Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

이 동영상은 Lipic B 세포를 사용하여 정제된 막 단백질의 고처리량 결정화 시험을 설정하는 방법을 보여줍니다. 먼저 지질과 세제를 혼합하여 B 세포를 준비하고, 정제된 멤브레인 단백질을 B 세포 혼합물에 통합하고, 나노리터 로봇 육안 검사를 사용하여 결정화 시험을 수행합니다. 표준 광학 현미경을 사용하면 결정의 존재를 확인할 수 있습니다.

일단 형성되면 단백질 결정은 데이터 수집 및 구조화된 결정을 위해 추출 및 동결될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 B cell의 고유한 상 거동으로 인해 실험실에서 사용할 수 있는 표준 장비 및 로봇 공학을 결정화에 활용할 수 있다는 것입니다. Setup B cells는 매우 간단한 기술이며 세제인 my cell에서 타겟 막 단백질을 꺼내 lipic medium에 넣을 수 있습니다.

이렇게 하면 완전히 새로운 조건 집합을 선별할 수 있습니다. 이 방법은 많은 막 단백질에 성공적으로 사용된 매우 간단한 방법이므로 시도하지 않을 이유가 없습니다. B 세포 기반 결정화의 첫 번째 단계는 B 세포 형성 지질 양서류 혼합물을 제조하는 것입니다.

이 프로세스에는 상당한 노력이 필요하며 가장 많은 시간이 소요됩니다. 완료하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. B cell은 다양한 지질 양서류 조합과 광범위한 농도로 형성될 수 있습니다.

제안된 시작점은 함께 제공되는 서면 프로토콜의 표 1을 참조하십시오: 2.8:1 몰비로 1밀리리터의 35%DMPC 캡소 혼합물을 준비하는 것으로 시작합니다. 이렇게하려면 튜브에 0.26g의 DMPC와 0.09g의 Chapo의 무게를 측정하십시오. 부피를 최대 1.0 밀리리터로 가져 와서 탈 이온수 와류 혼합물을 사용합니다.

다음으로, 혼합물이 젤처럼 될 때까지 수조에서 약 섭씨 40도까지 가열합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 샘플은 다시 유동적이 되어야 합니다.

그런 다음 몇 분 동안 다시 소용돌이치고 지질이 완전히 용해 될 때까지 온난화, 냉각 및 와류 단계를 계속 순환합니다. 더 많은 사이클이 수행됨에 따라 혼합물이 완료 시 냉각 시 흐려질 수 있습니다. 혼합물은 실온 이상에서 투명한 겔이며 세포에 의한 얼음 위의 점성 액체는 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에 놓을 수 있습니다.

다음으로 정제된 단백질은 B 세포 배지에 통합됩니다. 이것은 간단한 공정이며 결정화와 같은 날에 수행해야 하며, 이는 비디오의 다음 섹션에 나와 있습니다. 상이 투명한 겔로 변할 때까지 DMPC capso B 세포 혼합물을 실온에서 해동합니다.

혼합물을 얼음 위에 올려 액화시킨 다음 잠시 와류를 일으켜 균질한 B 세포상을 다시 만듭니다. 이 시점부터는 B 세포 혼합물과 정제된 단백질을 얼음에 보관하십시오. 이렇게 하면 B cell이 액체 상태로 유지되어 피펫팅이 가능합니다.

다음으로, B 세포 혼합물을 정제 된 세제 가용화 단백질에 1 대 4, 부피 대 부피의 비율로 첨가한다. 그런 다음 용액이 투명하고 균질해질 때까지 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 거품이 나타나면 탁상용 원심 분리기에서 잠시 회전시킵니다.

혼합물을 얼음 위에서 최소 30분 동안 배양하여 단백질이 세포에 완전히 통합되도록 촉진합니다. 세포 혼합물에 의한 단백질은 이제 결정화 시험을 할 준비가 되었습니다. 결정화 시험은 모기 결정화 로봇을 사용하여 시연됩니다.

96웰 V 바닥판을 얼음 위에 올려 놓으면 시원해집니다. 용액의 점도가 최소화되도록 세포 혼합물에 의한 단백질을 플레이트에 피펫팅합니다. 마지막 단계까지 얼음 위에 세포 혼합물에 의한 단백질을 보관하십시오.

여기에 사용된 로봇에는 5개의 플랫폼이 있습니다. 저장소를 포함하는 마이크로플레이트를 플랫폼 3에 놓고 방울이 분배될 결정화 뚜껑을 플랫폼 5에 놓습니다. 그런 다음 세포판을 통해 단백질을 분주 위치에 가장 가까운 플랫폼 4에 놓습니다.

이는 세포 혼합물에 의한 단백질이 로봇에 의해 마지막으로 픽업되고 즉시 방출된다는 것을 보장합니다. 소프트웨어를 사용하여 실행을 시작하면 로봇은 저장 용액과 세포 혼합물에 의한 단백질을 집어 뚜껑에 방울로 분배하여 분배 중 가열 및 점도 증가를 방지합니다. 실행이 완료되자마자 세포 혼합물에 의해 저장소와 단백질을 혼합하도록 모기를 프로그래밍하지 마십시오.

기기에서 구매 세포 단백질 플레이트를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 기기에서 뚜껑을 제거하고 방울이 뒤집어지도록 저장 용액이 들어 있는 플레이트에 놓습니다. 접시를 섭씨 20도에서 배양합니다.

결정 형성 및 최적화를 위해 다른 온도도 테스트할 수 있습니다. 더 높은 온도는 층상(lamellar phase)을 유도하는데, 이는 단백질을 층으로 미리 조직하거나 조직하는 이점이 있습니다. 섭씨 4도에서 20도 사이의 온도를 검사할 수 있습니다.

섭씨 4도 미만의 온도에서는 첫째 날, 셋째 날, 그리고 그 이후에는 매주 지질이 장기간에 걸쳐 침전될 수 있으며, 표준 광학 현미경을 사용하여 결정 모양과 성장을 평가합니다. 여기에 표시된 것은 명시야 이미지와 폭행 전용 조건에서 관찰된 바늘 모양의 결정의 UV 이미지입니다. 이 이미지에서 거짓 양성을 나타내는 결정에서 형광이 감지되지 않았습니다.

메틸 프로판 디올이 침전제로 사용되었을 때 형성된 막대 모양의 결정. crystal fluoresce weekly는 단백질 결정일 수 있음을 나타내지만 X선 회절을 사용하여 non-pro tenacious인 것으로 밝혀졌습니다. 여기에 보이는 것은 시험을 설정한 후 약 4주 후에 관찰된 결정입니다.

자외선 아래에서 강한 형광은 그것이 단백질 결정임을 확인합니다. 이 비디오에서 보셨듯이. B 세포를 사용할 수 있게 되면 정제된 단백질과 직접 혼합할 수 있으며 이 시점부터 결정화는 표준 세제 기반 프로토콜과 거의 동일하게 진행됩니다.

또 다른 뚜렷한 이점은 최적화 목적으로 B 세포를 특정 지질로 도핑할 수 있다는 것입니다. 이 기술에는 정말 많은 다양성이 있으며 사용이 매우 간단하여 모든 막 단백질 결정화 프로젝트에 시도해야 합니다.