Name: X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 X-선 회절 실험을 위한 단백질 결정화 기법으로 증기 확산법과 마이크로 배치법을 사용하여 고품질 결정을 생성하는 방법을 익히세요. 이 기술은 구조 생물학 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 YM에 버로우즈 웰컴의 인베스티게이터 수상과 MD로 예일 대학에서 브라운 - 콕스 박사 과정 이수 원정대에 의해 지원되었다.

자료 : <ul><li> 단백질 샘플 - 라이 소 자임 (50 MG / ML) </li><li> 드롭 24 잘 트레이를 달아 </li><li> 드롭 24 잘 트레이 앉아 </li><li> Microbatch의 결정 96 잘 트레이 </li><li> 결정화 솔루션 (중 사용 가능한 상업적 또는 집에​​서 만든) </li><li> 실리콘 그리스 </li><li> Luer - 잠금없이 5 ML 주사기 </li><li> Siliconized 커버 슬라이드 </li><li> 광학 씰링 테이프 </li><li> 파라핀 </li><li> 낮은 유지 팁을 0.1-2 μL micropipette </li><li> 족집게 </li><li> 프로 페셔널 쳐줍니다 </li></ul> 1. 한깅 / 드롭 절차를 돌보기 : <ol><li> 초기 화면 하나는 시험 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 방법을 이용 상용 화면을 사용할 수 있습니다. 스파스 매트릭스 불완전 요소 방법으로 편견과 macromolecules 알려져 결정화 조건 (카터와 카터, 1979; Cudney 외, 1994;. Jancarik과 김, 1991;. Jancarik 외, 1991)에서 선택됩니다. 결정화 조건이 이미 알려져있는 경우, 좁은 화면이 원래 공격 주변 침전제 농도와 산도 변화, 조립하실 수 있습니다. 가장 일반적으로 성공적인 침전제는 암모늄 황산 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)입니다. 함께 결정 (길리 랜드 외, 1994.; 킴버 외, 2003;.. 페이지 외, 2003)에 사용되는 모든 기록 macromolecular의 precipitants의 약 60 %를 두 precipitants 계정. </li><li> 당신의 결정 솔루션을 준비합니다. 보통 이러한 조건은 precipitating 대리인, 일종의 소금과 산도를 설정하는 버퍼에서 결합됩니다. 어떤 경우에는 첨가제가 관심의 단백질을 위해 특별히 추가할 수 있습니다. 모든 주식 솔루션은 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링해야합니다. 주식 솔루션의 일부 (50 % 펙스, 글리세롤, PEG - MME 등) 매우 점성 수 있습니다. <ul><li> 0.6 1.5 ML, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 0.1 M NaOAc 산도 4.0, 4.3, 4.6 및 4.9에서 1.6 M NaCl을 각각 (24 솔루션 총) 준비 </li></ul></li><li> 귀하의 단백질 샘플을 녹여 얼음 계속. 관심의 단백질 (그렇다면, 4 저장 ° C) / 해동 사이클을 멈추고 민감한되지 않는 단백질 주식은 -80 ° C에서 저장해야합니다. 일반적인 단백질 농도가 높은 농도는 일반적으로 더 나은 결과를 제공과 함께, 50-50 MG / ML의 범위에 있습니다. </li><li> 어떤 단백질은 해동 단계 이후 부분적으로 집계하고 침전하는 경향 - 15min/18이 000xg / 4 ° C 샘플을 스핀. 이러한 집합체 따라서 철저한 스핀은 아래로 당신의 예제에서만 용해 분자를 보증합니다 단백질 분자의 나머지 비정질 강수​​를 홍보할 수 있습니다. 트레이를 설정까지 얼음에 단백질 보관하십시오. </li><li> UV 분광 광도계를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 자사의 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도는 흡광도 읽고 단백질의 흡광 계수로부터 계산하실 수 있습니다. : 흡광 계수는 Expasy 웹사이트에 ProtParam 도구를 사용하여 계산할 수 <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> 24 잘 매달려 / 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라 침전제 솔루션을 500 μL와 드롭 트레이를 돌보기의 우물을 입력합니다. 우물의 가장자리 주위에 실리콘 그리스 반지를 만듭니다. 반지는 잘가 봉쇄로 공기 압력 상승을 방지하기 위해 작은 간격이 있어야합니다. 앉아 방울에서, 잘가 (그림 2A) 테이프로 밀봉되어 있기 때문에 그리스에 대한 필요가 없습니다. </li><li> 커버 슬라이드를 타고 압축된 공기 스프레이, 또는 닦아 전문으로 청소 - 피하 먼지가 결정화 드롭의 해석을 쉽게하고 contaminations을 제거합니다. 방울을 앉아 들어, 표지 슬라이드가 사용되지 않습니다. 대신, 잘은 단백질과 침전제가 혼합되는 선반이 포함되어 있습니다. </li><li> 표지 슬라이드에서 단백질 샘플 및 저수지 솔루션의 동일한 볼륨을 넣어. 단백질과 침전제 서로 다른 볼륨이 최적화 프로세스의 일부로 재판을받을 수 있습니다. 희석 단백질 샘플 바람직 수 있으며, 결정 핵이나 성장을 늦추기 위해 평균 후 드롭에 단백질의 그물 농도 침전제 결과보다 더 많은 단백질을 사용합니다. 드롭 솔루션의 다른 비휘발성 물질도 같은 요소를 기준으로 집중됩니다. 표지 슬라이드에 단백질과 저수지 솔루션을 pipetting 때, 거품 형성을 피하기 위해 매우주의하십시오. 이것은 종종 공기가 피펫의 터져 경우에 발생합니다. <ul><li> 표지 슬라이드의 중심에 0.02 M NaOAc의 산도 4.9 50 MG / ML 라이 소 자임의 부하 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가 드롭 한깅. </li><li> 드롭 시팅 : 하중 선반의 중앙에 50 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가합니다. </li></ul></li><li> 부드럽게 커버 슬라이드를 전환하고 잘 위에 기름 링에 누워. PR에 기름에 부드럽게 이렇게 공기가 노치를 통해 우물에서 탈출 수 눌러이벤트 공기 압력 우물에 상승과 유지는 잘 밀봉. 물론 공기 압력 상승은 잘 밀봉을 손상, 커버 슬라이드를 올릴 수 있습니다. 앉아서 드롭 방식에서 광학 맑은 투명 테이프는 우물을 커버하는 데 사용됩니다. 따라서이 방법 씰링의 모든 행 / 열 배치됩니다. </li><li> 트레이가 완료될 때까지 다음 잘로 이동합니다. </li><li> 설치시 트레이를 확인 - 먼지 입자와 기타 contaminations을 제거하는 단백질 결정의 거짓 긍정적인 인식을 줄일 수 있습니다. </li><li> 실험을 문서에 점수 시트를 사용합니다. </li><li> 일반적으로 4 ° C 룸 온도 사이에 원하는 부화 온도에 트레이를 놓습니다. 20 ° C는 가장 일반적으로 성공합니다. 부드럽게 트레이를 처리하고 떨고 않도록 조심해. 개방과 보육의 문을 닫는 동안주의하십시오. 양도하거나 배양 중에 진동이나 온도 변화가 크리스탈 성장을 예방하거나 부정적인 수정 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 재료 (예 : 포장 거품)을 흡수하는 충격은 크리스탈 쟁반에 따라 패딩으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 결정에 대한 트레이 다음날을 확인 후 수일마다 항상주의 트레이를 취급. 트레이 특정 점수 시트에 결과와 드롭 morphologies를 문서. 크리스탈 가끔 훨씬 빨리 (즉시) 또는 그 이상 (최대 몇 개월까지!) 표시하지만 크리스탈은 일반적으로, 표시 2~5일 가져가라. 결정화 조건이 확인된과 결정의 성장 속도가 알려져 있습니다 일단 결정이 등장하고 그들의 최종 크기의 적어도 절반 성장 때까지, 그것은 쟁반은 그대로두고하는 것이 좋습니다. 트레이가 그대로두면 따라서 큰 결정의 작은 숫자를 생산, 크리스탈 핵 이벤트의 수를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 2. 절차 Microbatch : <ol><li> 단백질 샘플과 침전제 준비는 위에서 설명한 것처럼됩니다. </li><li> 에어 스프레이 새로운 microbatch 트레이는 먼지와 다른 큰 입자를 피할 수 있습니다. </li><li> microbatch 트레이에 높은 3mm (우물을 충당하기 위해 충분)에 파라핀 오일을 채우십시오. 오일의 액세스를 제거합니다. </li><li> 물론 미리 채워진 오일에 단백질 용액 (50 MG / ML 라이 소 자임) 1 μL를 로드할 - 잘 하단 (그림 2A)에 직접 솔루션을 피펫에 있는지 확인하십시오. </li><li> 드롭은 단백질 비말로 잘와 퓨즈의 바닥에 가라앉아 있는지 확인 - 잘 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라로 침전제 솔루션 1 μL를로드합니다. </li><li> 트레이가 완료될 때까지 다음 잘 이동합니다. </li><li> 따라가 매달려 / 드롭 절차를 돌보기의 11-14 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 결정은 일반적으로 X - 레이 crystallography의 병목 현상이라고합니다. precipitating 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 화면은 일반적으로 큰 단일 결정 중에서 단백질 집합과 석출 다양한 종류를 생산하고 있습니다. 단백질이나 침전제 농도가 너무 높은 경우 하나는 불분명하다 모양과 크기 (비정질 강수​​량)와 갈색 문제를 볼 수 있습니다. 솔루션 undersaturated 때, 드롭은 종종 침전의 모든 종류의 완전히 명확하고 찾아볼 것입니다. 그림 3은 석출 현상과 결정 (데싸우 외., 2006)에 대한 몇 가지 예제를 보여줍니다. 자세한 해석과 함께 더 많은 강수량 현상은에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 단백질 결정의 원칙. 단백질 결정의 원칙. 증기 확산 실험 (A) 침전제과 단백질 같은 볼륨 드롭에 존재한다. 물 밖으로 확산되며 평형은 드롭과 저수지 솔루션 사이의 달성 때까지 침전제 및 단백질 농도가 모두 두 배로됩니다. 배치 결정에 (B) 침전제 및 단백질 농도는 실험 기간 동안 변경되지 않습니다. 포인트 - 단백질은 더 크리스탈은, 포인트 B를 형성 수 없습니다 undersaturated 유지 - 단백질 핵이 발생, 수정은 양식에 시작 및 솔루션에서 단백질의 농도는 포화에 방울. 포인트 C는 - 단백질 precipitates하지만 결정은 여전히​​ 성장 수 있습니다. 사용 (C) 투석 결정 모세관 젤은 - 연결. 소금이 젤 플러그에 걸쳐 (및 / 또는 침전제 diffuses 단백질 샘플에) 단백질 샘플 밖 diffuses로 수정이 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 전형적인 단백질 결정화 실험의 개요. 드롭 증기 확산을 매달려 드롭 증기 확산을 앉아하고, microbatch 단백질 결정화에 대한 (A) 절차. 각각의 경우에, 집중 단백질 샘플의 작은 볼륨 precipitan의 같거나 작은 볼륨 혼합t 솔루션과 평형 수있었습니다. (B) 닭고기 라이 소 자임, 2​​4 잘 트레이의 결정에 대한 나트륨 염화물의 다양한 농도 (침전제)과 다양한 PHS에서 버퍼로 0.1 M의 아세트산 나트륨 (- 4.9 4.0)로 설정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 단백질 결정화 실험의 일반적인 결과. (A) 아몰퍼스 강수량은. 단백질 또는 침전제 (또는 둘 모두) 고농도에 때. (B) 단계 분리. 고농도에서 특정 precipitants과 혼합하면 단백질이나 세제는 다른 단계로 분리 수 있습니다. (C) AtCSN7의로드 모양의 단백질 결정은 폴리에틸렌 글리콜 8000 년 및 마그네슘 아세테이트를 (데싸우 외., 2006) 획득. (D) 라이 소 자임의 결정 1.0 M NaCl과 아세트산 나트륨의 산도 4.9에서 얻어진. (E) 포화 방울에서 일반적으로 분명 남아 있습니다. 모세 데싸우의 사진.

<ol><li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization+%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips+%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+%28CSN7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li>
<li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Macromolecule+Crystallization+Database%2C+Version+3.0%3A+new+features%2C+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+matrix+sampling%3A+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li>
<li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+mining+crystallization+databases%3A+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li>
<li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+growth+of+proteins%2C+nucleic+acids%2C+and+viruses+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcPherson%2C+A+%22Crystallization+of+biological+macromolecules%22">Crystallization of biological macromolecules</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics%3A+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서 우리는 단백질 결정화에 대한 일반적인 현재의 프로토콜을 설명하고 보여줍니다. 그 다단계 절차부터 몇 가지 고려 사항에 대해 알고 있어야 한 필요가있다. 증발로 인해 드롭의 건조 아주 작은 볼륨 (0.5-2 μL)과 함께 작업할 때하는 것은 중요한 관심사입니다. 따라서 그것은 잘 통제된 환경에서 작동하는 (낮은 공기 흐름, 높은 습도와 꽉 온도 제어)와 야외에있는 드롭의 노출을 최소화하는 기술을 채택하는 것이 좋습니다. 이런 이유로 그것은 잘 조직된 작업 환경에서 작동하는 것이 필수적입니다. 모든 시약은 쉬운 접근 (pipetors, 팁, 튜브, 잎사귀 등) 내에 있어야 트레이 및 실험실 장비를 설정하기 전에 준비를해야합니다. 일반적으로, 최대한 사용자가 트레이를 설정한다 시간을 저장의 단백질을 가져가라. 그 방법은 샘플에 이하의 환경 영향이있다. 그것은 튜브의 목 아니라 아래에있는 단백질이 어디 있는지, 예제가 체온에서 가열하지 않도록하여 단백질 튜브를 개최하는 ...

<table><tbody><tr><td>리소자임(Lysozyme)</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24 웰 VDX 플레이트</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24 웰 Cryschem 플레이트</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>Dow Corning 진공 그리스</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>실리콘 처리된 원형 유리 커버슬라이드</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% 파라핀 오일</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88인치 너비의 Crystal Clear 밀봉 테이프</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96 웰 Imp@ct 플레이트 (마이크로배치 플레이트)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

x - 선 crystallography에 대한 단백질 결정화

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

그들이 작동하는 방법 추론하기 위해 생물 학적 macromolecules의 3 차원 구조를 사용하는 것은 현대 생물학의 가장 중요한 분야 중 하나입니다. 원자 해상도 구조의 가용성 단백질 기능의 깊이와 독특한 이해를 제공하고, 살아있는 세포의 내부 동작을 해명하는 데 도움이됩니다. 날짜하려면, 단백질 데이터 은행 (rcsb - PDB) 항목의 86 %가 X - 레이 crystallography를 사용하여 결정 macromolecular 구조입니다. crystallographic 연구에 적합한 결정을 얻으려면,이 macromolecule (예 : 단백질, 핵산, 단백질 - 단백질 복합 단백질이나 핵산 복합) 균질성을 정화해야하며, 가까이 가능한 균등 수 있습니다. 준비의 균질성는 (; 맥퍼슨 1999 Bergfors, 1999) 높은 해상도로 분해하다 결정을 얻기에있는 중요한 요인이다. 결정은 과포화에 macromolecule을 가져 필요합니다. 샘플 따라서 집합 또는 macromolecule (보통 20-50 MG / ML)의 강수량을 유발하지 않고 가능한 가장 높은 농도로 집중해야합니다. precipitating 대리인에게 샘플을 소개하는 솔루션에서 성장하는 대형 입체적인 결정이 발생할 수 있습니다 솔루션에 단백질 결정의 핵을 홍보할 수 있습니다. 수증기 확산 및 배치 결정 : 결정을 얻는 두 가지 주요 기술이 있습니다. 수증기 확산, 침전제 및 단백질 솔루션의 혼합물을 포함하는 드롭 순수한 침전제있는 챔버에 봉인합니다. 드롭과 침전제의 osmolarity가 (그림 1A) 동일 때까지 수증기 그 다음 드롭 아웃 diffuses. 평형이 달성 때까지 드롭의 탈수는 이상적인 위상 다이어그램의 결정 핵의 영역에, 단백질과 침전제 모두 느린 농도가 발생합니다. 배치 방법은 침전제의 해당 금액을 (그림 1B)와 혼합 단백질에 의해 직접 핵 영역에 단백질을 가져에 의존합니다. 이 방법은 일반적으로 드롭 밖으로 물의 확산을 방지하기 위해 파라핀 / 미네랄 오일 혼합에 따라 수행됩니다. 우리가 기름을 아래에 배치 결정 이외에 드롭하고 앉아 드롭 매달려, 증기 확산을위한 실험 설정의 두 종류를 보여줄 것입니다.

결정화는 일반적으로 X선 결정학의 병목 구간으로 언급됩니다. 침전 조건에 대한 희소 행렬 불완전 요인 설계(sparse matrix incomplete factorial screen)를 수행하면 대형 단결정을 포함하여 여러 다양한 유형의 단백질 응집 및 침전이 일반적으로 발생합니다. 단백질이나 침전제의 농도가 너무 높으면 뚜렷한 모양이나 크기가 없는 갈색 물질(무정형 침전)이 관찰될 수 있습니다. 용액이 불포화 상태일 때, 액적은 종종 완전히 투명하며 어떤 종류의 침전물도 나타나지 않습니다. 그림 3은 침전 현상과 결정의 여러 예를 보여줍니다 (Dessau et al., 2006). 더 상세한 해석이 포함된 더 많은 침전 현상은 <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a>에서 확인할 수 있습니다.
	<p class="jove_content" fo:keep-together...

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

생체 고분자의 3차원 구조를 이용하여 그 기능을 추론하는 것은 현대 생물학에서 가장 중요한 분야 중 하나입니다.

본 절차의 전반적인 목표는 X-선 회절 실험을 위한 단백질 결정을 생성하는 것입니다. 결정 스크리닝을 위한 세 가지 서로 다른 기술이 시연되며, 증기 확산 결정화 방법인 행잉 드롭(hanging drop) 및 시팅 드롭(sitting drop) 방식과 더불어 증기 확산 결정화를 위한 마이크로 배치(micro batch) 결정화 방법이 설명됩니다. 웰(well)은 침전제로 채워집니다.그 다음, 고농도의 정제된 단백질 샘플을 침전제와 혼합합니다. 혼합된 액적을 침전제 용액이 들어 있는 웰에 넣고 밀봉합니다. 웰을 파라핀 오일로 채우면 마이크로 배치 결정화가 시작됩니다.그다음 단백질을 웰에 로딩하고, 이어서 침전제 용액을 넣습니다. 모든 방법의 마지막 단계는 시스템이 평형을 이루도록 두고 드롭 내에서 결정의 생성 및 성장을 관찰하는 것입니다. 결과적으로 이 기술을 통해 결정을 얻을 수 있으며, 적절한 검출기가 장착된 x-선원을 사용하여 단백질 회절 패턴을 결정할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 예일 대학교 분자생물물리학 및 생화학과의 Yoga Motis 교수님 연구실의 Sal입니다. 오늘은 정제된 단백질의 결정화 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 바이러스 감염의 구조적 기반을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.그럼 이제 시작해서 결정을 성장시켜 보겠습니다. 선택한 거대분자의 결정화 방법을 확인하기 위해, 희소 행렬 불완전 요인 설계법(sparse matrix incomplete factorial method)의 실험 조건을 활용하도록 선정된 상용 결정화 용액을 사용하여 초기 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 이러한 조건들은 거대분자에 대해 알려져 있으며 일반적으로 성공적이었던 결정화 조건들을 바탕으로 선택됩니다.결정화 조건이 확인되면, 원래의 히트(hit) 조건 주변에서 pH와 침전제 농도를 변화시켜 좁은 범위의 스크리닝을 구성할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 스크리닝에 사용되는 결정화 조건은 침전제와 pH를 설정하기 위한 완충액으로 구성되며, 본 시연에서는 모든 스톡 솔루션을 0.22 micron 필터로 여과해야 합니다. 닭 리소좀에 대해 이전에 확인된 결정화 조건을 사용하며, 침전제로는 sodium chloride를 사용합니다. 다양한 pH의 0.1 molar sodium acetate에 다양한 농도의 sodium chloride를 녹여 1 mL 용액들을 준비함으로써 절차를 시작하십시오.다음으로

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

이 프로토콜은 1,536개의 미세분석 플레이트 준비에서 6주간의 실험 기간 종료에 이르는 고처리량 결정화 스크리닝을 자세히 설명합니다. 시료 설정, 얻은 이미징 및 사용자가 인공 지능 지원 그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 분석을 수행하여 거대분자 결정화 조건을 빠르고 효율적으로 식별하는 방법에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다.

단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

우리는 비 invasively 0.7μm의 픽셀 해상도와 3D 단층 데이터 세트를 생산하는 유럽 싱크로 트론 방사선 시설 (ESRF)에 싱크로 트론 X - 선 tomography를 사용했습니다. 볼륨 렌더링 소프트웨어를 사용하여이 histological sectioning 제작한 공예품없이 자연 상태에서 내부 구조의 재건 수 있습니다.

싱크로 트론 - X - 레이 - tomography를 사용하여 서브 마이크론 해상도로 비침습 3D - 시각화

배우세요 X-선 회절 실험을 위한 단백질 결정화 기법으로 증기 확산법과 마이크로 배치법을 사용하여 고품질 결정을 생성하는 방법을 익히세요. 이 기술은 구조 생물학 연구에 필수적입니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

더 많은 동영상 탐색