DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

이 실험 절차의 전반적인 목표는 단일 분자 수준에서 DNA 복제를 시각화하는 것입니다. 먼저 할로겐화 뉴클레오타이드 유사체를 새로 합성된 DNA에 통합시키는 것으로 시작합니다. 살아있는 세포의 경우, 라벨링된 DNA가 포함된 세포를 현미경 슬라이드에 점적합니다.

그 후 세포를 슬라이드 위에 올리고 DNA를 현미경 슬라이드 위로 펼칩니다. 이어서 DNA 섬유의 면역 염색을 수행하고 형광 현미경 이미지를 분석하면 전반적인 복제 포크 역학을 밝힐 수 있으며, 이를 통해 전체 복제 프로그램에 영향을 미치는 파라미터에 대한 정량적 분석이 가능해집니다. 지난 수년간, 살아있는 세포 내에서 개별 복제 포크의 이동을 시각화하기 위해 다양한 버전의 DNA fiber Fluor 기술이 개발되었습니다.

지금부터 보게 될 DT 40 세포를 이용한 이 in vivo 실험은 하루 안에 완료할 수 있으며, 일반적인 실험실 장비와 형광 현미경만으로 가능합니다. 실험 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Dr. Rebecca Schwab이 진행하겠습니다. DT 40 세포를 in vivo에서 표지하려면, 지수 성장기 상태의 배양액으로 시작하십시오. 최종 농도가 25 µM이 되도록 IDU 표지물을 첨가하고 세포 현탁액을 혼합하십시오.

세포를 38 °C, 5% CO2 조건에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 최종 농도가 250 µM이 되도록 CLDU 레이블을 첨가합니다. 세포 현탁액을 혼합하고 배양합니다.

이제 DT 40 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척합니다. 세포 펠렛을 차가운 PBS에 현탁하고 라벨링된 세포를 얼음 위에 보관합니다. 세포 현탁액 2 µL를 유리 슬라이드의 한쪽 끝에 점적하고, 방울의 부피가 크게 줄어들 때까지 공기 중에서 건조시키되 완전히 마르지는 않게 합니다.

이제 세포 현탁액 위에 7 µL의 fiber lysis solution을 첨가하고, 피펫 팁으로 저어 용액을 부드럽게 섞은 후 2분 동안 배양합니다. 다음으로, 슬라이드를 15도 각도로 기울여 섬유가 슬라이드를 따라 퍼지게 합니다. 섬유 용액이 슬라이드 바닥에 닿으면, 슬라이드를 수평으로 놓아 공기 중에서 건조시킵니다.

이 시점에서 슬라이드를 따라 얇고 불투명한 선이 보여야 합니다. 연신된 섬유의 시작 부분을 연필로 표시하십시오. 먼저 슬라이드를 메탄올과 아세트산이 3:1로 혼합된 용액에 10분 동안 담그십시오.

슬라이드를 증류수로 세척한 후, 2.5 M 염산에 80분 동안 담급니다. PBS로 5분씩 3회 세척한 후 가볍게 닦아냅니다. 과량의 PBS는 페이퍼 타월로 흡수하여 제거합니다.

그 다음 슬라이드를 수평으로 놓습니다. 이제 각 슬라이드 위에 PBS에 희석한 5% BSA를 피펫으로 분주하고, 커버슬립을 덮어 20분 동안 배양합니다. 커버슬립을 유리 슬라이드 아래로 천천히 이동시킵니다.

종이 타월로 과량의 BSA를 제거합니다. 그 다음, 각 슬라이드 위에 anti BRDU 1차 항체 용액 50 µL를 피펫으로 분주합니다.

커버슬립으로 표본을 덮고 습윤 챔버에서 2시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 제거한 후, 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 세척합니다. 50 µL의 2차 항체 용액을 도포하고 커버슬립을 덮은 뒤, 슬라이드를 빛으로부터 보호합니다.

그 후 1시간 동안 배양합니다. 커버슬립을 제거하고 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세 번 세척합니다. 마지막으로, 각 슬라이드 위에 vector shield 마운팅 용액을 한 방울씩 떨어뜨립니다.

커버 슬립을 살짝 누르고 주변의 과잉 액체를 제거합니다. 페이퍼 타월을 사용하여 커버 슬립을 투명 매니큐어로 밀봉한 후 공기 중에서 건조시킵니다. 슬라이드를 -20 °C에서 보관하십시오.

슬라이드의 연필 표시 근처에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 섬유를 찾기 시작합니다. 섬유들이 서로 명확하게 분리되어 있는 영역을 찾기 위해 주요 다발에서 벗어나 이동합니다. 일반적인 실험에서는 편향을 방지하기 위해 단일 색상 채널만을 사용하여 이미지를 선택합니다.

그 후 각 시료당 약 10장의 사진을 촬영합니다. 슬라이드의 한 구역만으로는 대표적인 섬유 길이 나 반복 구조를 확보하지 못할 수 있으므로, 슬라이드를 따라 이동하며 서로 다른 위치의 사진을 촬영하십시오. 촬영한 사진을 이미지 분석 프로그램으로 불러옵니다.

100개의 섬유 가닥의 길이를 측정하거나 150~200개의 서로 다른 복제 구조를 계수합니다. 이중 표지 섬유 기법을 통해 서로 다른 복제 구조를 구별할 수 있습니다. 새로 복제된 DNA는 항체로 표지된 뉴클레오타이드 유사체의 선으로 시각화할 수 있습니다.

여기서, 계속해서 신장 중인 복제 포크는 인접한 빨간색 및 초록색 신호로 나타납니다. 새로운 개시 사건은 세포가 첫 번째 라벨로 배양되는 동안 발화한 복제 원점과 두 번째 라벨로 배양되는 동안 발화한 복제 원점으로 나눌 수 있습니다. 전자는 인접한 초록색, 빨간색-초록색 신호로 구성되며, 후자는 초록색 선으로만 구성됩니다.

종결 사건은 인접한 빨간색과 초록색으로 나타납니다. 빨간색 신호가 곳곳에 배치되어 있습니다. 기점은 연속적인 기점과 종결 신호로 구성됩니다.

실험 설계에 따라, 정체되거나 붕괴된 포크는 빨간색 신호만 나타나거나, 빨간색 선 뒤에 짧은 초록색 트랙이 이어지는 형태로 정의될 수 있습니다. 본 실험에서 야생형 DT 40 세포의 평균 포크 속도는 0.4 microns per minute입니다. 진행 중인 포크 63%, 복제 기점 10%, 정체된 포크 16%, 종료 지점 8%, 그리고 산재된 섬유 3%가 확인되었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 DT 40 세포에서 복제 포크 역동성을 시각화하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 DNA 복제의 결함을 조사하는 데 필수적인 도구가 될 것입니다.