Name: 전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 막 단백질의 2차원 결정화 조건을 최적화하여 전자 결정학으로 고해상도 구조를 결정하는 방법을. 이 프로토콜은 세제 용해, 지질 재구성, 동결 전자 현미경 데이터 수집 및 계산 이미지 처리를 포함합니다.

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우리는 우리의 방법과 관련된 경험과 관찰의 일부에 기여 귀중한 단백질 샘플을 제공하는 우리의 공동 작업자를 주셔서 감사합니다. 군터 Schmalzing은 친절이 프로젝트에 참여 FR 수있는 기회를 제공했습니다. 바바라 암브러스터, 야곱 브링크 및 Deryck 밀스가 자신의 뛰어난 도움말 및 장비에 대한 입력을위한 감사합니다. 기금은 NIH 부여 HL090630에 의해 제공되었다.

1. 2D 결정화 재판의 그리드 준비 <ol><li> 탄소 코팅 400 메쉬 구리 EM 격자는 부정적인 얼룩으로 준비하고 있습니다. Uranyl 아세테이트는 자주 사용 및 지속적인 격자의 장기 저장을 위해 사용뿐만 아니라 적합성 전에 몇 달 동안 솔루션의 저장 용량 측면에서 얼룩을 제공합니다. 반면, 같은 uranyl의 편대와 같은 다른 부정 얼룩, 우수한 얼룩을 제공하면서는, 갓 1 만들었해야합니다. 2D 결정화 실험의 심사에 사용되는 격자의 다수의 빠른 준비, 부정적인 얼룩의 수정된 버전이 사용됩니다. 샘플 2 μL의 볼륨은 탄소 대상 EM 그리드에 pipetted 60 S.위한 incubated입니다 이것은 왓먼의 찢어진 조각 # 4 필터 용지 (그림 1, 비디오)와 가장자리에서 모래 바닥을 따라, 그리고 1 % uranyl 아세테이트 2 μL를 즉시 적용되고있는 다시 30 후 격자의 가장자리에서 blotted 아르 S. 필터 종이의 찢어진 가장자리와 가장자리에있는 격자를 감동하면 proteoliposomes 제거하지 않고 액체의 최적의 제거를 보장합니다. 또한, 그리드의 가장자리에 건조가 탄소 필름의 향상된 보존을 보장합니다. 섬세한 탄소 필름의 파손은 샘플 접착을 방지하고 샘플의 부정 확한 표현이 발생할 수 있으므로주의가, 준비와 격자의 취급에 촬영해야합니다. 5 μL의 전통적으로 큰 샘플 볼륨이되었고 정기적으로 그리드 준비에 사용되는 반면, 소중한 샘플 2 μL 또는 2 이하로 볼륨을 감소시켜 저장할 수 있습니다. </li><li> 가장 큰 가능한 세포막을 생산하기 위해, 우리의 샘플 중 일부는 글리세롤이나 자당 높은 농도 (10~20%)는 투석 버퍼에 존재해야합니다. 글리세롤이나 자당이 높은 점성이고 제대로 버퍼를 관통하고, 따라서 불완전 세포막을 얼룩으로부터 uranyl 아세트산을 방지로 이것은 그리드의 준비에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 가능한 격자가 드러나지 않습니다. 어느 버퍼가 글리세롤 / 자당 무료 버퍼 (표시되지 않음), 또는 격자의 샘플 및 교체의 원심 분리에 의해 교환 수가와 유사한 부정적인 얼룩 전에 몇주기 버퍼 또는 하나의 글리세롤 / 자당 무료 버퍼로 씻어 수 있습니다 cryo - EM 3,4에 사용되는 기술. </li></ol> 2. EM으로 2D 결정화 평가판을 평가 <ol><li> 샘플 홀더의 유형에 따라 하나 또는 여러 개의 격자 중 하나가로드됩니다. 중간 배율로 여기라고한다 2 - 10K의 확대는 실험실 노트북 5주의 촬영입니다 세포막, 형태, 및 크기의 분산의 평균 유통 및 범위의 첫 인상에 대한 수 있습니다. CCD 카메라는 필름에 사용할 수없는 경우 적합 영역, CCD 카메라의 도움으로 대표 개요로 기록 또는 있습니다. </li><li> 샘플 / 그리드 전체의 개요가 원하는 경우 약 400 800x의 범위에서 낮은 배율은 시간에 사용됩니다. 모든 그리드와 고용 없지만, 낮은 배율은 여러 측면 측면에서 그리드 준비의 평가에 도움이 귀중한 정보를 제공합니다 : 부정 얼룩 및 탄소 필름, 그리드에서 샘플 농도, 그리고 아마도 고르지 proteoliposome 배포판의 가능성이 일부 파손 모두. 개인 그리드 사각형은 쌍안경이나 CCD 카메라로 볼 수 있습니다. 일부 EMS과 함께 더 높은 배율에서 나중에 검사에 대한 리콜 수있는 특정 관심의 위치를​​ 저장 할 수 있습니다. </li><li> 관심 그리드 영역 중 낮은 또는 중간 배율에서 확인되었습니다되면, 배율은 약 50K - 60K로 변경됩니다. 알려진 경우 30K로 낮은 80K처럼 높은 배율은, 멤브레인, 크리스탈과 단위 셀 크기에 따라 것은 사용됩니다. 30 - 80K의 배율 범위는 2D 결정에 대한 심사의 목적은 높은 배율로 불리는 것입니다. 포커싱 이미지 / 사진 설정하거나, 관심있는 지역의 주변에 이후의 스위치와 함께, 낮은 복용량 설정의 초점 설정에서 하나 발생합니다. <ol class="lalpha"><li> 관심 분야가 실제로 막 여부에 모호함의 경우, 샘플 proteoliposomes, 운모, 또는 기타 유물의 크기 탄소 필름 검사입니다. 이러한 목적으로, 가장자리는 전형적인 접는 조직 형태를 공개. </li><li> 이제 관심의 영역은 CCD 카메라와 함께 검사합니다. CCD 이미지는 막의 크기, 단백질 또는 단위 셀 크기에 따라 30K - 80K 확대 수집하거나, 결정 영역을 알려져 있습니다. 작은 및 / 또는 대부분 소수성 막 단백질의 격자는 CCD 이미지 자체의 시각적 평가에 의해 반드시 표시되지 않습니다. 어느 전체 이미지가 온라인 푸리에 변환 (FT, 또는 빠른 FT - FFT)에 사용됩니다. 주문 배열 작은 경우이 FT는 그러나, 소음들을 상당히 포함됩니다. 따라서, 감소 박스 이미지 크기는 smal의 향상된 신호 대 잡음 비율에 대한 수ler 크리스탈 쉽게 식별. 이러한 목적으로, 상자는 이미지를 통해 이동하고 라이브 FT는 평가입니다. 빔의 강도 / 밝기는 낮은 복용량 샘플 조건뿐만 아니라, 마음에 CCD 카메라 설정을 유지 조정됩니다. 사용 CCD 카메라에 따라 살아있는 FT의 감마는 주문한 배열의 최적의 식별을 위해 조정됩니다. 지나치게 높은 값을 소음 공헌으로 인해 장소를 가리 수 있고, 지나치게 낮은 감마 값을 식별되는 약한 장소를 방지할 수 있습니다. 이러한 약한 명소 거의 소음 수준 위의 FT의 명소로 작은 결정 배열에 의한 것입니다. 높은 해상도에서 데이터가 샘플 6 소수의 수집되어 있지만, 부정적인 스테인드 차원 결정의 일반적으로 해상도가 제한되거나 약 15A 해상도보다 나은 것으로 예상해서는 안됩니다. 약 -400 NM의 defocus 아니라 함께 명소 이상의 1-3 명령은 쉽게 식별 것으로 예상된다. 샘플은 일반적으로 cryo - EM 데이터 수집이 최고 달성 해상도의 적절한 표시를 줄 것이다로서, 해상도에 대해 평가하지 않습니다. 장소 가능한 mosaicity의 선명도는하지만 설명되어 있습니다. </li></ol></li><li> 다른 세포막뿐만 아니라 멤브레인 morphologies은 높은 배율에서 주문 평가하고 있습니다. 작은보다 큰 proteoliposomes 또는 막 패치가 가장 유망한 분야를 포함할 수 있듯이, 시작 또는 2D 결정화 실험의 중간 단계에 특히 중요합니다. 2D 결정의 매우 낮은 비율은 주문한 배열의 초기 식별이 자주 크기와 품질 2,4,7의 급속한 발전으로 이어질 것입니다 때문에 이미지의 다수의 이미지 수집 및 FT, 또는 광학 회절을 필요합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 이상적으로 주문 proteoliposomes가 쉽게 알아볼, 날카로운 명소를 표시합니다. 대형 잘 명령 결정을 쉽게 CCD 이미지 또는 micrographs의 광학 회절의 온라인 FT에 의해 식별됩니다. 예를 들어 크기가 몇 미크론까지 아르 18kDa의 작은 막 단백질의 2D 수정을 보여줍니다. FT에 얼룩이 쉽게 식별하고 날카로운 있습니다. 라이브 - FT 상자의 움직임은 격자가 mosaicity없이 지속 것을 보여줍니다. 보다 광범위한 가용성 도메인과 큰 단백질의 격자는 EM의 작은 화면에서 확인할 수 있습니다. CCD 이미지 수집 및 FT 더 나은 평가 수단을 제공하고, 예를 들어, 가능한 mosaicity (쇼 FT)에 대한 정보를 얻을 필요가 있습니다. 주문되지 않은 proteoliposome의 FT을 계산할 때, 소음이 처음 장소에 대한 오해하실 수 있습니다. 라이브 FT에 대한 상자가 이동하는 동안 그러나, 반점이 사라집니다. 반면에, 작은 배열, 의심 결정화와 라이브 FT는 이미지 영역도 약간 이동하면 고정 남아있는 그들의 반점을 가지고 있습니다. 또한, 이러한 작은 결정은 일반적으로 동일한 단위 셀 크기를 가지고 인식 될 수 있으며, 다른 FTs의 명소 간의 거리는 특정 크기의 원형과 같은 다양한 방법으로 측정할 수 있습니다. 지질 결정은 별개의 격자 형태와 FT를 표시합니다. 그것은 초기 실험에서 강수량이 발생하는 일반적입니다. reconstitution없이 여기 단백질 강수량하지만 작은 지질 집계에서 구별해야합니다. 낮은 배율에서 precipitates 것으로 나타날 샘플 자주 높은 배율에서 볼 때 지질 집계로 판명. 30 - 50K에서 검사시 이러한 어두운 구조의 가장자리 그들은 단백질없이 강수량과 세포막의 구성을 밝혀. 지질 집계는 다음 실험에 큰 세포막 크기의 증가 수도 있습니다 이러한 중요한 관찰합니다. 평가 샘플에서 가난한 결과는 때로는 적절한 빠른 검사을 방지 낮은 멤브레인 농도에 연결되어 있습니다. 이것은 자주 투석에 의해 2D 결정에 대한 높은 단백질 농도를 사용하여 극복할 수 있습니다. 또는 안정이 저장되는 동안 Eppendorf 튜브의 하단에 며칠 동안 정착에 남아있을 수 있습니다. 어떤 경우에는 세포막의 신속, 또는 거의 인스턴트 정착이 발생하여 튜브 바닥에서 pipetting하면 그리드에서 높은 막 밀도가 높아집니다. 또 다른 훨씬 빠른 방법은 튜브의 바닥에서 이후의 샘플링과 샘플 원심 분리 (1~3분에 대한 3000-8000 rpm으로)입니다. 최적의 조건 하에서 샘플은 2D 결정의 큰 비율을 포함합니다. 그것은 가장 크고 가장 잘 주문한 2D 결정이 데이터에 대한 시각이 선택되어 모음으로, 점막의 균일한 모양 목표 필요가 없습니다. 결정화 실험이뿐만 아니라 샘플을 사용하는 경우 반복하는 경우 샘플을 이런 종류의 쉽게 인식됩니다고해상도 이미지의 최대 개수에 결과 cryo - EM 데이터 수집. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1.이 그림은 왓먼의 찢어진 조각 # 4 필터 종이 그리드의 가장자리를 모래 바닥 보여줍니다.

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</ol>

샘플 적절한 평가는 세포막의 충분한 숫자의 신중 평가가 필요합니다. 예를 들어, 180여 군데 proteoliposomes 밖으로 낮은 % 2로 결정 배열 샘플 2D 결정화 조건 7 빠르고 최적화에 대한 중요한 정보를했다. 단백질의 일부​​ 가끔 침전이 발생하지만, 단백질의 침전이 발생하면, 그리드는 낮은 배율에서 검사 후 추가 검사에서 버려진 수 있습니다. 100 개 미만 NM의 비록 아주 작은 점막하지만 주문에 대한 유용한 정보를 줄 수 있으며 2D 크리스탈 크기를 증가 매개 변수는 다음과 투석 실험에서 구현할 수 있습니다. 실험실 검사 8,9의 과정으로 유망 자동화의 다양한 학위를 도입하는 과정에 있습니다. 여기에 명시된 바와 같이 아직 샘플은 여전히​​ 2D 크리스탈 크기, 형태, 및 순서의 평가 및 지식의 단계가 필요합니다. 앞으로는 이러한 심사 단계 및 더욱 중요한 작은 결정...

<table><tbody><tr><td>탄소 필름이 코팅된 400-mesh 구리 TEM 그리드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포셉: 일반 및 항모세관용</td><td></td><td></td><td>Dumont #5 및 Dumont N5AC 또는 유사 제품</td></tr><tr><td>마이크로피펫 및 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman #4 여과지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D 결정 스크리닝을 위한 투석 시료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤/수크로스 제거 투석 완충액</td><td></td><td></td><td>선택 사항</td></tr><tr><td>JEOL-1400 투과 전자 현미경 (TEM)</td><td></td><td></td><td>Lab6 또는 텅스텐 필라멘트와 필름 및/또는 CCD 카메라(Gatan Orius SC1000 및/또는 UltraScan1000 CCD 카메라와 Gatan Digital Micrograph 소프트웨어 패키지 또는 Tietz 카메라(TVIPS))가 장착된 유사한 80 &amp;#8211; 120kV TEM</td></tr></tbody></table>

전자 crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

전자 crystallography 중 하나 또는 또는 구조 기능 막 단백질의 질문에,뿐만 아니라 수용성 단백질을 연구 세 가지 차원 결정화 및 X - 선 crystallography와 함께 사용할 수있는 방법으로 진화했다. 전송 전자 현미경에 의해 2 차원 (2D) 결정에 대한 심사는 (EM) 최적화, 그리고 cryo - EM하여 고해상도 데이터 수집에 대한 샘플을 선택 찾는 중요한 단계입니다. 여기 우리는 잠재적으로 결정화 조건의 최적화에 대한 중요한 정보를 제공 수, 대형 및 주문뿐만 아니라, 작은 2D 배열을 모두 식별에 근본적인 단계를 설명합니다. EM에서 서로 다른 배율과 협력함으로써, 중요한 매개 변수의 범위에있는 데이터가 얻어진다. 낮은 배율은 형태학 및 멤브레인 크기에 귀중한 자료를 제공합니다. 높은 배율에서 가능한 순서 및 2D 크리스탈 크기가 결정됩니다. 이러한 맥락에서, 그것은 CCD 카메라와 온라인 푸리에 변환이 순서와 크기 proteoliposomes을 평가하기 위해 더 높은 배율에서 사용하는 방법에 설명되어 있습니다. 막 단백질의 2D 결정이 가장 일반적으로 투석에 의해 reconstitution에 의해 성장하는 동안, 심사 기술 monolayers, 기본 차원 결정의 도움으로 제작 결정에 동일하게 적용되며, 수용성 단백질의 배열을 명령했다. 또한, 여기에서 설명한 방법 작은 단백질이 큰 단백질 우리의​​ 예제와 격자로 식별에있는 치료의 동일한 금액을 요구에도 소규모의 2D 결정뿐만 아니라 큰 멤브레인 단백질에 대한 심사에 적용되는 더 쉽게 식별할 수있을 심사의 이전 단계에서.

주문한 막 단백질 배열의 형성을위한 2 차원 (2D) 결정화 실험을 평가하는 것은 전자 crystallography에 매우 중요하고 어려운 작업입니다. 90kDa - 여기에 대한 심사와 15의 범위에서 주로 작은 막 단백질의 2D 결정을 식별하는 우리의 접근 방식을 설명합니다.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

전자 결정학은 3차원 결정화 및 X선 결정학과 대체하여 사용하거나 또는 이와 결합하여 사용할 수 있는 방법으로 발전해 왔습니다.

본 절차의 전반적인 목표는 전자 결정학을 통한 막 단백질의 구조 결정을 위해 가장 최적의 2D 결정화 조건을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 정제 과정 중 적절한 계면활성제를 사용하여 천연 지질 이중층으로부터 단백질을 가용화함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 외인성 지질을 첨가하고 단백질-지질-계면활성제 혼합물을 투석하여 계면활성제를 제거하는 것이며, 이를 통해 세밀하게 제어된 조건 하에서 2D 결정을 형성하게 됩니다.절차의 세 번째 단계는 샘플을 급속 냉동하여 유리 상태로 만드는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 cryo EM으로 데이터를 수집하는 것입니다. 최종적으로, 수집된 데이터의 계산적 이미지 처리를 통해 단백질의 최종 구조를 도출하는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 조지아 공과대학교 생물공학 대학 연구실의 Tina Dreaded입니다.저는 조지아 공과대학교 화학 및 생화학 대학의 Berry Lab과 생물학 대학의 Schmidt Kray Lab 소속입니다. 그리고 저는 조지아 공과대학교 생물학 대학의 Ingleborg Schmidt Cry 연구실 소속 Matt Johnson입니다. 오늘은 EM을 통해 2D choral ation trial을 평가하는 절차를 보여드리겠습니다.본 연구실에서는 2D 결정화 조건을 확인하고 최적화하기 위해 이 프로토콜을 사용합니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 탄소가 코팅된 400 mesh 구리 투과전자현미경(TEM) 그리드 상에 음성 염색된 시료를 준비합니다. 탄소가 코팅된 TEM 그리드 아래에 단백질 리포좀 시료 2 µL를 피펫으로 분주하고 60초 동안 배양합니다.시료가 고르게 분포되지 않은 경우, 피펫 팁의 측면으로 부드럽게 밀어줍니다. 다음으로, 찢은 Watman 4번 여과지를 사용하여 가장자리 부분을 막아줍니다. 이렇게 하면 protea 리포좀의 과도한 제거 없이 액체를 최적으로 제거할 수 있으며, 섬세한 카본 필름을 보호하는 데 도움이 됩니다.블로팅 직후에 수행합니다. 30초 후에 1% uranyl acetate 염색액 2 µL를 도포하고, 그리드 가장자리부터 블로팅합니다. 다시 한번 언급하자면, 샘플에 점성이 높은 glycerol 또는 sucrose가 통상 10~20% 범위로 고농도로 포함되어 있는 경우, 음성 염색 전에 glycerol이나 sucrose가 없는 완충액으로 그리드를 여러 차례 세척하는 것이 uranyl acetate 용액으로 적절히 염색하는 데 도움이 될 수 있습니다.그리드 준비가 완료되면, 저배율 전자현미경 관찰을 통해 막의 발생 분포와 형태 및 전반적인 그리드 품질을 평가합니다. 그다음 고배율을 사용하여 이미지를 얻고, 이미지의 RIA 변환을 수행하여 2D 결정을 식별합니다. 전자현미경 샘플 홀더에 그리드를 장착한 후, 평균 막 분포에 대한 1차적인 파악을 위해 2000에서 10,000 x의 중간 배율을 사용하십시오.막의 분포 범위, 형태 및 크기를 실험 노트에 기록하십시오. CCD 카메라를 사용하여 대표적인 시야를 촬영하십시오. 그다음, 필요한 경우 약 400에서 800배 사이의 저배율로 샘플을 관찰하여 그리드의 전체적인 모습을 확인하십시오.이는 시료 농도, 불균일한 단백질 및 리포좀 분포, 그리고 탄소 필름의 부분적 파손과 같은 문제점들을 드러냄으로써 그리드 제작 상태를 평가하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 저배율 또는 중배율에서 관심 있는 그리드 영역을 확인하십시오. 그다음 고배율을 사용하여 서로 다른 막들의 가능한 배열 상태를 평가하십시오.이는 2D 결정화 시험의 초기 단계에서 매우 중요합니다. 잘 정돈된 영역을 가진 유망한 단백질 리포좀을 식별하고, 이후 실험에서 재현성을 검증하며, 2D 결정 스크리닝을 위한 최적의 고배율 설정을 결정하기 위해 50,000에서 60,000 x 사이의 배율로 시작하십시오. 2D 결정의 크기와 단위 격자 크기에 따라 고배율 설정은 30,000까지 낮추거나 80,000까지 높일 수 있습니다.관심 영역의 인접한 위치에서, 관심 영역이 실제로 막(membrane)인지 불확실한 경우에는 약 -400 nm 또는 그 이상으로 디포커스(defocus)합니다. 시료 내에 프로테오리포좀(proteoliposomes)으로 오인될 수 있는 탄소 필름 조각, MICA 또는 기타 아티팩트가 있는지 확인하십시오. 또한 가장자리 부분을 관찰하여 전형적인 막 접힘과 형태를 식별하십시오.다음으로, CCD 카메라를 사용하여 관심 영역을 검사합니다. 최적의 고배율 설정에서 CCD 이미지를 수집할 때, 크기가 작거나 대부분 소수성인 막 단백질의 격자는 CCD 이미지 자체의 시각적 평가만으로는 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 전체 이미지를 온라인 푸리에 변환(Fourier transform) 또는 FT에 사용합니다.하지만 정렬된 배열의 크기가 작은 경우, 이 FT에는 상당한 양의 노이즈가 포함될 수 있습니다. 신호 대 잡음비를 개선하려면 박스 이미지 크기를 줄이고, 축소된 박스를 이미지 위로 이동시킨 후 라이브 FT를 수행하며, 정렬된 배열을 최적으로 식별할 수 있도록 라이브 FT의 감마 함수를 조정하십시오. 감마 값이 너무 높으면 노이즈의 영향으로 스팟이 가려질 수 있으며, 값이 너무 낮으면 약한 스팟을 식별할 수 없게 됩니다. 음성 염색된 2D 결정의 분해능은 DFO -400 nanometers에서 대략 15 angstroms가 될 것으로 예상하십시오.한 개에서 세 개의 차수를 가진 스폿들을 확인할 수 있을 것입니다. 스폿의 선명도와 모자이크 패턴의 유무를 확인하십시오. 크기가 작은 18 kilodalton 막 단백질의 2D 결정은 크기가 최대 수 µm에 달합니다.FTS의 반점들이 선명하고 라이브 FT 박스의 움직임이 쉽게 식별된다는 것은 격자가 모자이크 없이 연속적임을 보여줍니다. 더 넓은 가용성 도메인을 가진 더 큰 단백질의 격자는 T-E-M-C-C-D 이미지 수집의 작은 화면에서 식별할 수 있으며, 무질서한 단백질의 FT에서 나타나는 모자이크 노이즈와 같은 특성을 포함하여 격자 품질을 더 정확하게 평가하기 위해서는 FT가 필요합니다. 리포좀을 약한 반점으로 오인할 수 있으므로, 해당 반점이 작은 단백질 2D 결정에 의한 것인지 아니면 노이즈인지 판단해야 합니다.라이브 ft를 위해 박스를 이동시키십시오. 반점들이 즉시 사라지면 이는 노이즈이지만, 아주 작은 영역에서라도 변화 없이 유지된다면 결정이 존재할 가능성이 높습니다. 지질 결정은 뚜렷한 형태와 ft를 나타내기 때문입니다. 이러한 지질 결정은 이미지의 시각적 검사와 일관된 단위 세포 크기를 통해 확인할 수 있습니다.초기 실험에서는 침전이 발생할 수 있습니다. 고배율 검사를 통해 단백질 침전과 지질 응집체를 구분합니다. 지질 응집체의 경우, 실제로 재구성이 일어났을 수 있으며, 다음 실험에서는 재구성을 유도하기보다는 막 크기를 증가시키고 질서를 생성하는 데 필요한 매개변수만 30,000~50,000 x에서 조정하면 됩니다.이러한 어두운 구조의 가장자리를 통해 단백질이 없는 막으로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 최적의 조건에서 침전된 샘플에는 높은 비율의 2D 결정이 포함됩니다. 데이터 수집을 위해 가장 크고 질서 정연한 2D 결정을 시각적으로 선택하므로, 막이 균일한 외관을 갖추도록 할 필요는 없습니다.이러한 유형의 샘플은 결정화 상태를 쉽게 식별할 수 있어, cryo EM 데이터 수집 시 최대 수의 고해상도 이미지를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 본 절차에서는 TEM을 이용하여 소형 막 단백질의 2D 결정을 스크리닝하는 방법을 보여드리겠습니다. 이미 상당한 시간과 노력을 투자한 상태이므로, 유망한 결정화 조건을 간과하지 않도록 철저하게 확인하는 것이 중요합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용 lipidic mesophases의 막 단백질의 높은 처리량 결정에 로봇 접근 방식을 설명합니다. 방법 통합 점성과 끈적 끈적한 단백질을이고 mesophase을 처리 할 수​​있는 로봇을 소개합니다.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용하기 위해 lipidic 입방와 스폰지 단계에서 재배 수확 및 cryo-시원한 막 단백질 결정에 대한 구조 및 기능 생물학 그룹 팀장 막에서 구현 절차를 설명합니다.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

이 논문은 투석 방법과 시투X선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세유체 칩의 제조 프로토콜을 자세히 설명합니다. 미세 제조 공정을 통해 반과소성 재생셀룰로오스 투석 막을 칩의 두 층 사이에 분자량 차단과 통합할 수 있습니다.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

배우세요 막 단백질의 2차원 결정화 조건을 최적화하여 전자 결정학으로 고해상도 구조를 결정하는 방법을. 이 프로토콜은 세제 용해, 지질 재구성, 동결 전자 현미경 데이터 수집 및 계산 이미지 처리를 포함합니다.

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