펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

이 바이오 패닝 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 포획 제제를 관심 있는 특정 단백질 표적에 대해 신속하게 분리하고 추가 다운스트림 분석에서 비특이적 후보 물질을 빠르고 효과적으로 제거하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 위협 감지에서 질병 진단에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 강력한 펩타이드 친화성 시약을 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 펩타이드 친화성 시약을 상당한 양의 교육 없이 약 1주일 만에 빠르게 분리할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 세포 외 사용을 위한 펩타이드 친화성 시약을 발견하는 데 사용할 수 있지만 펩타이드는 살아있는 물질로도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인에게 가장 어려운 측면은 여기에 표시된 실험 프로토콜과 크게 상호 작용하는 후보 물질의 다운스트림 염기서열 분석입니다. Bio-panning 박테리아 디스플레이 라이브러리는 비드 물질 또는 부착된 포획 단백질에 대한 비특이적 결합제를 제거하기 위해 마그네틱 비드 자체에 대한 negative sorting으로 시작하는 주기적 프로세스입니다.

마그네틱 비드와 결합하지 않는 음의 분획은 유지되어야 합니다. 잠재적인 교차 반응성 단백질 표적에 대해 추가적인 negative sorting을 수행할 수 있으며, magnetic beads에 결합하지 않는 negative fraction은 다시 유지됩니다. 후속 positive sorting 단계는 단백질 타겟에 대한 negative sorting과 매우 유사하지만, 이번에는 마그네틱 비드 결합 positive fraction이 유지됩니다.

박테리아 디스플레이 라이브러리의 양성 분류를 위해 먼저 클로람페니콜 또는 LBCM-25가 보충된 Luria Broth Miller 500ml를 음성 분류에 의해 원치 않는 펩타이드가 미리 고갈된 다양한 박테리아 디스플레이 분류 라이브러리의 11번째 세포의 약 10배에 접종합니다. 배양액이 0.5 - 0.55의 OD 600에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 225RPM으로 라이브러리를 배양합니다. 그런 다음 0.04%L-arabinose로 진탕과 함께 섭씨 37도에서 45분 동안 펩타이드 발현을 유도합니다.

유도 시간이 끝나면 배양물을 얼음 위에 놓습니다. 그리고 원심분리에 의해 11번째의 세균 세포를 2배 10번 수집합니다. 펠릿을 1.5ml의 PBS에 부드럽게 소용돌이치며 다시 현탁시킵니다.

그리고 두 번째 원심분리에 필요한 만큼 박테리아를 여러 개의 마이크로 원심분리 튜브로 분할합니다. 관심 있는 비오틴화 표적이 보충된 1ml의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시켜 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 45분 동안 배양합니다. 그 동안, 100마이크로리터의 스트렙타비딘으로 인코딩된 비드를 1mm의 PBS에 넣고 원심분리를 통해 소 혈청 알부민(BSA)을 보충합니다.

세척된 비드를 벤치탑 자성 입자 분리기에 놓고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 슈퍼 나덴트를 조심스럽게 제거합니다. 회전 배양이 끝나면 세포를 원심분리하여 슈퍼 나덴트에서 결합되지 않은 표적을 수집하고 표적 단백질 결합 박테리아 세포 펠렛을 PBS plus BSA 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 전체 박테리아 세포를 사용하여 비드 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

섭씨 4도에서 회전 플랫폼에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 구슬과 박테리아 용액을 얼음 위에 놓습니다. 자동 최대 기기를 켜서 시스템을 초기화하고 분리 메뉴에서 지금 세척, 헹굼 및 실행을 선택하여 제조업체의 세척 및 실행 버퍼로 라인을 각각 프라이밍합니다.

세척이 끝나면 PBS와 BSA 버퍼를 사용하여 라인을 한 번 더 프라임합니다. 기기가 준비되면 박테리아와 비드 혼합물을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 추가로 500마이크로리터의 새 PBS와 BSA로 튜브를 헹굽니다. 박테리아와 비드 혼합물이 담긴 세척액을 당겨 튜브를 섭씨 4도의 원추형 튜브 랙의 샘플 슬롯에 넣습니다.

빈 15ml 수집 튜브를 랙의 양극 및 음극 선택 슬롯에 넣고 랙을 기기 플랫폼으로 옮깁니다. 랙의 각 샘플에 대해 분리 프로그램을 할당하여 각 샘플 사이와 마지막 샘플 뒤에 헹굼 단계를 추가합니다. 실행을 선택하여 셀 분리를 시작하고 확인을 선택하거나 계속하여 충분한 버퍼를 사용할 수 있는지 확인합니다.

프로그램이 완료되면 랙을 제거하고 박테리아와 구슬이 모두 포함된 양극 분획을 얼음 위에 놓습니다. 방금 시연한 대로 제조업체의 실행 및 세척 버퍼를 사용하여 라인을 프라이밍한 후 전원 및 예를 선택하여 기기를 종료하고 오염 제거를 위한 저장 용액 병에 70% 에탄올이 있는지 확인합니다. 시스템 종료가 완료되면 병이 보라색으로 바뀝니다.

기기를 끌 수 있습니다. 그런 다음 전체 양성 분류 분획을 사용하여 D 포도당이 보충된 LBCM25 1리터를 섭씨 37도에서 야간 배양에 진탕과 함께 접종합니다. 각 분류 라운드 후 친화성 시약 분리 성공을 분석하기 위해 분류 후 펩타이드 유도가 끝날 때 표와 같이 25마이크로리터의 용액에 5마이크로리터의 유도 세포를 추가합니다.

얼음에서 45분 동안 배양한 후 원심분리로 각 용액의 박테리아를 수집하고 각 샘플에서 슈퍼 나덴트를 흡인합니다. 샘플 튜브가 얼음 위에 있는 상태에서 FAX 기기 소프트웨어에서 관리자를 선택하고 해당 분석 폴더를 엽니다. 새 실험을 클릭합니다.

그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 실험의 이름을 바꾸고 전역 워크시트를 클릭합니다. 글로벌 워크시트 스프레드시트에서 점 그림 아이콘을 클릭하여 새 산점도를 만듭니다. 그런 다음 도트 플롯 그래프 자체를 선택하고 검사기 아이콘을 선택합니다.

열린 창에서 X축과 Y축 옆에 있는 상자를 클릭하여 축을 이중 지수 디스플레이로 조정하고 검사기 창을 닫습니다. 실험을 클릭하고 새 표본을 만들고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 실험적으로 적합한 표본의 이름을 바꿉니다. 그런 다음 더하기 기호를 클릭하여 표본을 확장하고 표본의 이름을 바꿉니다.

음성 대조군 샘플을 실행하려면 PBS 전용 펠릿을 피펫으로 잘 혼합된 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 FAX 실행 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 샘플을 FAX 튜브로 옮기고, 튕겨서 용액에 세포를 유지하고, 샘플을 기기의 샘플 주입 튜브 또는 SIT에 로드합니다. 현재 샘플 튜브를 두 번 클릭하고 수집된 데이터를 클릭합니다.

그런 다음 이전에 준비된 측면 산란 영역 대 전방 산란 영역 점도표의 이벤트를 표시하고, 필요에 따라 임계값 탭 아래의 광 승수 튜브 전압 임계값을 조정하여 네거티브 컨트롤 셀이 중앙 근처에 놓이도록 합니다. 샘플이 제대로 읽히면 초당 200-2, 000 이벤트를 표시하도록 유속을 조정하고 레코드 데이터를 클릭하여 최소 10, 000 이벤트를 캡처합니다. 모든 이벤트가 획득되면 SIT에서 샘플 튜브를 제거합니다.

polygon gate 아이콘을 선택하고 산점도에서 대부분의 셀 모집단 주위에 gate를 그립니다. 점도표를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 인구 계층 표시를 선택하고 인구 계층에서 P1을 클릭한 다음 P1 인구를 표시하는 새 점도표를 만듭니다. 각 축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Y축을 FITC 영역으로, X축을 전방 산란 영역으로 변경하고 축을 이중 지수 표시로 조정합니다.

폴리곤 게이트를 사용하여 모집단의 위쪽과 왼쪽 주위에서 음의 제어 셀을 가능한 한 밀접하게 게이트하고, 모집단 계층에서 P2를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 게이트 반전을 선택합니다. 인구의 1% 미만이 게이트 밖으로 떨어져야 합니다. P2 게이트가 있는 점도표를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모집단 표시를 선택하고 표시할 P2 모집단이 아닌 P2 모집단을 선택합니다.

그런 다음 P2 게이트가 있는 점 그림을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Create statistics view(통계 보기 만들기)를 선택하고 통계 보기 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 edit statistics view(통계 보기 편집)를 선택합니다. populations 탭에서 P1 상위 모집단을 포함하여 모집단을 적절하게 추가하거나 제거합니다. P2가 아닌 P2가 이미 표시되어 있어야 합니다.

그런 다음 통계 탭에서 FITC 영역, 매체 및 기타 관심 있는 통계를 추가하고 확인을 클릭하여 창을 닫습니다. P2 산점도를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 선택하여 PE 영역과 FSC 영역에 대한 유사한 도트 플롯 그래프를 만듭니다. Y축을 조정하고 PBS만 표본을 사용하여 P3 모집단을 게이트합니다.

그런 다음 게이트를 반전시킵니다. 그리고 적절한 모집단을 표시합니다. 모든 적절한 게이트가 설정되면 스프레드시트를 사용하여 튜브당 약 10, 000개의 이벤트를 기록하는 모든 샘플을 실행합니다.

이 대표적인 실험에서와 같이, Ypet Mona가 고정 양성 대조군 펩타이드에 결합하면 집단 내 유도 펩타이드 라이브러리의 발현 수준을 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표면에 표시된 펩타이드가 없는 세포는 일반적으로 3차 및 4차에서 관찰된 바와 같이 분류 과정 중에 제거됩니다. 특정 관심 대상에 결합하는 펩타이드에 대한 라이브러리의 농축은 일반적으로 3번의 positive sorting round 내에서 달성됩니다.

4차 분류를 계속하는 것은 3차에서 이미 존재하는 가장 높은 친화성 펩타이드 염기서열이 4차에서 더욱 농축되어 잠재적인 후보 물질을 하향 선별하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 도움이 될 수 있습니다. 특이성은 의도된 표적에 대한 결합을 negative sorting에 사용된 것과 같은 잠재적인 교차 반응 표적에 대한 결합과 비교하여 평가됩니다. 4차 정렬의 염기서열 분석은 일반적으로 친화도 및 특이성 분석을 위한 훌륭한 시작점이 되는 반복 염기서열을 보여줍니다.

반복 서열의 서열 정렬 분석을 사용하여 후보 물질을 하향 선택하는 데 도움이 될 수 있는 합의 서열의 존재를 밝힐 수 있습니다. 그런 다음 각 반복 염기서열에서 대표되는 콜로니를 세포 내 친화도 및 특이성의 사실에 의해 추가로 분석하여 표적 및 교차 반응성 단백질에 대한 펩타이드 결합을 평가할 수 있습니다. 일단 마스터되면 초기 친화도 및 특이성 분석을 통한 전체 바이오 실험을 적절하게 실행할 경우 2주 이내에 수행할 수 있습니다.

전체 절차를 수행할 때 결합 친화력과 관련된 통과를 완전히 이해하기 위해 결합 평가와 염기서열 분석을 여러 번 번갈아 가며 수행해야 할 수도 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 펩타이드 분석의 대부분을 자동화하고 후보 물질 선택을 더욱 간소화하기 위해 개발한 추가 매크로 파일이 포함되어 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 박테리아 디스플레이 라이브러리에서 펩타이드 포획 시원제를 신속하게 분리하는 방법과 추가 다운스트림 분석에서 비특이적 후보 물질을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 따른 후 ALIZA와 같은 다른 방법을 수행하여 세포 결합 친화도 및 특이성을 확인할 수 있습니다.