Name: DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 DT40 세포에서 DNA 섬유 기술을 이용한 단일 분자 수준 DNA 복제 시각화 방법을. 형광 현미경으로 복제 포크 역학을 정량 분석하여 유전적 안정성 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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우리는 섬유 기술뿐만 아니라 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원과 관련하여 도움이 박사 T. Helleday 박사 E. Petermann 감사합니다. WN는 국제 암 연구 협회의 수석 국제 연구 활동에 의해 과학 연구 부여 (N301 165935)에 대한 폴란드 국가위원회에 의해 지원됩니다.

Schwab 외, EMBO J., 29 (4) :806 - 18 5. 방법은 다음과 같은 간행물에 사용되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 1. DT40 세포 배양 자료 : 태아 소 혈청 (FBS), 닭 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 - 메르 캅 토 에탄올, RPMI <ol><li> 세포 배양 매체를 준비 : 7퍼센트 FBS를 추가 3% 닭 혈청, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μm의 2 - 메르 캅 토 에탄올 RPMI 매체 있습니다. </li><li> DT40 세포가 38 세에 무균 세포 배양 flasks에서 재배 ° C, 5 % 나 humidified 인큐베이터에서 CO 2. 5 × 10 5 세포 / ML 6 밀도 매일 세포를 분할. </li></ol> 2. 생체내 라벨에서 자료 : 이두, CldU <ol><li> 뉴클레오 티드 analogues의 재고 솔루션을 준비 : 중간 2.5 MM 5 MM과 CldU에 이두를 해산. 간단히 60 두 솔루션을 열 ° C와 뉴클레오 티드 아날로그까지 소용돌이ues 완전히 녹아있다. </li><li> 기하 급수적으로 DT40 세포 성장을 25 μm의의 최종 농도 이두를 추가하고 잘 세포 현탁액을 섞는다. 38 ° C와 5% CO 2에서 20 분 동안 세포를 품어. </li><li> 첫 번째 레이블이있는 부화 후, 250 μm의의 최종 농도 CldU을 추가하고 이전 단계에서 설명한대로 세포를 처리합니다. </li><li> 얼음 차가운 PBS로 세포를 씻어 및 7.5 × 10 5 세포 / 차가운 PBS에서 ML의 농도에 그들을 resuspend. 얼음에 표시된 세포 보관하십시오. </li></ol> 설명 라벨 절차는 단순히 제안하고 구체적인 질문을 해결하기 위해 수정할 수 있습니다. 실험 설계에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 3. 확산 세포 용해와 DNA 재료 : 유리 슬라이드, 섬유 용해 용액 <ol><li> 200 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5에서 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % SDS : 섬유 용해 용액 준비 </li><li><li> Pipet 7 μl 용해 세포 현탁액 위에 솔루션과 부드럽게 솔루션을 혼합하는 피펫 팁 함께 저어. 진행 세포 용해 2 분 동안 품어. </li><li> 섬유는 슬라이드를 따라 확산 수 있도록 15 °로 슬라이드를 기울. </li><li> 섬유 솔루션은 슬라이드의 하단에 도달되면, 공기 건조에 수평으로 그것을 놓으십시오. 건조 후, 얇은, 불투명한 라인은 슬라이드 따라 표시되어야합니다. 이 시점에서 뻗어 섬유의 시작은 라인이 더 이상 표시되지 않습니다 얼룩 이후로 연필로 표시한다. 이 마크는 나중에 현미경으로 섬유를 찾습니다 도움이 될 것입니다. </li></ol> 4. Immunofluorescence 염색법 자료 : 메탄올, 초산, HCL, PBS에서 5 % BSA, 얼룩 병, 안티 - BrdU (마우스) 항체,안티 BrdU (쥐) 항체, 양 반 마우스 Cy3 항체, 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체, Vectashield 장착 매체, coverslips, 매니큐어 <ol><li> 메탄올 / 10 분 얼룩 병 및 부화에 초산 (3시 1분)에 빠져 슬라이드. </li><li> 80분 2.5 M HCL에 다음 젖어 소주 H 2 O에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 워시는 5 분 동안 PBS로 세 번 슬라이드. </li><li> 얼룩의 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분의 PBS를 수집합니다. 수평 슬라이드를 놓고 각 슬라이드의 상단에 pipet 5 % BSA. 슬라이드 위에 균일하게 BSA를 확산하고 20 분 동안 부화 coverslip와 함께 부드럽게 슬라이드를 커버. </li><li> 1시 25분 안티 BrdU (마우스)와 1:400 안티 BrdU (쥐) : 다음과 같은 농도에서 5 % BSA의 기본 항체를 희석. </li><li> 그것을 제거하는 유리 슬라이드 아래로 부드럽게 coverslip를 이동합니다. 커버 슬립이 슬라이드 경우엔 힘을 적용하지 마십시오. coverslip 줄을 될 때까지 슬라이드는 PBS에 rehydrated 수 있습니다D는 쉽게 제거할 수 있습니다. 종이 타월로 여분의 BSA를 수집하고 가로 슬라이드를 삽입합니다. 각 슬라이드에 기본 항체 솔루션의 Pipet 50 μl. 슬라이드 위에 균일하게 항체 솔루션을 확산하고 2 시간 동안 humidified 챔버에서 부화 coverslip로 다시 커버. </li><li> coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻어 </li><li> 1:500 양 반 마우스 Cy3와 1:400 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 다음 농도에서 5 % BSA의 보조 항체를 희석. </li><li> 로 기본 항체에 대한 설명 보조 항체 용액 50 μl를 적용합니다. 1 시간 동안 조명과 부화에서 슬라이드를 보호합니다. </li><li> coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻는다. </li><li> 각 슬라이드에 Vectashield 장착 매체의 한 방울을 추가하고 coverslip을 적용합니다. 부드럽게 coverslips을 누르면 종이 타월로 여분의 주위에 액체를 제거합니다. 투명 손톱 polis과 인감 coverslips그들이 건조 H 및하자. -20 ° C.에있는 슬라이드를 저장 </li></ol> 5. 이미지 수집 재료 : 형광 현미경, 카메라 연필 표시에 가​​까운 슬라이드에 침지 기름 한 방울을 장소와 섬유를 찾기 시작합니다. 일반적으로, 그곳에서 주요 섬유 번들이지만,이 섬유가 너무 얽혀 버린하고 나중에 분석할 수 없습니다. 섬유가 명확하게 (그림 2) 서로 분리 영역을 찾기 위해 멀리 기본 번들에서 이동합니다. 우리는 편견을 피하기 위해 한 색상 채널을 사용하여 사진을 선택합니다. 그렇다면, 우리는 매번 포인트, 집중력 또는 셀 라인의 약 10 사진을 찍는 것입니다. 그러나 사진의 숫자는 각 사진에 계산 수있는 얼마나 많은 섬유에 따라 달라집니다. 슬라이드 중 하나가 지역 대표 섬유 길이 또는 복제 구조를 제공하지 수 있으므로, 다른 사진을 찍을 수있는 슬라이드를 따라 이동합니다. 6. 데이터 분석 재료 : 그림 분석 프로그램, 예를 들어 ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 사진 분석 프로그램에 사진을 가져옵니다. 섬유 책자 및 / 길이를 측정하거나 (그림 3) 서로 다른 복제 구조를 계산합니다. 단지 그림의 가장자리를 통해 연장하지 명확하게 표시하고있는 아르 섬유를 계산합니다. 우리는 일반적으로 약 100 섬유의 길이를 측정하고 150-200 복제 구조를 계산하고 우리는 각각의 실험에 적어도 세 번 반복합니다. 7. 대표 결과 : 새로 복제된 DNA는 항체 - 레이블 염기 analogues의 라인으로 시각하실 수 있습니다. 우리의 실험에서 지속적인 분기점이 인접 빨간색과 초록색 신호 (그림 3)로 표현된다. 이중 레이블 프로토콜은 또한 우리가 복제 구조의 네 개의 주요 클래스를 정의할 수 있습니다 : 1) 새로운 초기화 이벤트가 divid 수 있습니다 세포가 처음으로 라벨과 두 번째 레이블 인큐베이션 기간 동안 해고 기원 incubated 동안 해고 기원에 에드. 전자 인근 녹색 빨강 - 녹색 신호와 녹색 라인만을 후기 구성되어 있습니다. 2) 종료 이벤트는 인접한 빨강 - 녹색 - 빨간색 신호로 명단. 3) interspersed 기원이 붙어 기원과 게놈의 사이트입니다. 이러한 사이트는 연속 기원과 종료 신호로 구성됩니다. 4) 지연 / 붕괴 포크는 하나만을 빨간 신호를 7 또는 짧은 녹색 넓이 8,9 다음 붉은 선으로 정의 될 수 실험 설계에 따라 다릅니다. 조건을 사용하면 야생 유형 DT40 세포가 0.4 μm의 / 분 평균 포크 속도를 가지고, 여기에 설명되어 있습니다. 우리는 약 63%에게 지속적인 포크, 10 % 기원, 16% 지연 포크 (적색 전용 책자), 8 % 종단 3 % interspersed 섬유를 검색할 수 있습니다. ure 1 "/&gt; . 그림 1 (A) 만화의 왼쪽은 DNA 라벨 절차의 첫 단계를 묘사 : 기하 급수적으로 증가하고 DT40 세포 이두를 추가하면 즉시 새로 합성 선도와 DNA의 긴 보온에 통합될 수있는 뉴클레오 티드 아날로그을 주도하고 있습니다. 이것은 특정 항체를 사용하여 시각 수 있으며, 현미경으로 볼 때 붉은 선으로 나타납니다. 그림의 오른쪽에있는 그림과 같이 그 후, 동일한 절차 CldU로 반복됩니다. 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그와 부화 후, 적극적인 포크 인접한 빨강 - 녹색 넓이로 표시됩니다. 평균 섬유 길이는 염기 analogues의 배양 시간에 비례합니다. (B) lysed DT40 세포에서 DNA는 현미경 슬라이드에 중력에 의해 늘어 및 법인 염기 analogues은 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 시각 점입니다. igure 2 "/&gt; 그림 2. 대표 형광 이미지는 이후 이십분 각 이두와 CldU으로 표시 야생 유형 DT40 세포에서 섬유를 보여줍니다. 섬유의 대부분은 잘 서로 구분하기 때문에 쉽게 분석할 수 있습니다. 하얀 막대는 10 μm의를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> . 그림 3 이중 라벨 섬유 기술은 하나가 다른 복제 구조를 구분할 수 있도록, 1 - 적극적으로 복제 포크, 2 - DNA 복제 (새 기원의 발포), 3의 새로운 사이트 - 포크 종단 (두 수렴 포크), 4 - interspersed 섬유 (붙어있는 기원의 장소) 및 5 - 지연 포크 (적색 신호 전용).

<ol><li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li>
<li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li>
<li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner%27s+syndrome+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li>
<li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure%3A+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li>
<li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li>
<li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li>
<li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint%3A+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Cycle%22%5BJournal%5D)">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li>
<li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 단일 분자 수준에서 S - 단계 동안 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석​​을 위해 허용하는 방법을 설명합니다. 지난 10 년 동안, DNA 섬유 fluorography 기술의 여러 버전은 살아있는 세포 내의 개별 복제 포크의 움직임을 시각화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 모든 기술에 중요한 매개 변수는 잘 분리된 DNA 섬유를 제공하는 유리 표면에 DNA의 스트레칭 최상을 달성하는 데 사용되는 절차입니다. 이것을 달성하기위한 중요한 단계는 현미경 슬라이드뿐만 아니라 용해 시간에 세포 현탁액의 배양 시간입니다. 이러한 매개 변수는 특정 실험실에서 온도와 공기에 의존하고 경험적으로 결정되어야합니다. DNA 섬유 실험 실용적인 부분은 일반적으로 하루 만에 수행됩니다. 그러나, 이후의 그림 수집과 분석은 더 많은 시간이 소요됩니다 실천이 필요합니다. 라벨의 프로토콜은 광고 수다양한 과학 문제에 답변을 apted : 두 번째 펄스 라벨 동안 복제와 방해 에이전트를 사용하면 포크 신장 / replicative 스트레스에 대응 연기를 모니터합니다. 이 시나리오에서는 첫 번째 레이블이 두 번째 뉴클레오 티드로 씻겨 나간 할 필요가 없다는 초과에 추가됩니다. 또는 복제를 방해 약물은 조합 또는 첫 번째 레이블 외에 후 사용할 수 있습니다. 이것은 첫 번째 레이블을 필요로하고 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그 전에 제거할 수있는 약물이 적용됩니다. 이 절차는 하나 replicative 스트레스의 조건 (예 : 포크가 연기 및 / 또는 붕괴) 아래 replicative 포크의 안정성 / 복구에 다양한 DNA 수리 요인의 중요성을 확인할 수 있습니다. 주목할만한, DNA 복제 프로그램의 세부 사항에 대한 자세한 분석은 현장 하이브 리다이 제이션에 빗질 DNA와 형광 결합 대체 접근법의 사용을 수행할 수 있습니다. 이것은 그러나, 기술적으로 더 도전하고 expen 필요sive 장비. 질적 및 양적 DNA 복제의 세부 사항을 분석할 수있는 능력은 DNA 복제 자체에 결함뿐만 아니라 복제 포크와 관련된 게놈 불안정성을 억제 경로를 조사를위한 필수적인 도구를 제공합니다. 의심의 여지가없이,이 분석은 더 이상 정상적인 세포가 반응 /뿐만 아니라 암 세포가 복제 포크를 대상으로 약물의 독성에 저항 이러한 메커니즘을 활용하는 방법으로 환경 변화에 적응할 수 있도록 복제 - 중재의 DNA 수리 메커니즘에 빛을 창고에 도움이 될 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 태아 소 혈청 금색 (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td><td></td></tr><tr><td> 닭 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21,875 </td><td></td></tr><tr><td> 5 Iodo - 2&#39; - deoxyuridine (이두) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5 - 클로로 - 2&#39; - 데옥시 - 유리딘 (CldU) </td><td> 시그마 </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 SuperFrost을 슬라이드 </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> 커버는 No1을 미끄러져 </td><td> 과학 실험실의 suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield 장착 매체 </td><td> H - 1000 벡터 실험실 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 (마우스) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,580 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 (쥐) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> 양 반 마우스 Cy3 </td><td> 시그마 </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 dt40의 dna 섬유 기술을 사용하여

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

복제 포크 안정성의 유지 보수 가능성을 유지하고 질병을 방지하기 위해 세포를 분리를위한 최고 중요성이다. 관련된 프로세스는 내생 및 외인성 DNA 손상의 얼굴에 충실한 게놈 복제를 보장뿐만 아니라 게놈 불안정성, 종양 개발에 인정 원인이되는 요인을 방지하지 않습니다. 여기, 우리는 간단하고 비용 효율적인 형광 현미경 기반의 조류 B - 세포주 DT40의 DNA 복제를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 세포 라인 척추 세포 1 리버스 유전학에 의해 생체내 단백질의 기능을 조사하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 특정 유전자를 부족한 DT40 세포의 DNA 섬유 fluorography 하나가 DNA 복제와 게놈 안정성이 유전자 산물의 기능을 명료하게하다 수 있습니다. 척추 세포 복제 포크 역학을 분석하는 전통적인 방법은 펄스 표시된 세포의 인구의 DNA 합성의 전반적인 속도를 측정에 의존. 이것은 양적 접근이며 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 위해 허용하지 않습니다. DNA 섬유 기술 2-4 사용하면 대조적으로, 적극적인 포크의 움직임의 속도는 바로 다음 수 있습니다. 이 방법에서는, 초기 DNA는 할로겐화 세포핵의 결합 (그림 1A)에 의해 생체내에 표시됩니다. 그 후, 각각의 섬유는 현미경 슬라이드에 뻗어 있으며, 레이블이 붙은 DNA 복제 책자는 특정 항체 물들일 및 형광 현미경 (그림의 1B)에 의해 시각입니다. 복제뿐만 아니라 포크 방향의 개시 두 다르게 수정 analogues의 연속 사용에 의해 결정됩니다. 또한, 이중 라벨 부착 방식은 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석​​을 허용 등 지속 및 지연 포크, 복제 원산지 밀도뿐만 아니라 포크 종단과 같은 즉, 복제 구조. 마지막으로, 실험 절차는 수행할 수 있습니다하루 이내에 에드, 그리고는 일반적인 실험실 장비 및 형광 현미경이 필요합니다.

DT40, 모델 척추 유전 시스템은 단백질 기능을 분석하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기서 우리는 단일 분자 수준에서 DT40 세포에있는 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 수있는 간단한 방법을 설명합니다.

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

복제 포크 안정성의 유지는 분열 세포가 생존 능력을 보존하고 질병을 예방하는 데 있어 매우 중요합니다. 이에 관여하는 과정들은...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 분자 수준에서 DNA 복제를 시각화하는 것입니다. 먼저 할로겐화 뉴클레오타이드 유사체를 새로 합성된 DNA에 통합시키는 것으로 시작합니다. 살아있는 세포의 경우, 라벨링된 DNA가 포함된 세포를 현미경 슬라이드에 점적합니다.그 후 세포를 슬라이드 위에 올리고 DNA를 현미경 슬라이드 위로 펼칩니다. 이어서 DNA 섬유의 면역 염색을 수행하고 형광 현미경 이미지를 분석하면 전반적인 복제 포크 역학을 밝힐 수 있으며, 이를 통해 전체 복제 프로그램에 영향을 미치는 파라미터에 대한 정량적 분석이 가능해집니다. 지난 수년간, 살아있는 세포 내에서 개별 복제 포크의 이동을 시각화하기 위해 다양한 버전의 DNA fiber Fluor 기술이 개발되었습니다.지금부터 보게 될 DT 40 세포를 이용한 이 in vivo 실험은 하루 안에 완료할 수 있으며, 일반적인 실험실 장비와 형광 현미경만으로 가능합니다. 실험 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Rebecca Schwab이 진행하겠습니다. DT 40 세포를 in vivo에서 표지하려면, 지수 성장기 상태의 배양액으로 시작하십시오. 최종 농도가 25 µM이 되도록 IDU 표지물을 첨가하고 세포 현탁액을 혼합하십시오.세포를 38 °C, 5% CO2 조건에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 최종 농도가 250 µM이 되도록 CLDU 레이블을 첨가합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 배양합니다.이제 DT 40 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척합니다. 세포 펠렛을 차가운 PBS에 현탁하고 라벨링된 세포를 얼음 위에 보관합니다. 세포 현탁액 2 µL를 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 점적하고, 방울의 부피가 크게 줄어들 때까지 공기 중에서 건조시키되 완전히 마르지는 않게 합니다.이제 세포 현탁액 위에 7 µL의 fiber lysis solution을 첨가하고, 피펫 팁으로 저어 용액을 부드럽게 섞은 후 2분 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 15도 각도로 기울여 섬유가 슬라이드를 따라 퍼지게 합니다. 섬유 용액이 슬라이드 바닥에 닿으면, 슬라이드를 수평으로 놓아 공기 중에서 건조시킵니다.이 시점에서 슬라이드를 따라 얇고 불투명한 선이 보여야 합니다. 연신된 섬유의 시작 부분을 연필로 표시하십시오. 먼저 슬라이드를 메탄올과 아세트산이 3:1로 혼합된 용액에 10분 동안 담그십시오.슬라이드를 증류수로 세척한 후, 2.5 M 염산에 80분 동안 담급니다. PBS로 5분씩 3회 세척한 후 가볍게 닦아냅니다. 과량의 PBS는 페이퍼 타월로 흡수하여 제거합니다.그 다음 슬라이드를 수평으로 놓습니다. 이제 각 슬라이드 위에 PBS에 희석한 5% BSA를 피펫으로 분주하고, 커버슬립을 덮어 20분 동안 배양합니다. 커버슬립을 유리 슬라이드 아래로 천천히 이동시킵니다.종이 타월로 과량의 BSA를 제거합니다. 그 다음, 각 슬라이드 위에 anti BRDU 1차 항체 용액 50 µL를 피펫으로 분주합니다.커버슬립으로 표본을 덮고 습윤 챔버에서 2시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 제거한 후, 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다. 50 µL의 2차 항체 용액을 도포하고 커버슬립을 덮은 뒤, 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다.그 후 1시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 제거하고 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 세척합니다. 마지막으로, 각 슬라이드 위에 vector shield 마운팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨립니다.커버 슬립을 살짝 누르고 주변의 과잉 액체를 제거합니다. 페이퍼 타월을 사용하여 커버 슬립을 투명 매니큐어로 밀봉한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 슬라이드를 -20 °C에서 보관하십시오.슬라이드의 연필 표시 근처에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 섬유를 찾기 시작합니다. 섬유들이 서로 명확하게 분리되어 있는 영역을 찾기 위해 주요 다발에서 벗어나 이동합니다. 일반적인 실험에서는 편향을 방지하기 위해 단일 색상 채널만을 사용하여 이미지를 선택합니다.그 후 각 시료당 약 10장의 사진을 촬영합니다. 슬라이드의 한 구역만으로는 대표적인 섬유 길이 나 반복 구조를 확보하지 못할 수 있으므로, 슬라이드를 따라 이동하며 서로 다른 위치의 사진을 촬영하십시오. 촬영한 사진을 이미지 분석 프로그램으로 불러옵니다.100개의 섬유 가닥의 길이를 측정하거나 150~200개의 서로 다른 복제 구조를 계수합니다. 이중 표지 섬유 기법을 통해 서로 다른 복제 구조를 구별할 수 있습니다. 새로 복제된 DNA는 항체로 표지된 뉴클레오타이드 유사체의 선으로 시각화할 수 있습니다.여기서, 계속해서 신장 중인 복제 포크는 인접한 빨간색 및 초록색 신호로 나타납니다. 새로운 개시 사건은 세포가 첫 번째 라벨로 배양되는 동안 발화한 복제 원점과 두 번째 라벨로 배양되는 동안 발화한 복제 원점으로 나눌 수 있습니다. 전자는 인접한 초록색, 빨간색-초록색 신호로 구성되며, 후자는 초록색 선으로만 구성됩니다.종결 사건은 인접한 빨간색과 초록색으로 나타납니다. 빨간색 신호가 곳곳에 배치되어 있습니다. 기점은 연속적인 기점과 종결 신호로 구성됩니다.실험 설계에 따라, 정체되거나 붕괴된 포크는 빨간색 신호만 나타나거나, 빨간색 선 뒤에 짧은 초록색 트랙이 이어지는 형태로 정의될 수 있습니다. 본 실험에서 야생형 DT 40 세포의 평균 포크 속도는 0.4 microns per minute입니다. 진행 중인 포크 63%, 복제 기점 10%, 정체된 포크 16%, 종료 지점 8%, 그리고 산재된 섬유 3%가 확인되었습니다.이 영상을 시청한 후에는 DT 40 세포에서 복제 포크 역동성을 시각화하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 DNA 복제의 결함을 조사하는 데 필수적인 도구가 될 것입니다.

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