의 시각화 Caenorhabditis Elegans 표피 구조

이 절차의 전반적인 목표는 적색 형광 친유성 염료 염료 눈을 사용하여 투명한 살아있는 바다의 우아함으로 큐티클을 시각화하는 것입니다. 이것은 염색을 위해 선충 개체군을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로 희석된 염료 눈을 개체군에 추가하고 배양할 수 있습니다.

그런 다음 동물을 염색 용액에서 회수합니다. Dai 염색된 큐티클의 형광 이미징은 Ailey와 Ann의 눈 생식 구조 및 기타 외부 형태학적 특징을 포함한 표면의 세부 사항을 보여줍니다. 직접 이미징, 형광, 전이유전자 발현, 항체 염색, 전자 현미경 및 표지된 밀 배아 응집소와 같은 이 투명 유기체에서 큐티클을 시각화하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 비교적 빠르고 저렴하게 수행하기 쉬우며 살아있는 동물의 피부 구조를 아름답게 해낸다는 것입니다.

이 방법은 세포 분비 및 표피 조직, 표피 세포 발달, 이종 만성 유전자 경로, 선천성 면역, 형태학적 형질의 발달 및 선충 진화와 같은 바다 우아함 모델 시스템과 그 표피를 사용하는 많은 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Robbie Schultz입니다. D Eye로 작업할 때는 빛에 민감하다는 점을 명심하십시오.

D눈은 항상 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오. 또한 DMF는 독성이 있고 DAI는 자동차이므로 장갑과 실험복을 착용하십시오. 시안화물 다이는 매우 강력합니다.

표준 강도 작업 희석은 M nine에서 DII 밀리리터당 30마이크로그램이며, 단일 모집단에는 400마이크로리터의 작업 희석만 필요합니다. 오염되지 않은 선충으로 채워진 60mm 플레이트로 시작합니다. 접시에 담긴 동물을 1.5ml의 0.5%Triton X 100으로 씻습니다.

M nine 버퍼에서 액체를 원을 그리며 부드럽게 휘젓어 모든 유충 및 성인 동물을 느슨하게 한 다음 세척물을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 즉시 2000RRP M에서 30초 동안 동물을 회전시켜 튜브 바닥에 있는 동물을 수집합니다. 동물을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 버리십시오.

욕심하지 말고 조심하십시오. M nine 1 밀리리터로 동물을 씻으십시오. 스핀다운하여 상층액을 제거합니다.

세탁을 반복합니다. 다시 스핀다운하여 상층액을 제거합니다. 다음으로 400 마이크로 리터에서 밀리리터 당 30 마이크로 그램의 다이 M 9 튜브에.

튜브를 잠시 소용돌이쳐 동물을 다시 매달아 놓습니다. 그런 다음 조명이 보호된 환경에서 섭씨 20도의 수평 위치에서 350RP M에서 3-16시간 동안 튜브를 흔듭니다. 지난 몇 단계의 타이밍이 중요합니다.

먼저, 트리톤 X는 다이가 결합하는 지질을 제거하기 전에 씻어내야 합니다. 둘째, 표피가 균일하게 염색될 수 있도록 충분히 오랫동안 염료 눈 용액으로 동물을 염색해야 합니다. 조금 후, 동물들이 묶여 있지 않은 눈을 제거할 수 있을 만큼 충분히 오랫동안 음식을 먹고 회복할 수 있도록 해야 합니다.

염색이 끝나면 동물을 회전시키고 염료 용액을 제거합니다. M nine 1ml로 동물을 씻으십시오. 결합되지 않은 염료를 제거하려면 동물을 회전시키고 상층액을 제거하십시오.

400마이크로리터의 M nine 버퍼에 동물을 다시 매달아 NGM 마이크로플레이트의 박테리아가 없는 부분에 붓습니다. OP 50 E Coli를 파종하면 동물이 어둠 속에서 최소 30분 동안 회복할 수 있지만 회복 시간 동안 염료 형광이 희미해지기 때문에 하루도 넘지 않습니다. 동물은 염료 염색액에서 기어 나와 음식 위로 기어 올라와야 합니다.

이 동물들은 자유 염료 눈의 배경 형광이 적기 때문에 이미지화하기가 더 쉽습니다. 사용된 농업 패드의 균일한 두께를 보장하기 위해 슬라이드에 농업 패드를 준비하는 것으로 시작하십시오. 두 개의 스페이서.

스페이서는 유리 슬라이드에 두 조각의 실험실 테이프를 겹쳐서 만듭니다. 스페이서는 무한정 사용할 수 있습니다. 다음으로, 두 개의 스페이서 슬라이드 사이에 깨끗한 유리 슬라이드를 세로로 배치하고 약 150 마이크로 리터의 용융 4 개의 한천을 피펫으로 피펫합니다.

깨끗한 유리 슬라이드의 중앙에. AER과 두 스페이서 위에 수직으로 배치된 추가 슬라이드로 용융된 AER을 빠르게 덮어 한천 패드를 형성합니다. 패드를 장착 슬라이드 상단 중앙에 유지하면서 커버 슬라이드에서 조심스럽게 밀어냅니다.

이제 5마이크로리터의 선충 마취제를 피펫으로 패드에 넣고 8-12마리의 동물을 마취제에 장착한 다음 현미경 커버 슬립으로 부드럽게 덮습니다. 최소 40x 대물렌즈와 트리시 필터 또는 기타 호환 가능한 필터가 장착된 복합 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 동물을 관찰합니다. 염료 눈의 형광 여기 최대치는 549나노미터이고 최대 방출은 565나노미터입니다.

바운드 다이의 경우 이미징은 이 프로토콜에서 가장 어려운 부분입니다. 이미징을 위해 동물을 장착하는 방법을 보여주지만, 사용할 화합물 또는 컨포칼 스코프에 대해 적절한 교육을 받아야 합니다. 우리는 최소 60배 배율의 대물렌즈를 사용하는 것이 염색 방법으로 조명된 세부 사항을 해결하는 데 가장 좋다는 것을 발견했습니다.

이 섹션의 각 이미지는 포스터 배아 밀봉 우아함의 63 x 대물렌즈를 사용하여 촬영되었습니다. 표피 표면은 매년 원주 고랑으로 분리되어 있으며 일부 단계에서는 에일리(ailey)라고 하는 세로 능선이 있습니다. 이 섹션의 각 이미지는 배아 후 C 우아함에서 63 x 대물렌즈로 촬영되었습니다.

표피 표면은 원주 고랑으로 분리 된 연간화를 포함하며 일부 단계에서는 aley라고 불리는 세로 융기를 포함합니다. 각 발달 단계에는 뚜렷한 구성과 패턴을 가진 표피 구조, aley와 Aly 형광 염색의 능선 또는 고랑이 있습니다. 표면 구성에 따라 다릅니다.

이 염료 서기 방법을 사용하는 모든 유충 및 성충 단계에서 회복 후 최대 하루 동안 볼 수 있습니다. 배경 형광 반점이 때때로 관찰되지만 일상적이지는 않습니다. 이것은 중등도의 큐티클 조직 결함을 보이는 성인 돌연변이 동물의 큐티클입니다.

Ailey 능선은 불연속적이고 수적으로 많습니다. Ailey 능선은 융합되고 분기되거나 분기되며 일반적인 형질 전환 마커입니다. 우세한 롤 6 대립유전자는 표피의 뒤틀림을 유발하며, 이는 에일리에서 볼 수 있으며 고리가 불규칙하게 패턴화되는 원인이 될 수 있습니다.

Dai는 또한 성인 자웅동체, 외음부 및 성인 남성 꼬리 올리기를 포함한 다른 외부 표피 구조를 염색하고 Fan Dai는 또한 이러한 갈래 꼬리와 같은 외부 형태의 미묘한 결함, 불충분한 염색을 강조할 수 있습니다. 예를 들어, 2시간 동안 염색하면 고르지 못한 피부 염색이 발생하지만, 환경에 노출된 뉴런이 염색될 수 있습니다.이 기술은 일단 숙달되면 이 기술을 4시간 안에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 이미징을 포함하지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 큐티클 및 기타 외부 형태학적 구조를 관찰하기 위해 다이 아이로 바다의 우아함을 염색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.