X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

이 절차의 전반적인 목표는 여기에서 X선 회절 실험을 위한 단백질 결정을 생산하는 것입니다. 결정 스크리닝을 위한 세 가지 다른 기술이 시연되며, 행잉 드롭(hanging drop) 및 시팅 드롭(sitting drop)을 포함한 증기 확산 결정화 방법과 증기 확산 결정화를 위한 마이크로 배치 결정화 방법이 설명됩니다. 우물은 침전물로 가득 차 있습니다.

그런 다음 고농도의 정제된 단백질 샘플을 침전제와 혼합합니다. 그런 다음 혼합된 방울을 침전제 용액을 포함하는 웰에 밀봉합니다. 마이크로 배치 결정화는 파라핀 오일로 우물을 채우는 것으로 시작됩니다.

그런 다음 단백질이 우물에 적재된 다음 침전제 용액이 주입됩니다. 모든 방법의 마지막 단계는 시스템이 평형을 이루도록 하고 방울 내에서 결정 모양과 성장을 따르는 것입니다. 궁극적으로 이 기술에서 결정을 얻을 수 있으며 단백질 회절 패턴은 적절한 검출기와 함께 X선 소스를 사용하여 결정할 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 예일 대학교 분자 생물 물리학 및 생화학과의 요가 모티스 교수 연구실의 Sal입니다. 오늘은 정제된 단백질의 결정화 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 바이러스 감염의 구조적 기초를 연구하기 위해 실험실에서 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하여 몇 가지 결정을 성장시켜 보겠습니다. 선택한 거대분자에 대한 결정화 방법을 식별하기 위해, 시험 조건의 희소 매트릭스 불완전 요인 방법을 활용하기 위해 선택된 상업적으로 이용 가능한 결정화 솔루션을 사용하여 초기 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 이러한 조건은 거대분자에 대해 알려지고 일반적으로 성공적인 결정화 조건을 기반으로 선택됩니다.

결정화 조건이 알려지면 좁은 스크린을 조립하여 원래 히트 주변의 pH에서 침전제 농도를 변경할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 스크린에 사용되는 결정화 조건은 침전제 공격과 pH를 설정하기 위한 버퍼로 구성되며, 이 데모를 위해 모든 원액은 0.22미크론 필터를 통해 여과되어야 합니다. 앞서 확인 된 닭 리소좀에 대한 결정화 조건은 침전제로 염화나트륨과 함께 사용되며, 다양한 phs의 0.1 몰 아세트산 나트륨에 다양한 농도의 염화나트륨 1 밀리리터 용액을 준비하여 절차를 시작합니다.

그런 다음 단백질 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하고 얼음 위에 보관합니다. 일반적인 단백질 농도는 밀리리터당 5-50밀리그램 범위이며 농도가 높을수록 일반적으로 더 나은 결과를 제공합니다. 여기에서는 pH 4.9의 0.02몰 암탉 알 리소좀의 밀리리터당 50mg 용액을 사용합니다.

18, 000 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 회전시켜 부분적으로 응집된 단백질을 제거하거나 해동 단계에서 침전시킵니다. 이러한 응집체는 결정 성장을 방해하고 추가 응집을 촉진할 수 있습니다. 원심분리 후.

UV 스펙트럼 광도계를 사용하여 280나노미터의 흡광도에서 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도는 흡광도 판독값과 단백질의 흡광 계수에서 계산할 수 있습니다. 단백질 샘플이 준비되면 트레이 맵에 따라 24개의 웰 매달려 있는 낙하 결정화 트레이에 500마이크로리터의 침전제 용액을 채웁니다.

공기가 우물로 빠져나갈 수 있도록 링을 완벽하게 닫지 않고 각 우물의 가장자리 주위에 실리콘 그리스 링을 만듭니다. 천장. 먼지를 방지하기 위해 응축 공기 스프레이 또는 전문 천으로 커버 슬라이드를 청소하면 결정화 방울의 해석이 쉬워지고 오염이 제거됩니다. 다음 단계는 동일한 부피의 단백질 샘플과 저장소 용액을 커버 슬라이드에 피펫팅하는 것입니다.

그러나, 침전제보다 더 많은 단백질을 사용하여 최적화 공정의 일부로 상이한 부피의 단백질과 침전제를 시도할 수 있으며, 이는 듀트 단백질 샘플 또는 결정 핵형성 또는 성장을 늦추는 데 바람직할 수 있습니다. 이 시연을 위해 0.02 몰 아세트산나트륨에 밀리리터당 50밀리그램의 라이소자임 2마이크로리터. pH 4가 커버 슬라이드의 중앙에 적재된 후 2마이크로리터의 결정화 용액이 주입됩니다.

단백질과 저장소 용액을 커버 슬라이드에 피펫팅할 때 피펫에서 공기를 불어낼 때 자주 발생하는 기포 형성을 피하도록 각별히 주의하십시오. 방울을 부드럽게 혼합하여 국부적으로 높은 침전제 농도로 인한 조기 단백질 침전을 방지하는 데 도움이 되며, 방울 혼합은 핀셋을 사용하는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 점성 침전제에 특히 중요합니다. 덮개 슬라이드를 부드럽게 뒤집어 그 위에 있는 그리스 링에 놓고 공기가 우물에서 빠져나갈 수 있도록 방향성으로 잘 수행합니다.

그렇지 않으면 공기가 덮개 슬라이드를 들어 올려 웰 씰을 손상시킬 수 있습니다. 트레이가 완성될 때까지 다음 우물로 이동합니다. 트레이가 설정되면 육안으로 검사하여 단백질 결정의 위양성 식별을 줄일 수 있는 먼지 입자 및 기타 오염 물질을 제거합니다.

점수 시트를 사용하여 실험을 문서화합니다. 다음으로, 일반적으로 섭씨 4도에서 실온 사이의 원하는 배양 온도로 트레이를 놓습니다. 가장 성공적인 온도는 섭씨 20도입니다.

트레이를 부드럽게 다루고 이송 또는 배양 중 흔들림, 진동 또는 온도 변화가 결정 성장을 방지하거나 결정 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 없도록 주의하십시오. 다음 날과 며칠에 한 번씩 트레이에 크리스탈이 있는지 확인하고 항상 트레이를 조심스럽게 다루십시오. 모든 결과를 문서화하고 트레이 특정 점수 시트에 형태학을 놓습니다.

결정이 나타나는 데 일반적으로 2일에서 5일이 걸리지만 결정은 거의 즉시 또는 최대 몇 달 후에 나타나는 경우가 있습니다. 결정화 조건이 확인되고 결정의 성장 속도가 알려지면 결정이 나타나고 최종 크기의 절반 이상으로 성장할 때까지 트레이를 방해하지 않는 것이 가장 좋습니다. 트레이를 방해받지 않고 그대로 두면 결정 핵 형성 이벤트의 수를 줄일 수 있으므로 커버 슬라이드가 필요하지 않은 24개의 웰 좌식 드롭 트레이를 사용한다는 점을 제외하고는 행잉 드롭과 동일한 절차를 따르는 싯 드롭 결정화를 위한 더 큰 결정의 수가 줄어듭니다.

대신, 우물에는 단백질과 침전제가 혼합 피펫인 선반이 있으며, 선반 중앙에 50밀리리터당 50밀리그램의 라이소자임 용액 2마이크로리터가 있어 기포 생성을 방지합니다. 다음으로, 트레이 설정 후 샘플에 2마이크로리터의 침전제 용액을 추가합니다. 싯 드롭으로 광학 테이프로 우물을 밀봉하십시오.

커버 슬라이드가 필요하지 않습니다. 행잉 드롭에 대해 설명된 대로 배양 및 결정 채점을 계속합니다. 마이크로 배치 절차를 수행합니다.

행잉 드롭 절차에 대해 설명된 대로 결정화 용액과 단백질을 준비합니다. 마이크로 배치 트레이에서 먼지 및 기타 큰 입자를 피하기 위해 새 마이크로 배치 트레이와 에어 스프레이를 구입하십시오. 파라핀 오일을 각 웰에 3mm 깊이로 첨가합니다.

그런 다음 여분의 기름을 제거하십시오. 그런 다음 1마이크로리터의 단백질 용액을 미리 채워진 우물에 넣고 방울이 우물 바닥으로 가라앉도록 합니다. 그런 다음 1마이크로리터의 침전제 용액을 우물에 넣습니다.

방울이 웰 바닥으로 가라앉고 단백질 방울과 융합되는지 확인하십시오. 트레이가 완성될 때까지 다음 웰로 이동하고 여기에 설명된 대로 배양 및 결정 분석을 계속합니다. 단백질 결정화의 전형적인 결과.

실험이 표시됩니다. 비정질 침전은 단백질 및/또는 침전물이 고농도일 때 발생합니다. 반대로, 불포화 상태인 방울은 일반적으로 투명하게 유지됩니다.

상 분리는 단백질 또는 세제가 고농도의 특정 침전물과 혼합될 때 다른 상으로 분리되는 경우 발생할 수 있습니다. 최적의 조건에서 단백질 결정은 애기장대 csn을 형성해야 합니다. 폴리에틸렌 글리콜 8, 000 및 마그네슘 아세테이트에서 얻은 7 개의 단백질 결정은 막대 모양으로 나타납니다.

또한 표시된 결정은 하나의 어금니에서 얻은 리소좀 단백질 결정, 염화나트륨 및 아세트산나트륨입니다.산도 4.9. 이 타임랩스 동영상은 행잉 드롭 방법을 사용할 때 리소좀 결정이 설정 후 몇 시간 이내에 큰 프리즘으로 성장한다는 것을 보여줍니다.

이 절차를 수행할 때 단백질 실험을 설정하는 방법을 보여드렸습니다. 높은 습도는 낙하 증발을 최소화하는 데 도움이 되므로 온도와 습도를 안정적으로 제어하는 환경에서 작업하는 것이 중요하며, 야외에 낙하의 노출을 최소화하는 기술을 채택하려고 합니다. 이러한 이유로 잘 조직된 작업 환경에서 운영하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.