전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

이 절차의 전반적인 목표는 전자 결정학에 의한 막 단백질의 구조화된 측정을 위한 가장 최적의 2D 결정화 조건을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 정제 중에 호환 가능한 세제를 사용하여 천연 지질 이중층의 단백질을 용해시킴으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 단백질 지질 세제 혼합물의 투석을 통해 외인성 지질을 첨가하고 세제를 제거하여 신중하게 제어된 조건에서 2D 결정을 생성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 샘플을 번쩍이고 유리체 상태로 동결하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 cryo em으로 데이터를 수집하는 것입니다. 궁극적으로, 데이터의 컴퓨터 이미지 처리를 통해 단백질의 최종 구조를 산출하는 결과를 얻을 수 있습니다.

안녕하세요, 저는 실험실에서 왔습니다. 저는 조지아 공과 대학(Georgia Institute of Technology)의 생물학 대학을 졸업했습니다. 안녕, 나는 티나가 두려워한다.

저는 조지아 공과대학(Georgia Institute of Technology)의 화학 및 생화학부의 베리 랩(Berry Lab)과 생물학부의 슈미트 크레이 랩(Schmidt Kray Lab) 출신입니다. 저는 조지아 공과대학 생물학부의 잉글보그 슈미트 크라이 실험실의 매트 존슨입니다. 오늘 우리는 em에 의한 2D 합창 시도를 평가하는 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 프로토콜을 사용하여 2D 결정화 조건을 식별하고 최적화합니다. 시작하겠습니다 이 절차를 시작하기 위해 탄소 코팅 400 메쉬 구리 투과 전자 현미경 또는 TEM 그리드에서 음성 염색 된 샘플이 준비됩니다. 탄소로 덮인 TEM 그리드 아래에서 2마이크로리터의 프로테아 리포좀 샘플을 피펫팅하고 60초 동안 배양합니다.

샘플이 고르게 분포되지 않으면 피펫 팁 측면으로 부드럽게 문지릅니다. 가장자리에서 다음 블록, 찢어진 watman Number 4 여과지 조각. 이는 프로테아 리포좀의 과도한 제거 없이 액체의 최적 제거를 보장하고 섬세한 탄소 필름을 보존하는 데 도움이 됩니다.

블로팅 직후. 30초 후에 1%소변기 아세테이트 얼룩 2마이크로리터를 바르고 그리드 가장자리를 닦아냅니다. 다시 말하지만, 샘플에 고농도의 점성 글리세롤 또는 자당이 포함되어 있는 경우, 일반적으로 10 내지 20% 범위이며, 음성 염색 전에 글리세롤 또는 자당이 없는 완충액으로 그리드를 여러 번 세척하는 것이 소변기 테이트 용액으로 적절하게 염색하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그리드가 준비되면 전자 현미경을 사용하여 저배율에서 샘플을 시각화하여 멤브레인 발생 분포 및 형태와 전반적인 그리드 품질을 평가합니다. 그런 다음 고배율을 사용하여 이미지를 얻고 이미지의 RIA 변환을 수행하여 2D 결정을 식별합니다. 전자 현미경 샘플 홀더에서 낮은 그리드를 시작하고 평균 멤브레인 분포에 대한 첫인상을 얻으려면 2000-10, 000 x의 중간 배율을 사용하십시오.

막의 분포 정도, 형태 및 크기를 실험실 노트에 기록하십시오. CCD 카메라로 대표 뷰를 녹화할 수 있습니다. 다음으로, 필요한 경우 약 400 - 800배 범위의 저배율로 샘플을 관찰하여 그리드의 개요를 확인합니다.

이를 통해 시료 농도, 불균일한 프로테아, 리포좀 분포 및 탄소 필름의 부분적 파손과 관련된 문제를 밝혀냄으로써 그리드 준비를 평가하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 낮은 배율 또는 중간 배율에서 관심 있는 그리드 영역을 식별합니다. 그런 다음 고배율을 사용하여 다른 멤브레인에서 가능한 순서를 평가합니다.

이는 2D 결정화 시험의 초기 단계에서 매우 중요합니다. 잘 정돈된 지역을 가진 유망한 protea liposomes를 확인하고 2D 결정을 검열하기 위한 최선 고배율 조정을 결정하기 위하여 나중 실험 도중 재현성을 확인하기 위하여는, 50, 000 및 60, 000 x 사이 확대로 시작한다. 2D 크리스털 치수와 유닛 셀 크기에 따라 고배율 설정이 30, 000까지 낮아지거나 80, 000까지 높아질 수 있습니다.

여기 인접 위치에서 관심 있는 이미지 영역으로, 관심 영역이 실제로 멤브레인인지 여부에 대한 불확실성이 있는 경우 약 마이너스 400나노미터 이상으로 초점을 흐리게 합니다. 샘플에서 탄소 필름 MICA 조각 또는 프로테아 리포좀으로 오인될 수 있는 기타 인공물이 있는지 검사합니다. 또한 가장자리를 관찰하여 일반적인 막 접힘과 형태를 식별하십시오.

그런 다음 CCD 카메라로 관심 영역을 검사합니다. 최적의 고배율 설정에서 CCD 이미지를 수집하면 CCD 이미지 자체의 시각적 평가로 더 작거나 대부분 소수성 막 단백질의 격자를 관찰할 수 없을 수 있습니다. 이 경우 전체 이미지가 온라인 foer transform 또는 ft에 사용됩니다.

그러나 정렬된 어레이가 작은 경우 이 FT에는 상당한 양의 노이즈가 포함되어 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 박스형 이미지 크기를 줄이고, 감소된 상자를 이미지 위로 이동하고, 라이브 FT를 수행하고, 정렬된 어레이의 최적 식별을 위해 라이브 FT의 감마 기능을 조정합니다. 감마 값이 지나치게 높으면 노이즈 기여로 인해 스폿이 가려질 수 있으며, 지나치게 낮은 값은 약한 스폿을 식별하지 못하게 합니다. 음으로 염색된 2D 결정의 해상도는 영하 400나노미터의 DFO에서 약 15옹스트롬이 될 것으로 예상합니다.

1-3개의 반점을 식별할 것으로 예상합니다. 반점의 선명도와 모자이크에 주목하십시오. 작은 18킬로달톤 막 단백질의 2D 결정은 크기가 최대 수 미크론입니다.

FTS의 흑점은 라이브 FT 박스의 날카롭고 쉽게 식별할 수 있는 움직임은 격자가 모자이크 없이 연속적임을 보여줍니다. 더 광범위한 용해성 도메인을 가진 더 큰 단백질의 격자는 T-E-M-C-C-D 이미지 수집의 작은 화면에서 식별할 수 있으며, FT는 정렬되지 않은 프로테아의 FT에서 모자이크 노이즈와 같은 특성을 포함하여 격자 품질을 더 잘 평가하는 데 필요합니다. 리포솜은 반점이 작은 단백질 2D 결정 때문인지 아니면 잡음 때문인지 확인하기 위해 약한 반점으로 오인될 수 있습니다.

라이브 피트의 상자를 이동합니다. 반점이 즉시 사라지면 잡음이 발생하지만, 작은 영역에서도 변하지 않으면 지질 결정이 뚜렷한 형태와 ft를 나타내기 때문에 결정이 존재할 가능성이 높습니다. 이러한 지질 결정은 이미지의 육안 검사와 일관된 단위 세포 크기로도 인식할 수 있습니다.

초기 시험에서 강수가 발생할 수 있습니다. 고배율 검사는 단백질 침전과 지질 응집체를 구별하는 데 사용됩니다. 지질 응집체의 경우, 재구성이 실제로 발생했을 수 있으며 다음 실험에서는 30, 000에서 50, 000 x로 재구성을 유도하는 대신 멤브레인 크기를 늘리고 질서를 생성하는 데 필요한 매개 변수의 조정만 필요합니다.

이 어두운 구조의 가장자리는 단백질이 없는 막으로 구성되어 있음을 나타냅니다. 최적의 조건에서의 침전 샘플에는 많은 비율의 2D 결정이 포함됩니다. 데이터 수집을 위해 가장 크고 가장 잘 정렬된 2D 결정이 시각적으로 선택되므로 멤브레인의 균일한 모양을 목표로 할 필요가 없습니다.

이러한 유형의 샘플은 결정화가 cryo EM 데이터 수집에 사용되어 최대 고해상도 이미지를 얻을 때 쉽게 인식됩니다. 이 절차를 수행할 때 TEM으로 작은 기억 단백질의 2D 결정을 스크리닝하는 방법만 보여드리겠습니다. 이 시점까지 이미 상당한 시간과 노력을 투자했기 때문에 유망한 결정화 조건을 간과하지 않도록 철저하게 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.