Name: 재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 학습하세요 파지 디스플레이 기술을 사용하여 고정화된 미끼 분자와의 단백질 상호작용을 발견하는 방법을. 이 프로토콜은 효율적인 친화성 선택과 상호작용 단백질 식별에 활용됩니다.

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해치, McIntire - 스테니스 (AD421 CRIS), USDA 씨 그랜트 (2011-04375), 및 ABD에 선생님 프레드릭 맥 매스터 연구 활동,이 프로젝트는 부분적으로 NSF IOS (0849230)에 의해 투자되었다.

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

세 복제 웰 실험을 실행하여, 미끼에 결합하는 동일한 단백질의 독립적 취득한 파지들은 동일한 클론 획득 된 CDS 영역의 뉴클레오티드 서열 (즉, 명 차이지만 이러한되었을 경우에도 구별 될 수있다 ) 독립 우물에서 검색. 그렇지 않으면, 미끼에 결합하는 단백질을 코딩 동일한 파지를 구별하기위한 유일한 방법은 그들이 독립적 뉴클레오티드 서열의 일부가 다를 전사 영역을 반대로하는 경우. 친화력 선별 된 파지를 증폭에 사용하기 위해 박테리아를 모두 성장하는 일 FERNBACH 플라스크의 사용은 9 삼각 플라스크를 모니터링하는 것보다 궁합 선택 뒤에 감염에 이르는 세균 성장​​의 덜 바쁜 모니터링을 허용한다. 데워진 삼각 플라스크에, 직전에 감염이 세균을 이동시키고 또한 인해 알테에 서브 라이브러리 역가 불일치를 제거때문에 특정 플라스크별로 세균의 성장에 감염의 다중성에 식량. 따라서, 라운드로 라운드에서 파지 역가의 변화는 우물에 유지 파지의 수와 복제 된 우물 사...

왜 대신에 다른 분자와 단백질의 상호 작용을 발견하고 조사에 사용할 수있는 수많은 다른 기술의 파지 디스플레이와 궁합 선택을 사용할 수 있습니까? 파지 디스플레이는 다음과 같은 단백질 - 리간드 상호 작용 1-3을 검출하는 다른 방법을 통해 몇 가지 독특한 장점을 청구 할 수 있습니다 : 미끼 분자의 매우 넓은 레퍼토리 가장 중요한 이유는 친화력 선택 4 미끼 역할을 할 수있는 분자의 다양성에있다. 파지 디스플레이는 고분자 / 분자가 복구 지원에 부착 할 수있는 경우 기본적으로, 그것은 파지 표시 단백질과 선호도에 대한 검사를 할 수있는 다른 단백질, 핵산, 탄수화물 등 5과 상호 작용하는 단백질 조각을 분리하는 매우 강력한 수단이다. 조건은 연구에 사용하는 경우 또한, 미끼 분자는 6 고정 때 생물학적 활성을 유지하는지 확인하기 위해 액세스 할 수 있습니다활동을 제거 / 끌어 내다 전에 친 화성 선택에 미끼로 번역 후 변형을 소개하고, 6 효과 또는이다. 외부 요인에 파지 저항 파지 디스플레이를 사용하는 두 번째 이유는, 그것이 어떤 미끼가 상호 작용하는 단백질을 캡처하는 환경 스트레스 (열, 높은 osmolyte 농도, 특정 보조 인자, 등.)을 요구할 수 있다는 가능하다는 것을, 또는 파지 디스플레이 단백질 든 변경해야 할 수도 친화력 선택하기 전에. 연구되고있는 요인은 먹이와 단백질 아니라 그것이 시험 유기체에 치명적인 경우 상호 작용이 발생할 수있게하거나 상태 사이의 상호 작용이다. 그것은 (T7 생존을위한 출판 열 최대 ~ 60 ° C 7입니다 예) 그대로 실행 가능한 두 가혹한 실험 조건을 견딜 수 있기 때문에 T7 파지는 이러한 연구에 특히 적합합니다. 바꾸는 파지의 예는 프로 표시로수리 효소의 단백질 기질의 애기 장대 종자 프로테옴을 검사 할 때 teins는 단백질 Isoaspartyl 메틸 Transferease (PIMT)는이 연구에 사용 된 바이러스는 도입을 장려하기 위해, 이전에 각 친화력 선택에 라운드, 일주일 동안 &quot;세&quot;있었다 isoaspartate의 (isoAsp는) 인식 및 수리 / 등의 이상을 대사 할 수 유기체에서 할 수없는 민감한 단백질 6 잔류 물. 대사 적 불활성 또한, 파지는 일반적으로 신진 대사 독과, 적어도, 대사 활성 시험 생물에다면 발현 성 효과가 발생할 것 작은 분자 간섭에 저항. 엄격 세척 후, 독은 독성이 세균 또는 후속 파아지 복제 무해한 범위로 희석되도록 박테리아의 대량 감염이 도입되기 전에 제거된다. PIMT 수리 단백질 표적을 조사하는 동안효소, S-아데노 메티오닌 (AdoMet)는 효소를 불 활성화하고 유용한 음성 대조군이있는 보안 제공하기 위해 S-아데노 호모시스테인 (AdoH​​cy)에 의존하면서 표적 단백질 캡처를 허용하도록 마이크로 타이 터 플레이트 잘 고정화 효소를 활성화하는 데 사용되었다 바이러스에 악영향 AdoMet 또는 AdoHcy 6도에 의해 영향을받을 수없는 것이 지식. 또한이 실험실에서 조사 특정 늦은 배아 풍부한 (LEA) 단백질 가족의 일원은, 시점에 콩 씨앗에서 200 밀리미터의 높은 농도를 달성 할 수 자당 8 등의 첨가제의 존재에 자신의 형상을 변경하는 것으로 알려져있다 생리적 성숙 9. 바이러스는 자율적으로 실행 가능한 시험 생물 (10)의 경우에는 해당되지 않습니다 특정 LEA-클라이언트 단백질 상호 작용에 대한 가능성에 필요한 각각의 친화력 선택 라운드, 200 MM의 자당의 첨가에 의해 영향을받을 것으로 예상되지 않습니다. 이 연구소는 discoverin에 초점을 맞추고있다G 단백질 - 단백질 탈수 (11) 또는 씨가 6 흡수 된 후에 isoAsp 형성에 취약 저장 프로테옴의 구성 요소를 복구하는 동안 저장 프로테옴 보호의 메커니즘을 기초 성숙, 탈수 또는 발아 씨앗의 상호 작용. 따라서, 생산 및 정제 활성 상태에 미끼로 필요한 재조합 단백질, 그들이 고정화 전후에 자주 어려운, 우리의 작업에 기초하지만 그들은, 그래서 남아 보장한다. 각각의 재조합 단백질 생산 시나리오가 다르기 그러나, 재조합 단백질 생산을위한 최적화 조건은 여기서 언급되지 않을 것이다. 사용자는 (이 효소 경우 마이크로 플레이트의 우물에서 효소 분석을, 예를 들면) 고정 된 단백질이 여전히 작동하는지 확인하기 위해, 가능한 한, 시도 촉구된다. 이것은 어떤 발견 상호 작용이 있는지, 미끼 따라서 생물학적 활성과 자신감을 제공합니다생물학적 관련성이 다소 가능성.

<table><tbody><tr><td>트립톤</td><td>Becton Dickinson Co.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Research Products International</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>대장균 BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>유전자형: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>암피실린, 나트륨 염</td><td>연구 제품 국제</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>Penta-HIS 1차 항체</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 알칼리 인산염 접합체</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-니트로페닐포스페이</td>트 <td>시그마-알드리치 공사</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP 프라이머</td><td>EMD 화학 Inc.</td><td></td><td>5 ' - GGAGCTGTCGTATTCCAGTC - 3 '</td></tr> <tr><td>T7 다운 프라이머</td><td>EMD 화학 주식</td> 회사<td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR 정화 키트</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick 젤 추출 키트 </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 사이클 염기서열분석 키트</td><td>, Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>Heating Block</td><td>Pierce Chemical Co.(Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 인큐베이터 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 5 &#190; in</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV 실드</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>장갑, 니트릴</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>멸균 1.5ml 튜브</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10ml 붕규산 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 배양 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, ELISA 플레이트 리더</td><td>Labsystem 및 Flow Laboratories, 핀란드 헬싱키</td><td>Type 362</td><td></td></tr></tbody></table>

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

고정 미끼 분자 방향성 복제 cDNA 라이브러리로 인코딩 된 다양한 단백질 부분을 제시 할 수있는 발판 재조합 파지를 사용하여 상호 작용을 발견 할 수있는 효율적인 수단입니다. 기술은 주로 단백질 - 단백질 상호 작용을 발견하기 위해 사용되었지만 도전을 미끼 분자는 단백질에 한정 될 필요는 없다. 여기에 제시된 프로토콜은 미끼의 소극적인 수가 동일한 단백질을 제시하는 독립 클론의 식별을 최대화하기 위해 반복 실험으로 스크리닝 할 수 있도록 최적화되었다. 이 확인 된 상호 작용하는 단백질이 미끼 분자의 합법적 인 인터랙 것을 더 큰 자신감을 허용합니다. 각각의 선호도 선택 후 파지 역가를 모니터링 라운드 선호도 선택이 음성 대조군의 효과뿐 아니라 어떻게 진행되고 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 하나는 파지를 titering, 방법을 통해 어떤이 과정이 효율적으로 진행 할 수 있도록 사전에 준비수는 표시됩니다. 독립적 인 플라크의 격리 다음 검색 증폭 산물의 특성이 선호도 선택은 진행 상황을 잘 확인하는 데 사용할 수있는 강조 표시됩니다. 문제가 잘못된 반응을 최소화하기 위해 또는 지속적으로 파지를 복구 우회하는 기술 촬영이 설명되어 있습니다. 바이러스 오염 플레어 업을 줄이는 수단이 논의된다.

(대사 미끼 중독) 파지 표시 단백질과 상호 작용하는 미끼의 능력을 손상 할 수 있다는 것은이 기술에 대한 강력한 음의 컨트롤을 제공합니다. 그것은 미끼가 잘 마이크로 플레이트에 결합 할 때, 그 기능을 유지하고 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 이러한 검사는 모두 nonpoisoned 미끼로 회수 상호 작용, 파지 표시 단백질은 안전한 것으로 신뢰를 증가 할 것이다. 각 우물에서 세 삼중를 샘플링 선호도 선택에 필요한 시간과 작업에 상당히 추가 한 번만 샘플링보다 각 웰 내 역가의보다 정확한 견적을 제공합니다. 삼중의 역가의 대부분이 잘 일치하지만, 라운드 네에서 BSA의 복제 2의 삼중는 (표 1) 다양 있습니다. 여러 번 샘플링하여, 최종 잡은 탈리는 피펫 팅의 오차 및 t의 더 정확한 추정치뿐만 취약하지그는 실제 역가이 예상 주위의 변화는 잘 - 투 - 글쎄, (표 1, 그림 5C)를 얻을 수있다. <p...

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

이 절차의 전반적인 목표는 고정화된 베이트 분자와의 단백질 상호작용을 발견하는 것입니다. 이는 먼저 베이트를 획득하고 고정화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 결합을 촉진하는 조건 하에서 스크리닝할 파지 라이브러리를 베이트에 도입하는 것입니다.다음으로, 엄격한 세척 과정을 통해 결합되지 않은 파지를 제거합니다. 결합된 파지는 회수 전 박테리아를 감염시키는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 다음 단계의 친화성 선택을 위해 결합된 파지를 증폭시키는 것입니다.최종적으로, 파지 역가가 정체기에 도달하면 단일 플라크를 선택하고 시퀀싱하여 실험적 결합 조건 하에서 고정된 lagging에 대해 어떤 단백질이 가장 높은 친화력을 갖는지 확인합니다. 이 과정은 단백질-단백질 상호작용의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제된 재조합 단백질을 마이크로타이터 플레이트 바닥에 배치하는 것으로 시작합니다.다음 단계는 250 mL 삼각 플라스크에 담긴 100 µg/mL ampicillin 함유 Luria burani 배지 50 mL에, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 배양한 단일 콜로니를 접종하는 것입니다. 이를 수평 진탕배양기에서 37 °C, 200 RPM으로 배양하며, 분광광도계를 사용하여 세포 밀도를 모니터링하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.5에서 0.6이 될 때까지 배양합니다. 그 후 세포를 50 mL Falcon 튜브 또는 이와 유사한 용기에 옮겨 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다. 세포는 보통 약 일주일 동안 생존 능력을 유지합니다. 1일 차에 준비를 마치고, 2일 차 아침에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 친화성 선택(affinity selection)을 준비합니다.멸균된 빈 250 milliliter 삼각 플라스크 9개를 인큐베이팅 셰이커의 클램프에 배치합니다. 500 milliliters의 lal burani에 전날 밤 시작한 파지 감염 BLT 5 4 0 3 세포 overnight 배양액 중 하나에서 500 microliters를 취해 접종합니다. 플라스크를 인큐베이터에 넣은 후, 분광광도계를 켜고 600 nanometers에서 흡광도를 측정하도록 설정합니다. 그동안 4 °C에서 마이크로타이터 플레이트를 꺼내 플라스틱 필름을 제거합니다. 웰당 200 microliters의 1 X tris buffered saline 또는 TBS pH 7.5로

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

AVEXIS 세포 인식 프로세스에 관련된 소설 세포 수용체 - 리간드 쌍을 체계적 화면으로 개발된 높은 처리량 단백질 상호 작용 분석이다. 그것은 구체적으로 다른 높은 처리량 접근 방식을 사용하여 식별하기 어려운 일시적인 단백질 상호 작용을 감지할 수 있도록 설계되었습니다.

낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

이 비디오에서는 표적 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질을 발현하는 사전 엔지니어링된 파지를 분리하는 파지 디스플레이 기술을 보여줍니다.

Phage Display를 사용하여 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 단백질 선택

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 "domainome" 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

이 프로토콜에서는 맞춤형 다양성 합성 항 체 살 균 소 전시 도서관의 건설에 대 한 자세한 절차를 설명합니다. 합성 항 체는 질병 진단 및 치료제를 기초 연구에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

합성 살 균 소의 건설 맞춤형 다양성 팹 라이브러리 표시

여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

이 논문은 알칼리성 포스파타제 접합 ScFv D11 항체를 사용하여 면역형광법에 의해 조직에서 이소레부글란딘을 측정하기 위한 상세한 방법론을 제공합니다. 마우스와 인간 모두의 고혈압 모델은 조직 샘플에서 이돌부글란딘 측정과 관련된 단계별 절차 및 기본 원리를 설명하는 데 사용됩니다.

D11 scFv-알칼리성 포스파타제 융합 단백질 및 면역형광을 이용한 조직 내 이솔레부글란딘의 직접 검출

유비퀴티뉴션은 번역 후 중요한 단백질이며, 이의 난독증은 수많은 인간 질환에 연루되어 있다. 이 프로토콜은 파지 디스플레이가 유비퀴티니션의 특이성, 효율성 및 패턴을 제어하는 E3 리개아의 활성을 결합하고 조절할 수 있는 새로운 유비퀴틴 변종을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.

파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

학습하세요 파지 디스플레이 기술을 사용하여 고정화된 미끼 분자와의 단백질 상호작용을 발견하는 방법을. 이 프로토콜은 효율적인 친화성 선택과 상호작용 단백질 식별에 활용됩니다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

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