임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

이 절차의 전반적인 목표는 결정화 스크리닝 실험에서 얻은 단백질 결정의 수와 회절 품질을 개선하는 것입니다. 이를 위해 관심 표적 단백질을 사용하여 확립된 기존 단백질 결정화 스크리닝 실험에서 결정질 또는 침전된 물질을 식별하고, 결정질 또는 침전된 물질을 수확한 다음 결정 종자 스톡을 생성하는 데 사용합니다. 다음으로, 관심 대상 단백질과 결정 종자를 모두 포함하는 일련의 결정화 스크린이 설정됩니다.

마지막으로, 시딩된 결정화 스크린은 결정 형성을 모니터링하고, 새로운 단백질 결정을 특성화합니다. 궁극적으로 이 절차를 적용하면 결정화 스크리닝 실험에서 얻은 단백질 결정의 수와 회절 품질을 높일 수 있습니다. 기존 방법(예: 기존 마이크로 시딩(micro seeding) 또는 매크로 시딩(macro seeding)에 비해 이 기술의 주요 장점은 빠르게 수행할 수 있고, 확장성이 뛰어나며, 다른 시딩(seeding) 방법보다 훨씬 더 많은 결정화 공간을 샘플링할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 또 다른 장점은 종자 생산을 위해 고품질 결정질 출발 물질을 사용할 필요가 없다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 결정 수확 및 조작 단계에서 상당한 수준의 수동 손재주가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 무작위 매트릭스 마이크로 시딩(random matrix micro seeding)이 다른 결정 시딩(crystal seeding) 방법과 크게 다르기 때문에 분석법이 중요한지 여부를 시각적으로 보여줍니다.

이 방법의 미묘함은 성공의 열쇠이며, 이들 중 다수는 텍스트 형식으로 정확하게 전달하기 어렵습니다. 이 절차는 쌍안 현미경 또는 결정 이미징 시스템을 사용하여 장착된 결정화 트레이로 시작하십시오. 첫 주 동안 매일 트레이를 검사하십시오.

그런 다음 일주일에 한 번 크리스탈 크기를 기록하십시오. 추가 성장의 증거가 없으면 결정 물질을 수확할 트레이에서 하나 이상의 적절한 웰을 선택하십시오. 종자 스톡 생성을 위해 미세한 바늘, spial 조명, 미세 결정 및 불규칙하고 형성이 불량한 결정을 포함한 모든 재료를 사용할 수 있습니다.

오래된 재료는 부분적으로 가교될 가능성이 더 높으며 파종(seeding) 실험에 사용하기에 적합하지 않습니다. 수확 당일에는 염증이 있는 빵을 사용하여 유리 목초지 피펫으로 둥근 프로브를 만듭니다. 이렇게하려면 피펫이 부드러워 질 때까지 중간 근처에서 가열하십시오.

그런 다음 화염에서 빠르게 제거하고 끝을 당겨 빼냅니다. 약 0.25mm 인 지점에서 0.25mm 미만의 직경으로 유리를 끌어 내리는 것을 목표로합니다. 유리를 깨고 깨진 끝을 화염 속으로 잠시 집어넣습니다.

끝에 직경이 약 0.75mm인 유리 반구가 형성될 때까지 이 과정을 반복합니다. 씨앗 구슬이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 선택한 결정화 트레이를 엽니다.

글쎄요, 24개의 잘 매달린 드롭 트레이용. 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 커버 슬립을 뒤집어 안정적이고 깨끗한 표면에 놓습니다.

96 잘 앉아있는 드롭 트레이용. 메스를 사용하여 선택한 우물 상단의 플라스틱 천장 필름 주위를 자른 다음 핀셋을 사용하여 천장 필름의 절제 부분을 제거합니다. 50마이크로리터의 저장 용액을 제거하고 이 액체를 시드 비드가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 튜브가 내내 얼음 위에 남아 있도록 합니다.이 절차에서 가장 어려운 측면은 종자 스톡을 준비하는 것입니다.

설명된 대로 가능한 한 빨리 정확하게 이 작업을 수행하는 것이 중요합니다. 프로브로 종자 물질을 철저히 부수고 현미경으로 샘플을 보면서 가능한 한 많이 회수하도록 주의하십시오. 앞서 준비한 유리 프로브를 사용하여 덮개의 결정을 철저히 부수십시오.

슬립 드롭. 작은 결정은 완전히 분쇄하는 데 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 부서지기 쉬운 결정은 가교되지 않으며 소금 결정이 아닙니다.

소금 결정은 부서질 때 듣고 느낄 수 있는 독특한 딸깍 소리를 냅니다. 다음으로, 시드 비드 튜브에서 5마이크로리터의 저장 용액을 제거하고 좌식 낙하 실험을 위해 등가의 서브 웰로 옮기거나 수확할 결정 물질을 포함하는 매달린 낙하 실험을 위해 커버 슬립으로 옮깁니다. 이 액체를 위아래로 5-6회 피펫팅하여 서브 웰을 최대한 많이 재현탁시키거나 슬립 내용물을 덮습니다.

현탁액을 시드 비드 튜브에 다시 넣고 이 단계를 두 번 더 반복하여 가능한 한 많은 결정 물질을 수확합니다. Vortex, 씨앗 구슬을 2 분 동안 30 초마다 멈추고 얼음 위에서 튜브를 식히십시오. 1.5에서는 저장소 용액을 포함하는 밀리리터 튜브입니다.

저장 용액에서 종자를 각 단계에서 4-10의 계수로 희석하기 위해 희석 시리즈를 만드십시오. 종자, 스톡 및 희석액을 즉시 사용하지 않을 경우 10-20 마이크로 리터 분취액을 섭씨 영하 20도 또는 섭씨 음의 80도 냉동고에 넣어 보관하십시오. 일단 얼면 종자 재고는 필요할 때까지 무기한 보관할 수 있습니다.

RMMS 결정화 스크리닝은 행잉 드롭 증기 확산 방법을 사용하는 24개의 웰 트레이 또는 sitting drop vapor diffusion 방법을 사용하는 96웰 트레이를 사용하여 수행할 수 있습니다. 24개의 웰 행잉 드롭 트레이에서 MMS 스크리닝을 수행하려면 피펫을 사용하여 96개 조건 결정화 스크린에서 각 조건의 300마이크로리터를 10밀리리터로 수동으로 이송합니다. 4 24의 각 우물에 단일 튜브 형식.

각 300 마이크로리터 저장 탱크의 잘 사전 그리스를 칠한 결정화 트레이는 각 결정화 조건의 1 마이크로리터를 해당 플라스틱 커버 슬립의 표면으로 전달하며, 여기에서 전면 및 후면 보호 백킹 스트립이 모두 1 마이크로리터로 제거됩니다. 커버 슬립에 1마이크로리터의 단백질 용액을 추가한 다음 0.5마이크로리터의 결정 종자 스톡을 추가합니다. RMMS의 첫 번째 라운드에서는 희석된 종자 스톡 용액을 사용하지 않는 것이 중요합니다.

종자의 농도가 높을수록 더 많은 결정화 히트를 얻을 수 있습니다. 액체 방울이 아래를 향하고 적절한 위치 위에 위치하도록 각 커버 슬립을 뒤집습니다. 커버 슬립을 아래쪽으로 잘 눌러 천장 그리스를 압축하고 단단히 밀봉합니다.

96방울이 모두 굳으면 트레이를 섭씨 4도에서 18도의 인큐베이터 또는 일정한 온도의 방으로 옮겨 보관합니다. 96 년에 MMS 스크리닝을 수행하기 위해 드롭 트레이가 잘 앉아 있습니다. 결정화 로봇 또는 8채널 피펫을 사용하여 딥 웰 블록 형식의 96개 조건 결정화 스크린에서 각 조건의 20 - 50 마이크로리터를 결정화 트레이의 각 해당 웰로 이동합니다.

다음으로, 1.0 마이크로 리터의 단백질 용액, 1.0 마이크로 리터의 결정화 조건 및 0.5 마이크로 리터의 종자 원료를 방울로 옮깁니다. 투명 천정 시트를 사용하여 트레이를 밀봉하고 섭씨 4도에서 18도 또는 항온의 인큐베이터로 옮기고, 보관 실험을 위해 설치 후 5일 동안 24시간에 한 번씩 검사한 다음 쌍안 현미경 또는 수정 이미징 시스템을 사용하여 최대 4주 동안 7일에 한 번씩 검사해야 합니다. 각 서브 웰 또는 커버 슬립을 순서대로 검사하고 결정 형성의 증거를 기록합니다.

MMS 스크리닝 실험의 결과를 비 ED 스크리닝의 결과와 비교하고 차이점을 기록합니다. RMMS의 여러 주기가 관찰되어야 할 수 있습니다. 최적의 회절 전에 추가 사이클을 위해 고품질 결정이 생산됩니다.

필요에 따라 보관된 희석된 종자 재고를 사용하여 웰당 결정의 수를 제어합니다. RMMS의 효과를 입증합니다. 스크리닝 방법은 각 단백질 3 96 조건에 대한 헤나, 백색 라이소자임 및 소 간 촉매의 결정화에 적용되었습니다.

결정화 스크린은 J-C-S-G-P-A-C-T 및 Morpheus를 사용했습니다. 그런 다음 5일 후, 결정질 물질의 성장을 지원하는 것으로 밝혀진 각 트레이의 단일 조건을 선택하여 종자 스톡 생성에 사용했습니다. 5일 후, 결정화 트레이를 검사하고 결정이 있는 방울의 수를 기록했습니다.

이 그림은 이 실험의 결과를 요약하고 암탉 달걀 흰자 라이소자임에 대한 정량적 분석을 제공합니다. RMMS를 이 단백질에 적용했을 때 non-ED 트레이와 비교하여 결정화 성공률이 4-10배 증가하는 것이 관찰되었습니다. 특히 소 간 카탈라아제의 경우 RMMS 사용 후 확인된 55개의 조건에 비해 Morpheus 스크리닝에서 단 하나의 조건만 결정을 생성하는 것으로 나타났습니다.

또한, 모든 사례에서 JCSG 및 PACT 스크리닝을 사용한 소 간 캔 결정화의 성공률이 각각 3배 및 2배 증가했으며, 사용된 결정화 스크리닝에 관계없이 당사의 MMS 스크리닝은 비 RMMS 스크리닝보다 훨씬 더 많은 총 결정 수를 산출했습니다. 우리는 MMS가 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 크게 높일 수 있는 간단하면서도 강력한 접근 방식이라는 결론을 내렸습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 결정 물질의 식별 및 수확부터 결정 종자 스톡의 준비, 그리고 마지막으로 마스터한 후 파종 결정화의 확립에 이르기까지 무작위 마이크로 파종 매트릭스 스크리닝 실험을 수행하는 방법을 잘 이해해야 합니다.

이 기술은 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 무작위 매트릭스 마이크로 시딩 스크리닝 실험의 경우 액체 취급 로봇을 사용하여 수행하거나 수동으로 수행하는 실험의 경우 약 3시간 내에 수행합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 파종된 결정화 스크린이 보관 전에 잘 밀봉되었는지 확인하는 것이 중요합니다.