재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 고정화된 베이트 분자와의 단백질 상호작용을 발견하는 것입니다. 이는 먼저 베이트를 획득하고 고정화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 결합을 촉진하는 조건 하에서 스크리닝할 파지 라이브러리를 베이트에 도입하는 것입니다.

다음으로, 엄격한 세척 과정을 통해 결합되지 않은 파지를 제거합니다. 결합된 파지는 회수 전 박테리아를 감염시키는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 다음 단계의 친화성 선택을 위해 결합된 파지를 증폭시키는 것입니다.

최종적으로, 파지 역가가 정체기에 도달하면 단일 플라크를 선택하고 시퀀싱하여 실험적 결합 조건 하에서 고정된 lagging에 대해 어떤 단백질이 가장 높은 친화력을 갖는지 확인합니다. 이 과정은 단백질-단백질 상호작용의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제된 재조합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 바닥에 배치하는 것으로 시작합니다.

다음 단계는 250 mL 삼각 플라스크에 담긴 100 µg/mL ampicillin 함유 Luria burani 배지 50 mL에, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 배양한 단일 콜로니를 접종하는 것입니다. 이를 수평 진탕배양기에서 37 °C, 200 RPM으로 배양하며, 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 모니터링하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.5에서 0.6이 될 때까지 배양합니다. 그 후 세포를 50 mL Falcon 튜브 또는 이와 유사한 용기에 옮겨 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다. 세포는 보통 약 일주일 동안 생존 능력을 유지합니다. 1일 차에 준비를 마치고, 2일 차 아침에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 친화성 선택(affinity selection)을 준비합니다.

멸균된 빈 250 milliliter 삼각 플라스크 9개를 인큐베이팅 셰이커의 클램프에 배치합니다. 500 milliliters의 lal burani에 전날 밤 시작한 파지 감염 BLT 5 4 0 3 세포 overnight 배양액 중 하나에서 500 microliters를 취해 접종합니다. 플라스크를 인큐베이터에 넣은 후, 분광광도계를 켜고 600 nanometers에서 흡광도를 측정하도록 설정합니다. 그동안 4 °C에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼내 플라스틱 필름을 제거합니다. 웰당 200 microliters의 1 X tris buffered saline 또는 TBS pH 7.5로 10회 세척하고, 세척 단계 사이에 플레이트를 종이 타월 위에 뒤집어 가볍게 두드려 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

웰당 200 µL의 5% TBS blocking reagent로 1시간 동안 블로킹합니다. 플레이트를 플라스틱 랩으로 감싼 상태에서, 200 µL의 1X TBST로 블로킹 용액을 10회 세척하며, 이때 플레이트를 네 겹의 종이 타월 위에 뒤집어 가볍게 쳐서 용액을 제거합니다.

여기서부터는 파지 교차 오염을 방지하기 위해 필터 팁을 사용하십시오. 파지 라이브러리 100 µL를 단백질이 포함된 웰에 피펫팅합니다. 플레이트를 플라스틱 랩으로 다시 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간이 지나면 플레이트에서 플라스틱 랩을 제거하고, 즉시 파지를 바이오해저드 폐기물 통에 털어내어 세척합니다. 그다음 멀티 피펫을 사용하여 각 웰에 1X TBST 200 µL를 빠르게 추가합니다. 타이머를 1분으로 설정하십시오.

1분 후, 버퍼를 바이오하자드 폐기물 용기에 털어내고, 플레이트를 종이 타월 위에 엎어 가볍게 두드린 다음 벤치 위에 다시 놓습니다. 세척 단계를 10회 반복합니다. 10번째 세척 후, 4°C의 50 mL 팰컨 튜브에서 BLT 5 4 0 3 세포 200 µL를 취하여 마지막 세척액을 제거한 9개 웰의 바닥에 각각 옮깁니다.

플레이트를 플라스틱 랩으로 감싸고 37 °C에서 20분 동안 배양하여, 베이트에 여전히 부착되어 있는 파지가 20분 후에 박테리아를 감염시키도록 합니다. 플레이트의 랩을 제거합니다. 다음으로, 25 °C의 BSA 복제 1번 웰에서 박테리아 10 µL를 취해 1번으로 표시된 990 µL의 배지가 담긴 튜브로 옮깁니다.

해당 웰에 대해 이 과정을 두 번 더 반복하여, 해당 웰에서 유래한 파지의 1 대 100 희석액을 세 번의 반복 측정값으로 준비합니다. 이것이 세 번 샘플링된 BSA 복제 1단계입니다. 이 희석액들은 해당 BSA 복제 단계에 대한 평균 역가와 표준 오차를 추정하는 데 사용됩니다. BSA의 복제 2단계와 3단계에 대해서도 동일하게 수행하며, 독성 미끼 단백질의 복제된 3개 웰과 미끼 단백질 세트에 대해서도 동일하게 수행하여 총 27개의 EOR 튜브를 따로 둡니다. 플라스크 내 박테리아의 광학 밀도가 0.6에서 1.0 사이이면, 삼각 플라스크에서 세포 50 milliliters를 각각의 250 milliliter 삼각 플라스크 9개에 분주합니다.

BSA replication one 웰에 남아 있는 170 µL의 파지 감염 BLT 5 4 0 3 박테리아를 취하여 BSA rep.One으로 표시된 50 mL 세포 용액에 첨가합니다. 37 °C 인큐베이터에서 플라스크를 흔들어 섞기 전에 나머지 9개 웰에 대해서도 동일하게 수행합니다. 그동안, einor 튜브 1에서 박테리아가 포함된 LB 100 µL를 취해 einor 튜브의 LB 900 µL에 첨가함으로써 초기 27배 희석으로부터 추가 희석을 수행합니다.

10⁻³ 희석을 위한 네 번째 튜브의 경우, 필터 팁을 새 것으로 교체한 후 튜브 4에서 박테리아가 포함된 LB 100 µL를 취해 튜브 7의 LB 900 µL에 첨가합니다. 10⁻⁴ 희석을 위해, 모든 단백질 및 처리군에 대해 모든 반복 실험의 모든 삼중 측정치에 대해 희석 과정을 계속 진행합니다. 세포 용해가 완료되면 총 135개의 튜브가 준비되어야 합니다.

5 M 염화나트륨 스톡 용액 5 mL를 첨가하여 배양액의 농도를 0.5 M 염화나트륨으로 맞춘 후, 샘플을 라벨이 부착된 원심분리 병으로 옮겨 4 °C에서 8,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그 다음 바이러스가 포함된 상층액을 깨끗하고 멸균된 50 mL 팔콘 튜브에 데칸테이션하여 옮깁니다. 팔콘 튜브에 옮겨진 상층액에 클로로포름을 몇 방울 첨가합니다.

상층액은 3일 차에 진행될 다음 단계의 친화성 선택을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다. 4°C에 보관된 VLT 5 4 0 3 세포 250 µL를 이전에 준비한 번호가 매겨진 붕규산 유리 시험관 각각에 피펫으로 분주하십시오. 그런 다음, 1번 에플론 튜브(einor tube)의 희석액 100 µL를 1번 붕규산 유리 시험관에 들어 있는 세포 250 µL에 피펫으로 분주하십시오. 피펫의 끝부분 5인치를 화염 위에서 짧게 가열한 다음, 녹은 top aros에 담그십시오.

3 mL를 취해 세포와 파지가 들어 있는 시험관 상단에 빠르게 넣습니다. 한 손으로 시험관을 잡고 다른 손가락으로 튕겨 섞은 다음, 내용을 플레이트에 붓습니다. 플레이트를 기울이고 시험관을 사용하여 기포와 마른 부분을 밀어내며 전체 플레이트가 상층 아가로 덮이도록 합니다.

벤치 위에 수직으로 세워 둔 채로 식힙니다. 붕규산 유리관은 폐기하십시오. 필터 배리어 팁을 제거하고 새 팁으로 교체한 뒤, 모든 희석액의 도말이 완료될 때까지 이 과정을 반복합니다.

준비된 플레이트가 소진되는 대로 인큐베이터에서 꺼내되, 한 번에 6개까지만 꺼내십시오. 그렇지 않으면 플레이트가 식어 상단 agarose가 너무 빠르게 응고됩니다. 플레이트에 형성된 플라크를 확인하고, 전면 용해(confluent lysis)가 일어난 플레이트는 폐기하십시오. 남은 연속 희석액 중 정확한 계산이 가능할 정도로 플라크 수가 충분히 적게 형성된 플레이트를 결정하십시오. 이 플레이트들의 플라크 수를 기록하고, 어피니티 선택(affinity selection) 끝부분의 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 타이터(titer)를 계산하십시오. 멸균된 노란색 피펫 팁을 사용하여 명확하게 구분된 개별 플라크 콜로니 18개를 선택하십시오.

에이노르 튜브(einor tube)에 담긴 pH 8.5 tris hydrochloride로 팁 내부를 적십니다. 그런 다음, 잘 분리된 플라크를 통해 팁을 아래쪽 플라스틱 페트리 접시까지 밀어 넣어 플라크의 코어를 채취한 후 흡입하여, 해당 튜브에 있는 100 µL의 pH 8.5 tris hydrochloride에 코어를 배출하고 볼텍싱합니다. 이 부피에서 20 µL를 취해 65 °C에서 10분 동안 짧게 가열한 후, 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR 및 시퀀싱을 진행합니다. 여러 번 샘플링하여 얻은 전형적인 타이터(titer) 결과이며, 최종 추정 합계는 피펫팅 오차의 영향을 덜 받으므로 실제 타이터 및 그 주변의 변동성을 더 정확하게 추정할 수 있습니다.

친화성 선택 라운드 수가 증가함에 따라, 독성 물질이 없는 베이트(non poisoned bait)에 대해 파지 역가(phage titer)가 우선적으로 증가하는 웰 간 추정치가 얻어집니다. 이는 또한 해당 기술이 제대로 작동하고 있다는 신뢰를 제공합니다. 친화성 선택 횟수가 늘어남에 따라 독성 물질이 없는 베이트 웰에서 인서트를 포함한 파지의 유지 비율이 계속해서 증가하는 것은 고급 친화성 선택 라운드 이후에도 매우 고무적인 결과입니다.

첫 번째 라운드와 비교하여 삽입물을 가진 독립적으로 회수된 파지의 수가 증가하고, 이러한 증폭산물들이 몇 개의 동일한 크기 밴드로 수렴되는 것은 이 친화성 선택 절차를 통해 특정 클론들이 선택되고 있음을 나타내는 좋은 지표입니다. 파지 디스플레이를 통해 발견된 상호작용을 검증하기 위해 Yeast two-hybrid와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.