에 참여했다. 또한, TKMcG이 프로젝트를 시작한 실험 결과를 수집, 원고의 작성 및 그 중요한 검토에 공헌했다. AR를 수집하고 분석 실험 결과, 원고의 초안을 작성하고 중요한 평가에 기여했다. LF 실험 결과를 수집하고 원고의 중요한 평가에 기여했다. TFS와 JGM는 원고의 중요한 평가에 기여했다.

아래에서 설명하는 절차는 동물 케어 (CCAC)에 캐나다위원회의 지침에 따라 맥길 대학 기관 동물 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 준비 단계 <ol><li> 솔루션 : <ol><li> 메타 콜린 : 50 밀리그램 / ML에서 재고 솔루션을 준비하고 5를 테스트 할 농도에 따라 직렬 희석 (1:1)를 확인합니다. 솔루션 5 nebulizing 전에 실내 온도에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 마취제 : 다른 요법은 생쥐 (표 1)의 여러 변종 문헌에보고되었다. 주 : 레지 1은 현재 프로토콜에서 사용되었다. </li></ol></li><li> 장비 : 현재 프로토콜은 flexiWare 7 소프트웨어에서 지원하는 두 개의 flexiVent 세대 중 하나에 적용됩니다. 연구의 정의 및 계획, 실험 Sessio : 소프트웨어 기능은 3 개의 모듈 아래에 그룹화됩니다n과 검토 및보고. <ol><li> 시스템 (flexiVent FX 전용) 및 / 켜거나 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 첫 번째 실험 세션이나 그 이전 언제든지 학습 구조를 미리 정의 할 연구 정의 및 계획 모듈을 엽니 다. </li><li> 만들기 새로운 연구 버튼을 클릭하고, 연구 결과를 생성 프로토콜을 설명하고 연구하는 실험 집단과 과목을 정의하는 마법사를 따르십시오. </li><li> 실험 세션 모듈을 열고 연구와 템플릿 선택을위한 스타트 업 순서에 따라 실험 세션을 시작합니다. </li><li> 측정 사이트에 대한 주제를 할당하고 그 무게를 확인합니다. </li><li> 운영 소프트웨어에 설명 된 단계를 수행하여 시스템의 교정을 진행합니다. 당신은 교정 Y-튜브에 사용되는 정맥 (단계 1.3.3)를 첨부 한 지점하라는 메시지가 표시됩니다. </li><li> 중요한 단계. 반복 하오얻어진 보정 값이 허용 범위를 벗어난 경우 t는 1.2.6 단계. (보정 값의 모듈 특정 허용 범위에 대한 flexiVent FX 또는 flexiWare 7 사용자 설명서를 참조하십시오). </li><li> 취소 실험을 시작하기 위해 준비하지 않는 환기 및 데이터 기록을 시작하라는 메시지를 표시합니다. 이들은 나중에 지점에서 시작할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 주제 : <ol><li> 마취제의 적절한 용량 (표 1)를 사용하여 피사체를 마취. </li><li> 피사체가 마취의 수술 수준에 도달했는지 확인합니다. 주제는 발가락 핀치에 어떤 반응을 보여주지해야하며, 그 호흡은 정기적 수고하지해야합니다. </li><li> 기관 절개술을 수행하고 기관을 cannulate. <ol><li> 그 뒷면에 동물을 배치하고 열 소스 (마우스에서 약 45 센티미터 과열을 방지하기 위해에 위치한 60 와트 전구 예를 들어, 온도 조절 난방 담요 또는 램프) 제공합니다. </li><li> 청소 일전자 목 알코올 지역의 피부 절개를 만들고 부드럽게 submaxillary 선하고 취재 근육 층을 분리하여 기관을 노출합니다. </li><li> 부드럽게 마이크로 포셉 한 쌍을 사용하여기도를 들어 올려 아래에 봉합을 전달합니다. </li><li> 그것을 단면 않고기도에 작은 절개를 만들 수있는 후두 가까운 연골의 두 개의 링 사이에 잘​​라. </li><li> 절개로 이전 보정 캐 뉼러를 삽입하고 기관 내부 부드럽게 약 5 반지의 길이 주를 사전 :. 본 실험은 1.2 cm 긴 금속 18 게이지 정맥을 사용하여 수행되었다합니다. </li><li> 중요한 단계. 봉합사를 사용 장소에 정맥을 고정합니다. 첨부 정맥 주위에 완벽한 밀봉을 형성해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 기계 환기 <ol><li> 인공 호흡기에 가까운 동물을 가져옵니다. </li><li> 사전 정의를 선택하여 기계 환기를 시작합니다또는 환기 표시기의 정의 환기 프로필입니다. </li><li> Y-튜브를 통해 인공 호흡기에 동물을 연결합니다. </li><li> 중요한 단계. 인공 호흡기에 동물을 맞추고 기관 캐뉼라가 가능한 정맥 폐쇄 나 기관 트위스트를 방지하기 위해 인공 호흡기와 같은 수준에 있는지 확인합니다. </li><li> 중요한 단계. 정맥 삽입 및 첨부 파일을 확인 섭동 이름을 두 번 클릭하여 깊은 인플레이션 섭동을 실행합니다. 누설의 유무, 시스템은 과도한 볼륨 변위 (그림 1)하지 않고 3 초 동안 30 CMH 2 O의 압력을 유지 할 수 있어야한다. 이러한 정맥 폐쇄 또는 잘못된 위치를 나타낼 수로 기록 된 볼륨 및 압력 흔적도없이 오프셋의 증상이나 변형으로 부드럽게해야합니다. </li><li> 필요한 경우, 심장 박동과 체온 모니터링을위한 중요한 사인 트랜스 듀서를 연결합니다. 데이터 기록은 eithe 시작할 수 있습니다스크립트를 통해 수동 또는 자동으로 R. </li></ol> 3. 폐 기능 측정 측정 또는 명령 (예 : 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 활성화, 이벤트 마커) 높은 통제하고 반복적 인 실험 과정을 (그림 2)에 대한 미리 정의 된 또는 사용자 정의 스크립트를 사용하여 자동화 할 수 있습니다. 매개 변수의 수에 상승을주는 교란 여섯 가족은 기준에 따라 호흡 시스템 역학을 설명하는 데 사용하고 주어진 과제 (표 2)에 따라 할 수있다. <ol><li> 중요한 단계. 측정을 시작할 준비가되면 폐쇄 폐 영역을 보충하고 폐 볼륨 히스토리를 표준화하는 깊은 인플레를 실행합니다. </li><li> 중요한 단계. 테스트 측정 (예를 들어, PV가-P 또는 PV가-V)를 실행하여 자연 흡기 노력의 부재를 확인합니다. 선택한 데이터 집합 뷰에서 압력 신호 트레이스를 관찰합니다. 단계적 PV 곡선으로,압력 고원은 잘, 아래쪽 변형으로 정의되어야한다. 압력 아래 스윙은 동물에서 흡기 노력 (그림 3)를 나타냅니다. </li><li> 제목을 두 번 클릭하여 선택한 스크립트를 시작합니다. 본 연구에 사용 된 스크립트는 일반적으로 측정을 포함 : <ul><li> 세중의에서 기준 측정의 시퀀스입니다. </li><li> . 흡입 메타 콜린 참고기도 응답의 평가를위한 분무기의 활성화 : 시스템에 연결되면, 분무기에 식염수 또는 메타 콜린의 용액 약 100 μl를로드합니다. 분무가 자동으로 시작되고 중지됩니다. </li><li> 분무기의 활성화에 따라 약 3 분의 기간 동안 밀접하게 간격 측정 (매 15 초)의 순서. </li><li> 프롬프트가 또 다른 도전을 수행하고 측정의 순서를 반복합니다. 주 : B의 면봉으로 분무기 마운트 내부 건조etween 문제는 흡기 라인에서 건물까지의 물방울 결로를 방지 할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 실험의 끝에, 환기를 중지하고 피사체를 분리합니다. </li><li> 운영 소프트웨어의 다음 주제로 전환하고 그 무게를 확인합니다. </li><li> 중요한 단계. 헹구고 분무기, 어댑터, Y-튜브,과 과목 사이의 정맥을 건조. </li><li> 3.6 단계 1.2.6를 반복합니다. </li><li> 하루의 끝에서, 실험 세션을 닫습니다. 헹굼 및 건조 분무기, 어댑터, Y-튜브, 및 정맥을 제조 업체의 지침에 따라 실험실을 떠나기 전에 시스템 호기 밸브를 청소해야합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 소프트웨어가 자동으로 계산하고 교란과 관련된 매개 변수를 표시합니다. 또한 데이터에 대한 수학적 모델의 적합을 반영하는 결정 계수 (COD)를 제공합니다. 다핵 각 데이터 집합소프트웨어에 의해 제외로 fficient COD가 표시됩니다. 실험 세션의 검토는, 데이터를 재 분석 및 내보내기 시나리오의 생성은 소프트웨어의 검토 및보고 모듈에서 수행됩니다. <ol><li> 검토 및보고 모듈을 엽니 만 충분한 COD를 갖는 데이터 집합을 포함하도록주의하면서 수출 시나리오를 만들 수 있습니다. </li><li> 필요한 파라미터, 압력 또는 흐름 볼륨 커브, 원시 데이터 집합 신호 또는 스프레드 시트 응용 프로그램에 따라 정보 (표 3 참조)로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 시간의 함수로 각 매개 변수와 플롯의 평균 기준선 측정은 모든 측정 (그림 4 참조). 그런 다음, 곡선 아래의 면적을 계산 곡선의 일반적인 프로파일을 분석하거나 통계 분석을 수행하도록 선택할 수 있습니다. </li><li> 메타 콜린의 농도의 함수로기도 응답의 결과를 표현하는 각각의 주제에 대해 매개 변수 및 실험 조건 별 하나를 결정점 (예를 들어, 피크) 또는 각 메타 콜린 공격 후 특정 시간. 각 실험 조건 (표 4, 그림 5)의 그룹 평균과 보고서 나 플롯 결과를 계산합니다. </li><li> 정규화를 적용 (예 : % 기준선) 또는 통계 분석을 수행, 당신은 또한 주어진 매개 변수 기준 값 (그림 5C PC 200)의 두배를 생산 농도를 계산 고려할 수 있습니다. </li></ol>

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그것은 천식 및 다른 폐 질환과 관련기도 장애의 지속적인 연구는 질병 치료 옵션 개발의 기본 메커니즘의 이해에 중요 남아있다. 모델기도 질환 생쥐의 사용은 이러한 질병 메커니즘으로 이해하는 데 필수적이다. 폐 기능을 측정하는 것이 중요합니다되는 안정적이고 정확한 툴을 가지고, 마우스의 작은 주제에 평가를기도 장애를 고려합니다. 또한,기도 장애 또는 치료 효과의 위치에 통찰력을 제공 할 수있는 도구를 가지고하는 것은 매우 유용합니다. FOT 기술은 이러한 모든 특성을 결합하여 생리적 변화를 평가하는 강력한 통합 및 번역 방법을 제공합니다. 생쥐의 측정이 유형 성공하기 위해서는 특별한주의 즉, 몇 단계로 시스템의 교정, 기관 내 CA의 저항을 제공해야nnula, 분무기의 종류 (뿐만 아니라 그 동작 설정 등) 동물과 폐 볼륨 히스토리의 표준화의 위치. 또한, 피사체의 호흡 시스템은 측정시 수동적 남아 유효한 데이터 집합을 얻기 위해 필수적입니다. 이 가사 (표 1 참조) 유도 될 마취의 깊이면이나과 호흡에 의한 작업, 근육 마비 제의 투여에 의해 달성 될 수있다. 원하는 경우 마우스의 측정을 위해 필요한 기술을 습득하면서 조사자는 시험 부하와 함께, 마스터 시스템 및 운영 소프트웨어로 시작할 수 있습니다. 그런 다음 질병 모델 또는 처리 된 마우스로 이동하기 전에 순진한 동물의 재현 가능한 결과를 생성 할 논리적 인 것입니다. 호흡기 연구에 질병 모델의 중요한 비율은 알레르기 항원, 독소, 오염 물질, 담배 연기 또는 가스, measuremen으로 얻은 결과의 변화와 같은 에이전트에 동물을 노출 포함하기 때문에이 문서에서 설명하는 T 기술은 따라서 사용되는 노출 프로 시저에 의해 영향을받을 수 있습니다. 주요 실험 과정의 표준화 (컴퓨터 제어 노출 측정 시스템 6, 13, 14을 사용하는 등) 잠재적 변동성 감소에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 장점뿐만 아니라 기술의 한계를 강조하면서이 문서에서 제시된 예제는 순진과 염소에 노출 된 쥐 실험에서 전형적인 결과의 선택을 나타냅니다. 그림 6의 예를 들어 볼 수 있듯이,이 기술은 재생 폐 기능 측정을 생성 할 수 있습니다. 유사한 기준 저항 값이 마우스 변종 사이에보고 된 반면, elastance의 차이는 있지만 15 관찰되었다. 실질적인 변화는 유아와 성인 마우스 16 사이에 예상 할 수도 있습니다. 같은 일 같은 생체 생리 학적 평가, 높은 정밀도 결과, 다른도FOT에 의해 생성 된 OSE는 주제의 자연 상태로 양보를 갖추고 있습니다. 표현형의 불확정성 원리 1이라고이 원칙은, 측정, 마취에서 만든 (또는 경구 삽관) tracheotomised 및 기계적 과목을 환기해야한다는 의미에서이 의정서에 적용됩니다. 이 기술의 또 다른 제한은 데이터를 일정한 단계 모델의 적합 기관지의 중간 수준보다 가난하기 때문에 데이터가 염소에 노출 된 그룹의 높은 농도에서 사용할 수없는 그림 5D-5F에서 관찰된다. 그러나 심각 bronchoconstricted 동물은 직접 15, 또는 예를 들어 계정으로 기계 기능 17 이질성을 가지고, 더 복잡한 수학적 모델에 맞게 타사 사후 분석 소프트웨어를 사용하여 ZRS를 분석하여 평가 될 수있다. 동물의기도가 충분히 피하지 않은 경우 제외 셋도 관찰 할 수있다assive 또는 정맥의 저항이 너무 높은 경우. 엄지 손가락의 규칙으로, 정맥의 저항은 기준에서 동물의 저항을 초과하지 않아야한다. 큰 내경 및 / 또는 짧은 길이의 정맥으로 작업 정맥의 저항을 줄이는 데 도움이됩니다. 마지막으로, 마우스에있는 FOT 측정의 현재 데모는 시간이 많이 소요되므로 비효율적 인 방법이나 침략 기술을 이하에 비해 종 연구에 덜 적용되는 것으로 인식 될 수 있습니다. 그러나 후자는 자신의 성과의 기초에 대한 불확실성의 큰 거래와 관련된 1 결함 것으로 많은 볼 수 있습니다. 반복 된 침략 측정은 기술적으로 도전 17 있지만, 경구 삽관 동물에서 가능합니다. 제공된 예제에서 결과는 호흡 역학의 측정을 생산에 flexiVent 시스템의 두 세대의 등가뿐만 아니라,기도 hyperreac을 보여흡입 메타 콜린에 tivity 및 과민 반응은 생쥐의 염소 노출에 따라. 생리적 변화 또는 질병 모델을 특성화하거나 이해하는 데 사용할 때 기술에 관한 상세한 측정 측면은 지식의 현재 상태를 확장에 기여할 수 있습니다.

작은 동물의 폐의 기계적 성질의 적절한 특성화 호흡기 과학 쥐 모델의 급성장 때문에 필수가되었다. 강제 진동 기법 (FOT), 또한 인간의 과목에서 사용되는 기술을 사용하여 수행하는 경우, 이러한 측정은 의미있는 생리적 변화를 연구 할 수있는 강력한 통합 및 번역 방법을 제공합니다. FOT 측정은 일반적으로 미리 정의 된 작은 진폭, 피사체의기도 오프닝 1에 적용 진동 공기 파형 (도 교란 또는 입력 신호라고도 함)에 반응 취득 압력과 부피 신호를 분석하여 얻을 수 있습니다. 가장 간단한 형태의 FOT 섭동은 잘 정의 된 주파수에서 단일 정현파 것입니다. 더 복잡한 교란은 일반적으로 넓은 스펙트럼을 커버하는 특정 (상호 프라임) 주파수 파형의 선택의 중첩으로 구성되어 있습니다. 다중 주파수 분해푸리에 변환을 사용하여 구성 요소에 입력 및 출력 신호는 호흡 시스템의 입력 임피던스 (ZRS)의 계산은 섭동 2에 포함 된 모든 주파수에서 입력과 출력 신호 사이의 전달 함수, 즉 수 있습니다. 따라서, FOT는 하나의 기동 2의 주파수 범위에서 호흡 역학의 동시 평가를 허용합니다. 임피던스 데이터에 맞는 고급 수학적 모델 (예를 들면 일정한 단계 모델 3) 다음기도 (중앙 및 주변 장치) 및 실질 폐 조직에 따라 매개 변수를 1, 3에 대한 응답의 분할을 허용합니다. 생리적 반응 (예를 들면 호흡 주파수, 호흡량, 폐 볼륨, 상부기도, 자연 호흡 노력, 측정 시간) 영향을 미치는 많은 요인이 측정 시스템 및 실험 절차에 의해 통제되고 표준화되어 있기 때문에, 1 기술 캡올바르게 수행되도록 제공 정확하고 재현성있는 측정을 생성 할 수. 이 문서의 목적은 생쥐에서 같은 측정을 실행하기 위해 필요한 절차에 대한 상세한 설명을 시간 순서로 제공하는 것입니다. 준비 단계 (시약, 장비 및 과목), 기계 환기, 폐 기능 측정 및 데이터 분석 : 프로토콜은 네 부분으로 구성되어 있습니다. 호흡 역학의 대표적인 결과의 예를 제공하는 컴퓨터 제어 피스톤 인공 호흡기 (flexiVent, SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 캐나다)를 사용하여 생성됩니다. 이들은 같은기도 염증, 상피 세포의 손상 및 흡입 분무 메타 콜린 4 증가기도 응답을 특징으로기도 손상의 산화 스트레스 구동 모델에서 순진 마우스뿐만 아니라에서 하였다. 이 프로토콜은 종종 흡입 메타 콜린에 대한기도 반응성을 평가하는 데 사용되는 동안, 다른 결과와 다목적으로 확장천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐기종, 폐 섬유증, 폐 손상뿐만 아니라 인간의 질병과 유사한 병리의 형질 전환 마우스 모델로. 등의 병리 이 도구를 사용하여 연구 결과는 생리적 변화 또는 질병 모델의 더 나은 특성과 이해뿐만 아니라 새로운 연구 영역으로 확대에 기여할 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;시약&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acetyl-&amp;#946;-methylcholine chloride </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2251</td><td>메타콜린</td></tr><tr><td>Micro-Adson forceps, serrated 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC31 forceps, serrated-curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors-2.5 mm blades, straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>비멸균 둔끝 바늘 (18g x &amp;frac12;")</td><td>Brico Medical Supplies Inc.</td><td>BN1805</td><td>기관내 캐뉼라</td></tr><tr><td>비멸균 5-0 실크 봉합사</td><td>Seraflex</td><td>IDI58000</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 용액</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브</td><td>Starstedt</td><td>SS-4001</td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l 필터 팁</td><td>Biosphere</td><td>70.760.211</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;장비&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiVent&lt;/em&gt; FX</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Aerogen Aeroneb 네뷸라이저</td><td><a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> SCIREQ Inc.</a></td><td>sales@scireq.com</td><td>&lt;a href="http://www.scireq.com/" target="_blank"&gt;www.scireq.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

강제 진동 기법 (FOT)는 포괄적 인 상세한, 정확하고 재현성있는 방식으로 생쥐의 폐 기능의 실험 평가를 허용하는 강력한 통합 및 번역 도구입니다. 그것은 미리 정의 된 작은 진폭, 일반적으로 피사체의기도 오프닝에서 적용되는 진동 공기 흐름 파형에 반응 취득 압력과 부피 신호의 분석을 통해 호흡 역학의 측정​​을 제공합니다. 현재 프로토콜 세부 사항을 적절 컴퓨터 제어 피스톤 인공 호흡기 (flexiVent, SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 캐나다)를 사용하여 생쥐에서 강제 진동 측정을 실행하는 데 필요한 단계. 준비 단계, 기계 환기, 폐 기능 측정 및 데이터 분석 : 설명은 네 부분으로 나누어 져 있습니다. 또한 마취 쥐의 흡입 메타 콜린에 대한기도 반응성을 평가하는 방법에 대한 자세한 내용이 techniqu의 일반적인 응용 프로그램이 포함되어 있습니다또한 다른 결과와 각종 폐 병리로 확장 전자. 기도 손상의 산화 스트레스 구동 모델에서뿐만 아니라 순진 생쥐에서 얻은 측정뿐만 아니라 새로운 연구 영역에서 응용 프로그램으로이 도구를 잘 특성화 및 연구 생리적 변화 또는 질병 모델에 대한 이해에 기여할 수있는 방법을 설명하기 위해 제공됩니다.

호흡 기계 역학 측정. 표 4는 flexiWare 7 소프트웨어에서 지원하는 두 개의 flexiVent 세대 중 하나를 사용하여베이스 라인과 같은 메타 콜린에 의한 기관지에서 얻은 순진 A / J 마우스 (12.5 밀리그램 / ML)에서 전형적인 결과를 보여줍니다. 닫힌 가슴 조건, 즉 호흡의 메커니즘은, 근접한 방식 (스냅 샷-150, 빠른 프라임-3, 각각)에서 단일 및 광대역 주파수 강제 진동 가족의 섭동을 교류하여 평가 하였다. 환기 측정, 빠른 프라임-3, 국무-8로 유사한 주파수 범위를 커버하는 동안 일시 중지하지만, 짧은 기간 (3 대 8 초)가, 무호흡 기간을 단축하기 위해 선정되기 때문에,의 영향을 최소화 혈액 가스에 섭동과 응답의 더 나은 해상도를 제공합니다. 각 섭동과 관련된 매개 변수는 AUTOMATICA 계산 하였다베드로 운영 소프트웨어 있습니다. 결과는 flexiVent 시스템의 두 세대가 호흡 역학의 동등한 측정 값을 생성하는 보여줍니다. 폐 반응의 사이트. 폐 반응의 사이트를 구별하는 것은 조사가 더 약물 개입 6 잠재적 인 점을 확인하는뿐만 아니라 영향을받는 영역을 정확하게 할 수 있습니다. 측정이 이루어지는에 대해 기말 압력은 3 ~ 9 CMH 2 O (그림 6A, 스냅 샷-150)로 증가 할 때 예를 들어, 순진 A / J 마우스는 기준 저항의 증가를 보여줍니다. 본 실시 예에서, 광대역 FOT 측정 (빠른 프라임-3)의 사용은 저항의 변화에 대한 근거를 명확히하기 위해 세부 사항을 제공 : 기말 압력의 변화와 일치 (R N)기도 저항의 감소 결과 높은 폐 볼륨의 기관지 효과와 더 큰 인플레 압박URE (그림 6D) 및 조직 감쇠 (G, 그림 6E)의 증가 밀접하게 조직 점탄성 그리고 아마도 작은기도 7의 저항을 반영하는 조직의 저항에 관련된 매개 변수입니다. 후자는 증가하는 폐 볼륨 증가하는 것으로 알려져있다. 기도 과민성. 다음과 염소 가스 노출, 흡입 메타 콜린에 대한기도 응답은기도 손상 4 (그림 2)의 결과로 글루 Balb / C 마우스에서 공기 노출에 비해 증가합니다. 염소는 특히 상피 세포,기도의 구조적 세포의 파괴로 이어지는, 그리고 염증 세포의 모집을 유도 산화 스트레스를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 그림 5에 표시된대로, 호흡 역학을 설명하는 모든 매개 변수의 변화는 증가하는 메타 콜린 도전에 대한 응답으로 볼 수 있습니다. 공기에 노출 된 생쥐에 비해, 마우스 염화물에 노​​출NE 가스는 모든 FOT 매개 변수 (그림 5A, 5B, 5D-5F)뿐만 아니라 저항 배로을 일으킬 데 필요한 메타 콜린의 농도의 감소에 의해 예시 농도 - 반응 곡선의 통계적으로 유의 왼쪽으로 이동에 더 큰 최대 응답을 표시 그리고 elastance (PC 200, 그림 5C). 그 결과, 각각기도 과민성과 염소 가스 흡입 메타 콜린 다음 노출 과민 반응을 보여줍니다. 다른 측량. FOT뿐만 아니라, flexiVent 시스템은 또한 폐 기능 8-10 심혈 11 측정의 다른 유형을 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 7은 기준 조건에서 순진 A / J 생쥐의 대표 단계적 압력 구동 압력 - 부피 곡선을 표시 . 곡선의 수축 사지의 상단 부분은 자르-놀즈 방정식 (12)에 적합하다 </<html> &gt;를 한모금과 매개 변수는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table1.jpg" alt="표 1" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table1highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 표 1. 마우스에 사용되는 마취 요법의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table1large.jpg" target="_blank">큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table2.jpg" alt="표 2" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table2highres.jpg" fo:content-width="5in" /> 표 2. 생쥐의 폐 기능 측정에 사용 섭동. 시스템에 필요한 * 연장. 주제는 또한 측정하는 동안 폐쇄 plethysmograph에 챔버에 있어야합니다.야윈는 &quot;&gt; 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table3.jpg" alt="표 3" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table3highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 표 3. 단일 및 광대역 주파수 강제 진동 교란 가정에서 내 보낸 매개 변수의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172table3large.jpg" target="_blank">큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172table4.jpg" alt="표 4" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172table4highres.jpg" fo:content-width="6in" /> 표 4. 시스템 비교. 폐 역학 매개 변수의 비교 flexiWare 7 소프트웨어에 의해 운영 flexiVent 시스템의 두 세대를 사용하여 수집. 결과는 순진 A / J 마우스 (에서 생성 된 N = 5 /<html> 베이스 라인과 같은 메타 콜린에 의한 기관지에서 그룹) MCH (12.5 밀리그램 / ML). . * 그룹은 반복 측정을위한 양방향 ANOVA와 로그 분산의 동질성 (; GraphPad 소프트웨어, 샌디에고, 미국 GraphPad 프리즘 버전 5.03)의 각 응답의 10을 사용 하였다 <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig1highres.jpg"/> 그림 1. 깊은 폐 인플레이션의 스크린 샷. 상단 패널은 인공 호흡기의 피스톤 (적색 트레이스)과 주제 (회색 추적)에 전달 부피 전치 볼륨을 보여줍니다. 하단 패널은 3 초에 걸쳐 30 CMH 2 O의 설정 압력을 증가 실린더 압력을 표시하고 같은 기간 동안 일정하게 유지. 172/50172fig2.jpg &quot;고도 =&quot;그림 2 &quot;/&gt; 그림 2. 기준선에서 호흡 역학을 평가하는 데 사용되는 일반적인 스크립트의 예. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 단계적 압력 볼륨 곡선의 실행 중에 자연 흡기 노력. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4.jpg" alt="그림 4" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig4highres.jpg"/> 그림 4. 시간 과정 응답 다음은 흡입 메타 콜린 문제를 증가. 결과는 5 순진 자발적으로 hyperresponsive A / J 생쥐의 그룹의 평균 (± 표준 편차)로 표현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;FO : 유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5.jpg" alt="그림 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig5highres.jpg"/> 그림 5. 증가하는 메타 콜린에 도전 염소와 공기에 노출 글루 Balb / C 마우스에 따라 호흡 역학의 변화. 피크 값은 모든 과목과 실험 조건에서 각 매개 변수에 대해 확인되었다. 그룹 평균은 다음 (; N = 4-6 평균 ± 표준 편차)으로 계산 하였다. 그룹 간의 차이는 분산의 동질성에 대한 개별 반응의 로그 10를 사용하여 분산 분석에 의해 평가되었다. 기준의 두배 (PC 200)를 생산하는 메타 콜린의 농도는 각각의 용량 - 반응 곡선과 장착 곡선의 보간에 두 번째 주문 다항식 피팅을 얻었다. 데이터 점 D에서 누락 된 E 및 염소에 노출 된 생쥐에서 F데이터에 대한 수학적 모델의 빈약 한 적합을 반영하는 결정에 충분히 높은 계수로 인해 두 개의 높은 메타 콜린의 농도.에서 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6.jpg" alt="그림 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig6highres.jpg"/> 그림 6. 기도와 폐 조직 역학에 호흡 반응의 분할. 실험 추적이 순진에서 (1-20.5Hz) 싱글 (2.5 Hz에서) 및 광대역 주파수를 설명하는 A / J 마우스는 두 가지 기말 압력에서 세중 호흡 기계의 진동 측정을 강제로 (3, 9 CMH 2 O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50172/50172fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> </&gt;. <img src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7.jpg" alt="그림 7" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50172/50172fig7highres.jpg"/> 그림 7. 기준 조건에서 순진 A / J 마우스의 압력 볼륨 커브. 압력 볼륨 곡선은 각 마우스의 폐는 독립적으로 자신의 상태의 같은 압력으로 팽창 된 것을 확인하기 위해 단계적 압력 중심의 섭동 (PVs의-P)를 사용하여 생성 하였다. 자르-Knowles의 개별 압력 볼륨 곡선에서 추출 방정식 매개 변수는 평균과 표 형식으로보고되었다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (n = 6)으로 표현됩니다.

SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 현재의 프로토콜은 호흡 역학의 측정​​뿐만 아니라 강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 흡입 메타 콜린에 대한기도 응답의 평가 (flexiVent을 실행하는 데 필요한 절차에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다 , 캐나다).

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

이 절차의 전반적인 목적은 상용 컴퓨터 제어 피스톤 인공호흡기인 flex event를 사용하여 생쥐의 호흡 역학에 대한 강제 진동 측정을 시연하는 것입니다. 이는 흡입된 methylcholine에 대한 기도 반응성을 평가함으로써 수행됩니다. 첫 번째 단계는 필요한 시약, 장비 및 실험 대상을 준비하는 것입니다.그 후 피험자를 인공호흡기에 연결하여 기계적 환기를 실시하고 호흡 역학을 측정합니다. 미리 정의된 스크립트를 사용하여, 기저 상태와 메틸콜린 유발 시험 후의 고도로 제어된 자동 측정값들을 수집합니다. 결과 분석을 통해, 대조군 피험자에 비해 염소에 노출된 마우스에서 저항과 엘라스틴의 최대 반응이 더 크게 나타나는 기도 과민반응을 확인할 수 있습니다.기존 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 폐 기능을 종합적이고 세부적이며 중개적인 방식으로 측정할 수 있는 정확한 도구를 제공한다는 점입니다. 이는 피험자의 기도 입구에 가해진 미리 정의된 진동성 기류 파형에 반응하여 획득한 압력 및 부피 신호를 분석함으로써 이루어집니다. 또한, 생리학적 반응에 영향을 미치는 많은 요인을 제어하고 표준화할 수 있습니다.이 방법을 사용하여 Flex event FX 시스템의 전원을 켜고 소프트웨어를 시작하십시오. 본 프로토콜은 flexi에서 지원하는 두 가지 flex event 세대 중 어느 것에나 적용됩니다. 첫 번째 실험 세션 전이나 그 이전에 소프트웨어를 실행하십시오. 연구 정의 및 계획 모듈을 열어 연구 구조를 미리 정의하십시오.새 연구 생성 버튼을 클릭하고 마법사의 안내에 따라 연구를 생성하십시오. 프로토콜의 개요를 작성하고 실험 그룹 및 연구 대상자를 정의하십시오. 실험 세션 모듈을 열고 시작 시퀀스를 따라 실험 세션을 시작하십시오.연구 및 템플릿 선정을 위해 측정 부위에 피험자를 배치하고 체중을 확인합니다. 운영 소프트웨어에 설명된 단계에 따라 시스템 보정을 진행하십시오.캘리브레이션(교정)을 위해 사용할 캐뉼라를 Y형 튜브에 연결하라는 안내 메시지가 나타납니다. 캘리브레이션 마법사의 단계에 따라 캐뉼라 캘리브레이션을 계속 진행하고, 얻어진 캘리브레이션 값이 지정된 범위 내에 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 캘리브레이션 과정을 반복하십시오. 준비가 될 때까지는 환기 및 데이터 기록 시작 안내 메시지를 취소하십시오.이는 나중에 시작할 수 있습니다. 적절한 용량의 마취제를 사용하여 피험물을 마취하십시오. 피험물이 수술 가능 수준의 마취 상태에 도달했는지 확인하십시오.피실험체는 발가락 꼬집기 자극에 반응이 없어야 하며, 호흡은 규칙적이고 힘겨워 보이지 않아야 합니다. 적절한 체온을 유지하기 위해 열원을 제공한 상태에서 동물을 앙와위로 배치하십시오. 마우스로부터 45 centimeters 떨어진 곳에 60 watt 전구를 배치하는 것이 적당합니다.그런 다음 알코올로 목 부위를 세척하여 기관을 노출시킵니다. 절개 후 하악선과 이를 덮고 있는 근육층을 조심스럽게 분리합니다. 미세 포셉을 사용하여 기관을 부드럽게 들어 올립니다.그다음 그 아래로 봉합사를 통과시킵니다. 후두에 가장 가까운 두 개의 연골 고리 사이를 절개합니다. 이렇게 하면 기관을 완전히 절단하지 않고 기관에 작은 절개창을 만들 수 있습니다.보정된 캐뉼라를 절개 부위에 삽입하고 기관 환골 5개를 지나도록 천천히 전진시킵니다. 본 예시에서는 1.2 centimeter 금속 18 gauge 캐뉼라를 사용하고 있습니다. 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 고정하는 것이 매우 중요합니다.부착물은 캐뉼라 주변을 공기가 새지 않도록 밀폐시켜야 합니다. 캐뉼라를 삽입한 동물을 인공호흡기 가까이 가져옵니다. 환기 도커(ventilation docker)에서 미리 정의된 또는 사용자 정의 환기 프로필을 선택하여 기계적 환기를 시작합니다.이제 Y형 튜브를 통해 동물을 인공호흡기에 연결하십시오. 동물을 인공호흡기에 맞춰 조심스럽게 정렬하고, 기관 cannula가 인공호흡기와 동일한 높이에 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 cannula의 폐쇄나 기관의 꼬임이 발생할 가능성을 방지할 수 있습니다.캐뉼라의 삽입 및 부착 상태를 확인하기 위해 섭동(perturbation) 이름을 더블 클릭하여 딥 인플레이션 섭동(deep inflation perturbation)을 실행하십시오. 누출이 없다면, 시스템은 과도한 부피 변위 없이 3초 동안 30 centimeters of water의 압력을 유지할 것입니다. 기록된 부피 및 압력 추적선은 오프셋이나 변형의 징후 없이 매끄러워야 합니다.그렇지 않은 경우, 이 지점에 캐뉼라가 있거나 폐쇄 또는 잘못 배치되었을 가능성이 있습니다. 필요한 경우 심박수 및 체온 모니터링을 위한 활성 징후 트랜스듀서를 연결할 수 있습니다. 이러한 신호의 데이터 기록은 수동으로 또는 스크립트를 통해 자동으로 언제든지 시작할 수 있습니다.네뷸라이저 활성화, 이벤트 마커 등을 위한 측정 또는 명령은 미리 정의되었거나 맞춤 설정된 스크립트를 사용하여 자동화할 수 있으며, 이를 통해 매우 정밀하게 제어되고 재현 가능한 실험 과정이 가능합니다. 기저 상태 및 특정 자극 후의 피험자 호흡기 시스템 역학을 설명하기 위해 다수의 파라미터를 생성하는 6가지 유형의 섭동(perturbation)을 사용할 수 있습니다. 측정을 시작할 준비가 되면, 먼저 심층 흡기 섭동(deep inflation perturbation)을 실행하여 폐의 폐쇄된 영역을 확장시키고 폐 용적 이력을 표준화하는 것이 중요합니다.다음으로, 테스트 측정을 실시하여 자발적인 흡기 노력이 없는지 확인하십시오. 선택한 데이터 세트 뷰에서 압력 신호 파형을 관찰하십시오. 단계별 PV 곡선과 함께 확인합니다.압력 평탄부(plateaus)는 하향 굴곡 없이 명확하게 나타나야 합니다. 압력이 하향 곡선을 그리는 것은 동물의 흡기 노력이 있음을 나타냅니다. 이제 해당 제목을 더블 클릭하여 흡입 메틸콜린에 대한 기도 반응성 평가 스크립트를 시작하십시오.이 예제에서 스크립트는 세 번 반복하여 일련의 기선 측정을 수행합니다. 그런 다음 네뷸라이저에 식염수를 충전하라는 프롬프트가 나타납니다. 또는 이 예제의 경우, 메틸콜린 용액을 사용하여 네뷸라이저에 약 100 µL의 용액을 충전합니다.소프트웨어에 정보가 입력되는 즉시 분무가 자동으로 시작됩니다. 분무 종료 직후, 약 3분 동안 좁은 간격의 일련의 측정이 시작됩니다. 다음으로, 실행 요청 메시지가 나타납니다.또 다른 챌린지가 제공되며, 챌린지 사이에 측정 순서를 반복할 수 있습니다. 면봉으로 네뷸라이저 마운트 내부를 건조시키면 흡기 라인에 액적이나 응결물이 쌓이는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 데이터가 수집됨에 따라 소프트웨어는 섭동과 관련된 파라미터를 계산하고, 모델에 대한 데이터 적합도를 기반으로 결정계수를 제공합니다.나중에 소프트웨어의 검토 및 보고 모듈을 통해 실험에 접속하여 데이터를 내보내거나 추가 분석을 수행할 수 있습니다. 실험이 끝나면 환기를 중단하고 피험체를 분리합니다. 분리 즉시 펜토바르비탈 나트륨을 과량 투여하여 동물을 안락사시킨 후, 기관지폐포 세척을 수행하거나 추가 분석을 위해 폐를 적출할 수 있습니다.다음 피험자로 전환하기 전에, 네뷸라이저 어댑터 y-튜브와 캐뉼라를 헹구고 건조하십시오. 작동 소프트웨어에서 다음 피험자로 전환하고 해당 피험자의 체중을 확인하십시오. 그 후, 실험을 계속하기 전에 제안된 교정 단계를 수행하십시오.일과 종료 후, 장비를 헹구고 건조하십시오. 시스템의 성능을 유지하기 위해 실험 세션을 종료하기 전, 제조업체의 지침에 따라 시스템의 호기 밸브를 세척해야 함을 기억하십시오. 다음 예시들은 나이브 쥐 및 염소에 노출된 쥐 실험에서 얻은 전형적인 결과들의 선택이며, 나이브 aj로부터 얻은 결과와 동일합니다.FlexiWear 7에서 지원하는 두 가지 FlexEvent 세대 중 하나를 사용하여, 기저 상태 및 메틸콜린으로 유도된 기관지 수축 이후의 마우스를 측정하였습니다. 광대역 FOT 측정은 폐 반응을 기도 및 폐실질 조직 파라미터로 분리할 수 있어, 영향을 받은 폐 영역을 식별하는 수단을 제공합니다. 예를 들어, naive AJ 마우스는 호기 말 압력을 3에서 9 cm H₂O로 증가시켰을 때 기저 저항이 증가하는 것을 보여주었습니다.호기말 양압의 변화는 폐 부피 증가와 더 큰 팽창압의 기관지 확장 효과와 일치하는 기도 저항의 감소를 가져왔으며, 조직 점탄성 및 소기도의 저항을 반영하며 조직 저항과 밀접한 관련이 있는 파라미터인 조직 감쇠의 증가를 유발했습니다. 후자는 폐 부피가 증가함에 따라 증가하는 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 염소 가스 노출 후 흡입 메틸콜린에 대한 기도 반응성을 평가하는 데 자주 사용됩니다.B.SEA 마우스는 공기에 노출된 대조군과 비교하여 기도 과민반응을 나타냈습니다. 본 예시에서 염소 가스에 노출된 마우스는 모든 FOT 파라미터에서 더 큰 최대 반응을 보였습니다. 또한, 이 마우스들은 흡입된 메틸콜린에 대해 농도-반응 곡선이 통계적으로 유의미하게 왼쪽으로 이동하는 양상, 즉 과민성을 보였으며, 이는 저항과 엘라스틴을 두 배로 증가시키는 데 필요한 메틸콜린 농도가 감소한 것으로 입증되었습니다.FOT 외에도 flex 이벤트 시스템은 압력-부피 곡선과 같은 다른 측정값을 기록할 수 있습니다. 호기 분절의 상단부는 Salazar Knolls 방정식에 맞게 피팅되며, 관련 파라미터는 소프트웨어에 의해 계산됩니다. 이 기술을 성공적으로 수행하기 위해서는 각 단계에 주의를 기울이는 것이 중요하며, 특히 시스템 교정, 기관 내 캐뉼라의 저항, 동물의 배치, 그리고 폐 부피의 표준화가 매우 중요합니다.이 단계들을 정확하게 따르면, 본 방법을 통해 마우스 폐의 기계적 특성을 정확하게 분석할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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