재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 고정된 미끼 분자와의 단백질 상호 작용을 발견하는 것입니다. 이것은 먼저 미끼를 획득하고 고정함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 결합을 촉진하는 조건에서 미끼에 스크리닝할 파지 라이브러리를 도입하는 것입니다.

다음으로, 결합되지 않은 파지는 엄격한 세척으로 제거됩니다. 결합된 파지는 회수되기 전에 박테리아를 감염시키는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 친화성 선택의 다음 반복을 위해 결합된 파지를 증폭하는 것입니다.

궁극적으로, 파지 역가 안정기가 형성될 때, 단일 플라크를 선택하고 염기서열을 분석하여 실험 결합 조건에서 고정된 지연에 대해 어떤 단백질이 가장 높은 친화력을 갖는지 보여줍니다. 이 프로세스는 단백질 단백질 상호 작용의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제된 재조합 단백질을 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 배치하는 것으로 시작됩니다.

다음 단계는 250 밀리리터 삼각 플라스크에 암피실린 100 마이크로그램을 50 밀리리터의 루리아 부라니 배지에 접종하고, 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 이전에 성장한 단일 콜로니를 주입하고, 수평 쉐이커에서 섭씨 37도, 200 RPM에서 배양하고, 분광 광도계를 사용하여 600 나노미터에서 0.5 내지 0.6의 광학 밀도가 얻어질 때까지 세포 밀도를 모니터링한다. 그런 다음 세포를 50ml Falcon 튜브 또는 이와 유사한 용액에 붓고 사용 세포가 일반적으로 첫날에 약 1주일 동안 생존할 수 있을 때까지 섭씨 4도를 유지합니다. 둘째 날 아침에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 친화도 선택을 준비합니다.

인큐베이팅 셰이커의 클램프에 9개의 오토클레이브를 비우고 250밀리리터의 삼각 플라스크를 배치하고 전날 밤에 시작된 파지에 감염된 BLT 5 4 0 3 세포의 하룻밤 배양 중 하나에서 500마이크로리터의 랄 부라니를 접종하고 플라스크를 인큐베이터에 넣은 후 분광 광도계를 켜고 600나노미터에서 흡광도를 읽도록 설정합니다. 한편, 섭씨 4도에서 마이크로타이터 플레이트를 제거하고 플라스틱 필름을 제거합니다. 1개의 X tris 완충 식염수 또는 TBS pH 7.5의 웰당 200마이크로리터로 10회 세척하고 세척 사이에 종이 타월로 플레이트를 거꾸로 두드려 플레이트에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

TBS에서 웰당 200마이크로리터의 5% 차단 시약으로 1시간 동안 차단합니다. 접시를 비닐 랩으로 감싼 상태에서 200마이크로리터의 X-T-B-S-T로 4겹의 종이에 접시를 거꾸로 두드려 차단 용액을 10번 씻어냅니다. 세탁 사이에 수건.

여기에서 필터 배리어 팁을 사용하여 파지 교차 오염을 방지합니다. 피펫 100 마이크로 리터의 파지 라이브러리는 단백질과 함께 있습니다. 플라스틱 랩으로 플레이트를 다시 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간이 지나면 플레이트에서 플라스틱 랩을 제거하고 즉시 파지를 생물학적 유해 폐기물에 넣어 흔들어 씻습니다. 그런 다음 멀티 피펫터를 사용하여 각각에 하나의 X-T-B-S-T 200마이크로리터를 빠르게 추가합니다. 타이머를 1분으로 설정하세요.

1분 후 완충액을 생물학적 유해 폐기물에 넣고 종이 타월로 접시를 거꾸로 두드린 다음 벤치에 다시 놓습니다. 10번째 세탁 후 10회 세탁 단계를 반복합니다. 섭씨 4도의 50밀리리터 팔콘 튜브에서 200마이크로리터의 BLT 5 4 0 3 셀을 취하여 마지막 세척이 제거된 9개의 웰 각각의 바닥으로 옮깁니다.

접시를 비닐 랩으로 싸서 섭씨 37도에서 20분 동안 두면 20분 후에 박테리아를 감염시킬 수 있는 미끼에 파지가 여전히 달라붙습니다. 접시의 포장을 풉니다. 다음으로, 섭씨 25도의 BSA에서 10마이크로리터의 박테리아를 복제 웰 1웰로 제거하고 990마이크로리터의 중간 크기로 표시된 웰로 옮깁니다.

해당 웰에 대해 이 프로세스를 두 번 더 반복하여 해당 웰에서 파지의 1에서 100 dilu까지 3 트리플리케이션을 생성하며, 이것이 BSA 복제이며, 이는 세 번 샘플링됩니다. 이러한 희석은 평균 역가에 BSA 복제에 대한 평균의 표준 오차를 더하거나 뺀 값을 추정하는 데 사용되며, 독이 있는 미끼 단백질의 복제된 웰 3개에 대한 BSA의 복제 2 및 3에 대해 동일한 작업을 수행하고, 미끼 단백질에 대해 이 27개의 EOR 튜브를 따로 설정합니다. 플라스크의 박테리아가 광학 밀도가 0.6-1.0 인 경우 고사리 플라스크에서 9 250 밀리리터 삼각 플라스크로 50 밀리리터를 데칸트합니다.

BSA 복제 웰에 있는 나머지 170마이크로리터의 파지에 감염된 BLT 5 4 0 3 박테리아를 취하여 BSA rep로 표시된 50ml의 세포에 추가합니다. 1. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 플라스크를 흔들기 전에 9개의 웰 모두에 대해 이 작업을 수행합니다. 한편, Einor 튜브 1의 박테리아와 함께 LB 100마이크로리터를 취하여 einor 튜브의 LB 900마이크로리터에 추가하여 초기 27개의 희석액에서 희석을 수행합니다.

10에서 마이너스 3 희석의 경우 4, einor 튜브 4에서 박테리아가 포함된 LB 100마이크로리터를 얻고 eph 튜브의 LB 900마이크로리터에 추가하기 전에 필터 배리어 팁을 새 것으로 버리십시오. 10에서 마이너스 4 번째 희석에 대해 7, 모든 단백질 및 치료의 모든 복제의 모든 삼중자에 대해 희석을 계속합니다. 세포가 누워 있으면 총 135개의 튜브가 있어야 합니다.

5 몰 염화나트륨 스톡에서 5 밀리리터를 첨가하고 샘플을 섭씨 4도에서 10 분 동안 8, 000 번 G로 표시된 원심 분리기로 옮겨 0.5 몰 염화나트륨으로 배양하십시오. 그런 다음 바이러스가 들어있는 상등액을 깨끗하고 멸균 된 50 밀리리터 매 튜브에 넣으십시오. Falcon 튜브의 디캔트 상등액에 클로로포름 몇 방울을 추가합니다.

상등액은 3일째 친화도 선택의 다음 라운드를 위해 섭씨 4도에서 250마이크로리터의 VLT 5 4 0 3 셀을 미리 준비된 번호가 매겨진 규산붕산 시험관 각각에 피펫으로 보관할 수 있습니다. 그런 다음 100 마이크로 리터를 einor 튜브의 희석에서 1 개의 버 실리케이트 시험관에있는 250 마이크로 리터의 세포로 피펫합니다. 1. 피펫의 처음 5인치를 화염 위로 짧게 가열하고 용융된 상단 아로스에 넣습니다.

3ml를 위로 당겨 세포와 파지 위에 있는 시험관으로 빠르게 전달합니다. 다른 손으로 튜브를 잡고 손가락으로 가볍게 쳐서 섞은 후 내용물을 접시에 붓습니다. 플레이트를 기울이고 테스트 튜브를 사용하여 플레이트 전체가 상단 아그로로 덮일 때까지 기포와 건조한 부분을 추적합니다.

식히기 위해 벤치에 똑바로 세워 두십시오. 보로스 실리케이트 튜브를 폐기하십시오. 필터 배리어 팁을 꺼내고 새 것을 가져와 모든 희석액이 도금될 때까지 계속합니다.

인큐베이터에서 준비된 플레이트가 고갈되면 회수하되 한 번에 6개 이하로 가져오거나 냉각되고 상단 아그로스가 너무 빨리 응고되면 플레이트에 형성된 플라크를 검사하고 융합 용해가 있는 플레이트를 폐기합니다. 나머지 연속 희석액 중 어느 것이 정확한 Cali를 가능하게 할 만큼 충분히 적은 플라크를 생성했는지 확인하고, 이러한 플레이트의 플라크 수를 기록하고, 친화성 선택의 끝에 있는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 역가를 계산합니다. 4라운드에서는 멸균 노란색 피펫 팁을 사용하여 18개의 잘 정의된 플라크 콜로니를 선택합니다.

einor 튜브에 pH 8.5의 트리스 하이드로 클로라이드 팁 내부를 적십니다. 그런 다음 잘 격리된 플라크를 통해 팁을 아래의 플라스틱 페트리 접시에 직접 밀어 넣고 코어를 흡인하여 적정 플레이트에서 이러한 플라크를 코어로 만들고 코어를 와류로 만들기 전에 적절한 튜브에서 pH 8.5의 트리스 하이드로클로라이드 100마이크로리터로 배출합니다. 간단히 말해서, 이 부피에서 20마이크로리터를 섭씨 65도에서 10분 동안 가열하고 PCR 및 염기서열분석을 진행하며, 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 최종 추정 수치는 피펫팅 오류에 취약하지 않으며 실제 역가 및 이에 대한 변동에 대한 보다 정확한 추정

친화력 선택 라운드의 수가 증가함에 따라 비독 미끼에 대해 우선적으로 파지 역가를 증가시키는 추정치가 잘 얻어집니다. 또한 이 기법이 효과가 있다는 확신을 줍니다. 친화성 선택의 수가 증가함에 따라 무독성 미끼 웰에 삽입물을 포함하는 파지의 증가 비율이 유지되는 것은 친화성 선택의 고급 라운드 후에도 길조입니다.

첫 번째 라운드에 비해 insert가 있는 독립적으로 회수된 파지의 수가 증가하고 이러한 amplicon이 몇 개의 동일한 크기의 band에 정착하는 것은 특정 클론이 이 절차에 따른 친화성 선택에서 선택되고 있음을 나타내는 좋은 표시입니다. ease two hybrid와 같은 다른 방법은 파지 디스플레이에서 발견된 상호 작용을 검증하기 위해 수행할 수 있습니다.