Name: 임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 임의 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 통해 단백질 결정화 성공률을 향상시키는 방법을. 이 기술은 결정의 수와 회절 품질을 개선하여 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 BBSRC (BB/1006478/1)에 의해 부분적으로 투자되었다. PRR은 왕립 학회 대학 연​​구 활동의받는 사람입니다.

1. 전략적 고려 사항 <ol><li> microseeding 실험에 사용되는 종자 결정의 선택은 실험의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 시작 부분에 크리스탈 최적화를 위해 다른 시작 지점을 제공 할 수있는 몇 가지 결정 히트를 찾기 위해 도움이됩니다. 상질 결정 교란 다음 또는 시스템이 평형 상태로 복귀 핵화 곳 영역 즉 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성이 있으므로 rMMS 크게 결정 최적화의 필요성을 감소시킨다. 따라서 우리는 첫 번째 결정이 (즉시 최초의 결정이 성장 정지로, 더 정확하게, 또는) 얻을 수있다로 정기적으로 즉시 rMMS을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> rMMS의 초기 라운드, 시드 콘텐츠는 극력 결정질 재료로 만들어 져야한다. 하나의 잘 사용할 수있는 경우 그 결정을 포함, 또는 결정이 작은 경우, 다수의 반복을 설정하는 것이 도움이 될 수 있습니다결정의 공급을 증가하는 (시드 제외) 원본 히트. 그러나, 여러 가지 히트를 얻을 수 있으며, 경우, 종자 결정은 몇 가지 조건에서 수확과 함께 혼합 할 수 있습니다. </li><li> 상 분리를 방지하기 위해, 높은 염 조​​건에서 성장 된 결정을 높은 PEG 조건에서 성장 된 결정 별도로 수확한다. 여러 우물에서 결정이 혼합되어있는 경우, 소금 결정을 줄 가능성이 적습니다 저장 솔루션은 씨앗 서스​​펜션을 선택해야합니다. 예를 들어, 인산염, 황산염, 칼슘, 마그네슘의 고농도는 피해야한다. </li><li> 나중에 프로젝트는, 회절을 향상 한쌍으로 결정을 피하고, 리간드 결합에 적합한 결정을 얻기 위해 서로 다른 단위 세포와 결정을 찾기 위해 중요 할 수있다. 이 단계에서 (예를 들면 최선을 회절하는 것) 가장 적당한 결정 시드 재고를 확인하는 데 사용되어야한다. microseeding의 반복을 라운드는 여기서 만 &quot;최고, 필요&quot;결정은 다음 라운드에 씨앗 주식을 만드는 데 사용됩니다. 가능하면,&quot;이러한 PEG 3000 중립 &quot;침전제는 새로운 결정 연락처를 장려하기 위해 높은 불안정 할 수 있습니다 단지를 구체화 할 수있는 종자 결정을 중지하는 데 사용되어야합니다 소금 솔루션 12. </li><li> 하나의 결정화 조건을 사용하는 고전 microseeding 실험은 유망한 조건의 후속 최적화 동안 식별 다음 종종 도움이된다. 그것은 드롭 당 결정의 원하는 번호를 얻기 위하여 종자 스톡을 희석하는 것이 필요하다. (증가 희석의 씨앗 주식의 일련의 결정화 조건에 추가됩니다) &quot;조합&quot;microseeding 실험 씨앗 주식의 최적의 희석을 찾기위한 빠른 방법입니다. 이 방법은 아래에 설명된다. </li></ol> 2. 시드 재고 준비 <ol><li> 분젠 불꽃을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫으로부터 둥근 유리 프로브를 만들. <ol><li> 부드러운 될 때까지 중간 근처 피펫을 가열 한 후 신속하게 불에서 제거하고 끝을 따로 잡아 당겨 끌어. 아래 0.25 mm 이하의 직경 유리를 당겨하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 이 약 0.25 mm이며, 간단히 화염에 깨진 끝을 뛰어 점에서 유리 휴식. ~ 825 mm의 직경이 단부에 형성되어있는 유리의 반구 때까지 이것을 반복한다. 이 적절하게 0.01 ~ 1.0 mm의 규모에 단단한 물체에 부딪혀서에 맞는 크기와 그것이 결정 트레이 하위 잘 또는 커버 슬립의 플라스틱 표면을 손상하지 않는 한이 프로브는 결정 성 물질을 분쇄하는 데 유용합니다. 결정이 유리와 플라스틱 사이에 갇혀 있기 때문에 큰 프로브 (~ 1.0 mm)를보다 효율적으로 작은 결정을 분쇄 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 얼음에 시드 비드를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 배치합니다. </li><li> 쌍안 현미경 또는 결정 촬상 시스템을 이용하여 미리 설정된 결정화 트레이를 검사하고, 하나 이상의 AP를 선택시드 재고 세대를위한 결정 자료를 수확되는 트레이에서 우물와 적합한. 모든 물질은 미세 바늘, 구정, 미결정 및 불규칙한, 잘못 구성된 결정을 포함하여 사용 할 수 있습니다. 구형 물질이 부분적으로 가교 결합 될 가능성 같이 시드 콘텐츠는 따라서 시드 실험에 사용하기위한 그것의 적합성을 줄여, 가능한 빨리 결정 성장 정지 후에 만​​들어 져야한다. 의심은 수확 될 결정질 재료가 잘은 UV 형광 현미경 또는 이미징 시스템 전에 개구 행을 사용하여 가시화 될 수 있고, 또는 결정 성 물질은 인 - 시튜 X-선 회절 분석을 실시 할 수있다 염 또는 단백질인지에 존재하지 않으면 트레이. UV 조사하에 형광 것이다 갑 접근법 단백질 결정을 사용하는 경우, 염 결정은 무색 나타날 것이다. </li><li> 잘 선택한 결정 트레이를 엽니 다. 96 - 웰 주위에 상단 플라스틱 밀봉 시트를 잘라 드롭 트레이에 앉아에 대한 USI 잘 선택메스의 칼날을 겨. 24 잘 매달려 드롭 용지함 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 반전하고 안정된 깨끗한 표면에 놓으십시오. 저장 용액 50 μl를 제거하고 튜브에 걸쳐 얼음에 남아있는 것을 보장 시드 비드를 포함하는 microcentrifuge 관에이 액체를 전송합니다. </li><li> 철저하게 현미경으로 결과를보고, 2.1 절에서 제조 된 유리의 프로브를 사용하여, subwell (96 - 웰 트레이) 또는 커버 슬립 (24 웰 트레이)에 떨어진다 결정을 분쇄. 작은 결정은 철저하게 분쇄하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 이 단계는 실험자 결정들은 염 결정되지 않는 것을 또한 분쇄하기 쉽기 때문에, 가교되지 않으며, 확인 할 수있다. 소금 결정은 듣고 그들이 분쇄 할 때 느낄 수있는 특유의 클릭을 생산하고 있습니다. 결정은 신선한 재료를 획득하고 사용하는 시도를 분쇄하기 힘든 어려운 경우. </li><li> 씨 구슬 튜브와 t의 저장 용액의 5 μl를 제거를 ransfer에 해당하는 하위 아니라 (드롭 실험에 앉아), 또는 커버 슬립 (낙하 실험을 거는) 수확되는 결정 성 물질을 포함한다. 가능한 한 하위 잘 또는 커버 슬립 내용의 많은 부분을 재현 탁이 액체 위아래로 5 ~ 6 시​​간을 피펫. 씨 구슬 튜브에 서스펜션을 반환하고 많은 결정 물질을 가능한 한 수확하는 것이 보장, 두 번 더이 단계를 반복합니다. </li><li> 얼음에 튜브를 냉각하기 위해 매 30 초 정지, 2 분 씨 구슬을 소용돌이. </li><li> 4 각 단계에서 10의 요인에 의해 저장 솔루션의 씨앗 주식을 희석, 희석 시리즈를 확인합니다. 일반적으로, 너무 많은 결정을 희석 씨의 주식을 사용할 때 얻을, 잘 당 결정의 수를 제어하기 위해 희석 씨의 주식을 사용합니다. 씨앗의 농도보다 더 결정화 히트 수득되기 때문에 rMMS의 첫번째 라운드에서는, 시드 원​​액을 희석하지 않는 것이 중요하다. </li><li> 그것은 즉시 주를 사용할 수없는 경우ately, -20 ° C에 씨앗 주식 서스펜션과 희석 씨의 주식을 전송하거나 저장 -80 C 냉장고 °. 작은 양 분량 씩, 즉 10 ~ 20 μL에이 물질을 저장, 씨앗 주식의 효능을 감소시킬 수있는, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지합니다. 냉동하면 필요할 때까지, 씨앗 주식은 무기한으로 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 결정화 트레이 설립 <ol><li> 결정화 설비와 실험자의 환경의 상황에 따라, rMMS 결정화 스크리닝 앉아 드롭 기상 확산법을 이용하여 걸려 드롭 기상 확산법을 이용한 24 - 웰 트레이, 또는 96 - 웰 트레이를 사용하여 수행 될 수있다. rMMS위한 결정화 트레이 로봇 디스펜서 처리 액체, 또는 둘의 조합을 이용하여, 손으로도 설정 될 수있다. </li><li> 손으로 설정 전형적인 rMMS 실험, 1.0 ㎕의 단백질 용액, 1.0 ㎕의 결정화 조건을 포함하고합니다0.5 ㎕의 씨앗의 주식. 결정화 로봇을 사용하여 설정 전형적인 실험은 0.3 ㎕의 단백질 용액, 0.2 ㎕의 결정화 조건, 0.1 ㎕의 씨앗 주식을 포함 할 것이다. </li><li> 24 웰 드롭 트레이 걸려 rMMS 검사를 수행하려면, 첫째, 수동 피펫을 사용하여, 4 × 24 웰 pregreased 결정의 각 웰에 10 ㎖ 단일 튜브 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 300 μl를 전송 트레이. <ol><li> 모두 전면과 후면 보호 역행 스트립 제거 된 해당 플라스틱 커버 슬립의 표면에 각각 300 ㎕의 저수지에서 각 결정화 조건의 양도 1 μL. </li><li> 각 결정화 조건의 1 μL로 결정 씨앗 주식의 0.5 μL 다음에 단백질 용액 1 μl를 추가합니다. 액체의 드롭 하향 잘 적절한 위에 위치되도록 각 coverslip에 전환. </li><li> 아래로 coverslip을 눌러, seali를 압축그리스를 겨 안전한 실을 형성한다. 일단 96 방울을 설립, 트레이는 일반적으로 스토리지에 대한 범위 4-18 °의 C에서 인큐베이터 또는 일정한 온도의 방에 전송해야합니다. </li></ol></li><li> 96 - 웰 드롭 트레이는 먼저 각각의 결정화 트레이 잘 대응에 깊은 우물 블록 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 20 ~ 50 μl를 전송 앉아 rMMS 검사를 수행합니다. 이 전사 공정은 8 - 채널 피펫을 사용하여 결정화 로봇 또는 수동 전송로를 사용하여 수행 될 수있다. <ol><li> 손으로 또는 3.1에 ​​설명 된 볼륨을 사용하여 로봇 방울로 전송 저수지, 단백질과 씨앗 주식 솔루션을 제공합니다. 일부 상용 결정화 로봇은 분배를 접촉하지 않고, 이러한 시스템을 사용하여 성능의 씨앗 주식 전송 조언, 관련 배관 분배의 막힘의 원인이 될 수 있습니다. 분배의 순서는 변수 : 일부 로봇은 동시에 모든 솔루션을 분배. 면다음 주식을 배정 저수지 후, 최초의 단백질을 분배 이것은 불가능합니다. </li><li> 로봇을 분배 접촉 무딘 바늘로 장착되어 낮은 볼륨 유리 주사기를 사용하여 씨앗 가능한 전송되지 않습니다. 각 드롭에 씨앗 주식을 분배 저장 솔루션을 통해 전달하여 바늘을 씻어. </li><li> 투명 밀봉 시트를 사용하여 트레이를 밀봉하고 인큐베이터 또는 저장을위한 일정한 온도의 방에 전송할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 결정화 트레이의 검사 <ol><li> 쌍안 현미경 또는 수정 이미징 시스템을 사용하여 모든 결정화 실험을 시각화. 전자는 일반적으로 뷰 깊이 이상의 사용자 큰 제어 및 후자보다 배율 수준을 수득하지만, 더 많은 시간이 걸린다. </li><li> 순서대로 각 sub-well/coverslip를 검사하고 수정 형성의 증거를 기록. 실험마다 24 설립 다음 5 일 동안 시간과 검사해야N 이후에 한 번, 최대 4 주 동안 매 7 일마다. </li><li> 최적의 회절 품질 결정이 생성되기 전에 rMMS의 여러 사이클은 종종 필요합니다. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용하여 성장 결정 사이 회절 품질의 변동이 적고 밝혀 13. 그들은 결정화 비정상적으로 쉽기 때문에 HEWL 및 BLC는 전형적인 결과를 주어진 수 있습니다. 또한 rMMS 실험에 사용되는 크리스탈 시드 주식의 농도를 최적화의 중요성을 설명하고,이 회절 품질 결정의 최적의 수는 제조되는 것을 보장하기 위해 희석에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여준다. rMMS 높게, 심플, 높은 스루풋이며전통적인 스크리닝 방법을 보완하는 데 사용할 수있는 확...

페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 1, 2에 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 - 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향. 시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 4-7의 숫자, 크기 및 품질을 향상시키기위한 가능한 방법으로 사칭되었다. 이 방법은 결정 핵 생성을 지원 조건이 후속의 결정 성장 및 그 반대를위한 최적이 아닐 수 있다는 전제에 기초한다. 다른 하나의 조건에서 핵 물질을 이동하여, 하나는 효과적으로 이러한 프로세스를 분리하는 새로운, 아직 미개척 결정화 공간에 따라서주는 접근을 시도 할 수 있습니다결과적으로 스크리닝 실험의 성공률을 증가시킬 수있다. 정해진 방법은 일반적으로 예를 들어 사용하는 지향성 압력의인가에 의해 얻어진 (I) macroseeding 다른 8 개의 조건에서 그 전체 단결정의 이동, (II)을 연속 시드, 핵 물질의 이동, 문서화 된 새로운 결정화 드롭 9, 그리고 (iii) &quot;고전적인&quot;microseeding 통해 수염의 후속 통과 한 다음 기존 결정의 표면에 고양이의 수염은, 수확에 의해 생성 된 결정 &quot;씨앗&quot;의 전송 결정 (또는 결정을 분쇄 씨앗 10를 산출하는 것과 유사한 조건에 자료). 특히 이러한 방법의 세 가지 확실히 현대 액체 처리 결정화 로봇과 달성 가능한 비교, 시간과 제대로 확장됩니다. 이러한 요소는 인식에, 적어도 어떤 수준에 기여하는 씨앗ING는 다른 접근이 결실을 맺기에 실패한 경우에만 방문 할 수있는 방법입니다. 임의의 행렬 microseeding (rMMS)는 높은 처리량 검사 및 확장 성을 11 ~ 13 그 전통 microseeding의 장점을 결합하여 최근의 방법 론적 혁신입니다. 이 방법은 표준 96 - 조건 결정화 화면 내의 각 sub-well/coverslip에 /로 분주 할 수있다 유핵 결정 성 물질에서 생산 된 종자 주식의 생성에 의존합니다. 이 방법은 두 손으로 또는 24도 또는 96도 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 증기 확산 실험을, 앉아 또는 교수형에 적용 할 수있다. rMMS 크게 결정화 성공률을 증가시키고, 더 큰 회절 질 및 양으로 18, 13, 14의 결정을 생성하기 위하여 실험적으로 증명하고, O에 접근 결정 학자 &#39;병기 혁신적인 공구를 나타내고있다결정화 성공을 향한 노력을 ngoing. 여기에서 우리는 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명하고이 기​​술의 효과를 보여주는 샘플 데이터를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>MRC 96 웰 결정화 트레이</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD11-00-100</td><td>Non-UV compatible, 로봇</td></tr><tr><td>ClearView 밀봉 시트</td>에 의해 설정된 스크린용 <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD6-01S</td><td></td></tr><tr><td>암탉 달걀 흰자 lyzozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>~95% 순도</td></tr><tr><td>소 간 카틸라제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td> 95% 순도</td></tr><tr><td>Xylanase</td><td>Hampton Research</td><td>HR7-104</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatococcus daniellii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7630</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1512</td><td></td></tr><tr><td>JCSG plus HT-96 screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-40</td> 로봇 <td></td></tr><tr><td>PACT premier HT-96에 의해 설정된 스크린 스크린</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-36</td> 로봇 <td></td></tr><tr><td>Morpheus HT-96</td>에 의해 설정된 스크린 <td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-47</td> 로봇 Crystal Ph&#8211<td>에 의해 설정된 스크린</td></tr><tr><td>; nix 액체 처리 시스템</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>Seed bead kit</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 스테레오 현미경</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2646-100EA</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu; l 피펫</td><td>Starlab</td><td>S7100-0125</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 2-20 &mu; l 피펫</td><td>Starlab</td><td>S7100-0221</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 100-1000 &mu; l 피펫</td><td>Starlab</td><td>S7100-1000</td><td></td></tr><tr><td>JCSG-plus screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-37</td><td>손으로 설정 한 화면</td></tr><tr><td>PACT 프리미어 화면</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-29</td><td>손으로 설정 한 화면</td></tr><tr><td>Morpheus 화면</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>손으로 설정 한 화면</td></tr> 핀<tr><td>셋</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CrystalClene coverslips 18 mm</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD4-17</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722669</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-360</td><td></td></tr><tr><td>24 well XRL crystallization tray</td><td>Molecular Dimensions Limited</td><td>MD3-11</td><td>손으로</td></tr> <tr><td>만든 스크린용30%(w/v) PEG 8000, 0.2M 황산암모늄, 0.1M 카코딜산나트륨 pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20%(w/v) PEG 8000, 0.2M 마그네슘 아세테이트, 0.1M 카코딜레이트 나트륨 pH 6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20%(w/v) PEG 6000, 100mM 구연산 pH 5.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

임의 microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 - 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.

rMMS 실험 (A) 예 rMMS 검사의 효과를 입증하기 위해 우리는 암탉의 달걀 흰자위 라이소자임 (HEWL)과 소 간 카탈라제 (BLC)의 결정화에이 방법을 적용했다. 이 효소는 저명 결정화하고 구조적으로 잘 대상 (15, 16)를 특징으로 두. 등 모두 rMMS로 달성 향상된 결정화 성공률을 설명하기 위해 우수한 시험 과목을 제공하기 때문에. 결정화 실험은 96 - 웰 액체 처리 로봇을 사용하여 드롭 트레이 형식 앉아 년에 설립되었다. HEWL 및 BLC의 솔루션은 각각 100 ㎖ ㎎ / 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5, 각각의 동결 건조 분말을 용해하여 제조 하였다. 각 단백질 세 96 조건 결정화 화면이 사용되었다; JCSG, PACT와 모피어스. microseeding없이 결정화 심사는 저수지 50 μL의 볼륨 및 2 μl를 사용하여 실시 하였다단백질 용액 1 μL 및 저장 솔루션 1 ...

여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

이 절차의 전반적인 목표는 결정화 스크리닝 실험을 통해 얻은 단백질 결정의 수와 회절 품질을 개선하는 것입니다. 이를 위해, 관심 대상인 표적 단백질을 사용하여 구축된 기존의 단백질 결정화 스크리닝 실험에서 결정성 또는 침전성 물질을 확인하고, 해당 결정성 또는 침전성 물질을 회수하여 결정 시드 스톡(crystal seed stock)을 생성합니다. 그 다음, 표적 단백질과 결정 시드를 모두 포함하는 일련의 결정화 스크리닝을 구축합니다.마지막으로, 시딩 결정화 스크리닝을 통해 결정 형성 여부를 모니터링하고 새롭게 생성된 단백질 결정의 특성을 분석합니다. 결과적으로, 이 절차를 적용하면 결정화 스크리닝 실험에서 얻어지는 단백질 결정의 크기와 회절 품질 및 수량을 증가시킬 수 있습니다. 기존 방법, 예를 들어 전통적인 마이크로 시딩(micro seeding)이나 매크로 시딩(macro seeding)과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 신속하게 수행할 수 있고, 확장성이 매우 높으며, 다른 시딩 방법보다 훨씬 더 많은 결정화 공간을 샘플링할 수 있다는 점입니다.이 기술의 또 다른 장점은 종자 주식(seed stock) 생산을 위해 고품질의 결정성 출발 물질을 사용할 필요가 없다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 결정 수확 및 조작 단계에서 상당한 수준의 세밀한 손동작이 요구되기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 무작위 매트릭스 미세 시딩(random matrix micro seeding)은 다른 결정 시딩 방법과 크게 다르므로, 이 방법의 핵심 단계를 시각적으로 시연하는 것이 매우 중요합니다.이 방법의 세부 사항은 성공의 핵심이며, 이 중 상당수는 텍스트 형태로 정확하게 전달하기 어렵습니다. 반드시 쌍안 현미경이나 결정 이미징 시스템을 사용하여 결정이 안착된 결정화 트레이로 이 절차를 시작하십시오. 첫 일주일 동안은 매일 트레이를 점검하십시오.그 후 일주일에 한 번씩 결정 크기를 기록합니다. 더 이상의 성장이 관찰되지 않는 즉시, 트레이에서 결정 물질을 수확할 적절한 웰을 하나 이상 선택합니다. 시드 스톡(seed stock) 제작을 위해서는 미세한 바늘 모양, 나선형 모양, 미세 결정 및 불규칙하고 형태가 불분명한 결정을 포함하여 모든 물질을 사용할 수 있습니다.오래된 재료는 부분적으로 가교 결합될 가능성이 더 높으며, 파종 실험에 사용하기에는 덜 적합합니다. 수확 당일에 분젠 버너를

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

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프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

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결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

이 문서는 희소성 매트릭스 스크린에서 새로운 결정화 조건을 생성하기 위하여 마이크로 시드를 사용하여 I3C (5-아미노-2,4,6-트리오도이소프탈산)로 파생된 단백질 결정을 생성하는 방법을 제시합니다. 트레이는 액체 디스펜싱 로봇을 사용하거나 손으로 설정할 수 있습니다.

무작위 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 사용하여 I3C로 단백질 결정의 파생

이 기사의 목적은 시청자에게 대규모 단일 단백질 결정을 성장시키기 위한 소량의 증기 확산 프로토콜을 직렬 결정학을 위한 대용량 배치 미세 결정화 방법으로 변환하는 방법에 대한 확실한 이해를 제공하는 것입니다.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

이 프로토콜은 1,536개의 미세분석 플레이트 준비에서 6주간의 실험 기간 종료에 이르는 고처리량 결정화 스크리닝을 자세히 설명합니다. 시료 설정, 얻은 이미징 및 사용자가 인공 지능 지원 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 분석을 수행하여 거대분자 결정화 조건을 빠르고 효율적으로 식별하는 방법에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

배우세요 임의 마이크로시드 매트릭스 스크리닝을 통해 단백질 결정화 성공률을 향상시키는 방법을. 이 기술은 결정의 수와 회절 품질을 개선하여 구조생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

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