Name: 펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: 배우세요 세균 디스플레이 라이브러리를 이용한 반자동 바이오패닝으로 특이적 펩타이드 친화성 시약을 신속하게 분리하는 방법입니다. 비특이적 결합자를 효과적으로 제거하여 진단 및 생물학적 탐지에 활용할 수 있습니다.

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저자는 미국 육군 연구 실험실 (ARL) 박사 화목 프로그램, 박사 저스틴 P. Jahnke의 약속을 통해, ARL와 오크 릿지 연관 된 대학 계약을 통해 관리의 지원을 인정 하 고 싶습니다. 자금 남은 센서와 전자 장치 스파이 ARL에 의해 제공 되었다. 저자 또한 감사 Daugherty 실험실 UCSB에서 세균성 디스플레이 라이브러리와 YPet 모나 시 약, 닥터 브린 아담스 지원에 ARL, 그의 초기 작품에 대 한 박사 조슈아 Kogot에서 YPet 모나 시 복제에 대 한 복제에 대 한 정보를 공유 하 고 싶습니다, 엣지 우드 화학 고 표현 하 고 abrax를 정화 하는 데 사용 하는 플라스 미드를 공유 하기 위한 생물학 센터의 Alena 진정 세균 디스플레이 라이브러리 및 rivax 단백질의 biopanning PA 바인딩 펩 티 드, Qin Guo의 격리에 대 한 기술 지원에 대 한 브랜디 Dorsey에 훈련 abrax 바인딩 펩 티 드의 격리에 대 한 예비 실험과 박사 제시카 테 럴이이 원고에 관한 유용한 토론에 대 한 기술 지원에 대 한.

저자 공개할 게 없다

펩 티 드 인식에 대 한 항 체에 대 한 유용한 대안을 제공 하는 특정 조건이 극한 환경에서 안정성 필요할 때 그리고 Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 선호도 시 약의 고립에 성공적인 접근 되었습니다. 이러한 라이브러리의 Biopanning 간소화 되었습니다 여기에, 설명 하는 autoMCS 메서드를 사용 하 여 그리고 상용 autoMCS 플랫폼 훨씬 넓은 청중에 게이 기술을 확장. 전통적인 번갈아 MCS/FACS에 비해 박테리아에 대 한 정렬 방법 라이브러리 표시, 정렬 및 바인딩된 셀을 분리 수 있는 더 비싼 FACS 악기를에서 투자 필요 하지 않습니다 때문에 autoMCS 방법 보다 적게 비싸다 여기에 사용 되는 교류 cytometer 유형의 보다 분석 14수만입니다. AutoMCS에 의해 성공적인 biopanning에 대 한 중요 한 단계는 분리 프로그램 선택, 부정적인 FACS를 사용 하 여 biopanning, 중지 시기를 결정 하는 라이브러리 농축 모니터링 가양성을 줄이기 위해 잠재적 크로스-반응에 대 한 정렬 및 후보자의 수백의 성가신 검열을 피하기 위해 후보 풀의 스마트 분석.
여기에 설명 된 예제 비록 약간 다른 분석 전략의 각 풀에 대 한 펩 티 드 순서에 차이 두 개의 별도 대상, PA 및 abrax, 선택한 세균성 디스플레이 라이브러리의 성공적인 biopanning 설명 biopanning의 4 라운드 후 후보자입니다. PA 순서 분석 펩 티 드 순서 144 식민지에서 한 번 이상 반복에서 분명 트렌드를 보여주는 더 똑 바른 예 이었다. 이 혼자 합의 포함 하는 충분 한 PA 대상에 대 한 합의 순서를 결정 하 고 그 식민지 또는 유사한 시퀀스 streptavidin 부정적인 컨트롤에 바인딩 대 PA에 바인딩의 비율 면에서 최고의 후보자를 했다. 그러나,이 항상 되지 않습니다 경우. Abrax 대상에 대 한 시퀀싱 100 식민지 5 반복 시퀀스 아니라 이러한 시퀀스에서 동향은 향기로운 아미노산 잔류물 및 aspartic 산 또는 아스파라긴을 포함 하는 경향이 다른 불분명. 반복 시퀀스에서 예측된 "합의"만 수 생산 되었고 abrax, 선호도 대 한 검사를 하지만 그 정확한 일치 시퀀스를 포함 하는 아무 부모 시퀀스, 이후 우리 시퀀스 된 식민지의 목록에 반환 관찰 다른 후보가 서로 공통점이 더 많은 동향 했다. 사실, 두 식민지 반복 혼자, (FWAWF 대신 FWDTWF), 트립토판, 페닐알라닌, aspartic 산 성 잔류물의 하지만 다른 간격으로 동일한 추세를 했다에서 "일치"에 유사한 시퀀스 포함. 이러한 펩 티이 드 중 하나는 반복 시퀀스, 하나 아니었다. 유사한 변종 포함 된 세 번째 시퀀스와 함께 이러한 두 시퀀스 상위 5 바인더 abrax에 대 한 선호도 측면에서 테스트 중 이었다. 전반적인 최고 바인더 도끼-A05도 비슷한 추세를 표시 됩니다. Abrax에 대 한 결과 여러 번 시퀀스 분석 및 친 화력과 특이성 분석 사이의 교체는 접근 때로는 선택한 대상에 따라 필요한 것을 보여 줍니다. Abrax 대상에 대 한 결과 또한 매우 비슷한 단백질 (rivax 1,15)를 통해 얻을 수 있는 특이성의 수준을 보여 줍니다.
우리의 연구에 대 한 선정 autoMCS 프로그램 Posselds 및 Posseld, 낮은 주파수, 초기 인구의 5% 미만으로 레이블이 대상 셀의 긍정적인 선택에 대 한 둘 다 있었다. 두 경우 모두, 세포는 두 개의 자석 열 통과. 그러나 Posselds 프로그램의 경우, 셀 통과 더 느리게 증가 노출 시간 41을 첫 번째 열. 상업적인 autoMCS 장치의 제조 업체에 의해 주어진 프로그램 설명 뿐만 아니라 (참조 자료 테이블) 41이 프로그램은 여러 잠재적인 프로그램의 초기 비교 후 선정 됐다. 각 프로그램의 능력 꺼내 부정적인 제어 셀, 균질 문화에서 가양성 방지 하 고 성공적으로 부정적인 통제 세포는 감소와 함께 아군을 포함 하는 혼합된 문화에서 관심의 대상으로 알려진된 바인더를 분리 알려진된 바인더의 비율 비교 되었다. 여기에 설명 된 응용 프로그램에서 크게 벗어난, 비슷한 비교 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로그램 선택에 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 PA는 biopanning의 모든 4 라운드에 대 한 이러한 프로그램 중 하나를 사용 하 여 절연과 비슷한 펩 티 드의 지도 보여에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약의 분리 (Posseld 및 Posselds)이 두 프로그램을 비교 하는 결과 게시 선호도 및 PA에 대 한 특이성 WXCFTC 합의의 결정. 주요 차이점은 그 Posseld, 그것의 빠른 흐름 속도, 보다 신속 하 게 정렬 및 바인딩 대상에 대 한 선호도 높았다 따라서 biopanning, 두 라운드 동안 biopanning 의 4 라운드 후 더 많은 독특한 시퀀스를 led Posselds를 사용 하 여 14.이 학습 전략 약간 변경 되었습니다 때 모두 혜택을 통합 abrax 바인딩 펩 티 드에 대 한 biopanning: 1 라운드 어디 다양성은 높은, 하지만 다음이 중요 한 단계 더 많은 노출 시간을 허용 하도록 사용 되었다 Posselds는 프로그램 Posseld 라운드 2-4 1,15중 가장 높은 선호도 바인더의 빠른 격리에 대 한 전환 했다. 이 때문에 특히 nMFI 및 백분율 바인딩 둘다 abrax 라운드 4 프로그램 중 하나를 정렬 하는 PA에 비해 4 라운드를 정렬에 대 한 더 높은 abrax, 이상적 될 것으로 보인다 (그림 2 및 그림 3 과 Sarkes 그 외 여러분 2015 14), 하지만 같은 목표와 함께 다른에 대 한 전략을 사용 하 여 직접 비교는 더 결정적인 비교에 필요한 것입니다. 어떤 프로그램은 특정 응용 프로그램에 대 한 최고의 개별 대상, 사용, 정렬 라이브러리 및 여기에 설명 된 조건에 어떤 변화를 달성 하는 펩 티 드 식의 수준에 달려 있습니다.
설명 하지 여기 abiotic 재료로 biopanning에서 잠재적인 결과입니다 하지만 우리는 또한 대량 알루미늄 2에 대 한 biopanning에 대 한 동일한 세균 디스플레이 라이브러리를 사용. 이 연구는 autoMCS를 사용 하 여 수행 되지 않은 하지만 비슷한 연구 자료에서 사용할 수 또는 수에 코팅 또는에, 마그네틱 비드 활용 된 경우 autoMCS를 사용 하 여 달성 될 수 있었다. 대량 알루미늄 연구에서 개별 아미노산 분석 및 이차 구조 모델링 아무 합의 순서 결정된 2이후 어떤 고립 된 펩 티 드의 바인딩 선호도 운전에 유용 했다. 생물 학적 목표와도이 개별 잔류물 주파수 분석 탭을 포함 하는 스프레드시트 "eCPX_Sequencing" 매크로에서 생성 하는 이유는 일부 대상에 대 한 바인딩 선호도 운전 하는 무슨을 이해 하는 데 필요한 수 있습니다. 그러나 없는 반복 시퀀스는 합의의 부족 뿐만 아니라 볼 수 있습니다 잔류물 주파수 패턴을 표시 하는 경우에,, 다른 유형의 분석 해야 합니다. 또한, 추가 라운드를 정렬 원하는 대상에 충분 한 선호도 다운 선택에 대 한 후보자의 훨씬 더 큰 수를 차단 하지 않도록 필요할 수 있습니다.
다음 세대 시퀀싱의 증가 가용성, 선호도 테스트 하기 전에 가장 유망한 후보자를 결정 하 고 biopanning의 각 라운드 후 농축의 정도 결정 하는 더 철저 한 연구를 수행 수 있습니다. 그러나, 쉽게 수십 또는 수백 개의 식민지의 일상적인 식민지 시퀀싱을 충분히 높은 주파수의 없는 경우 복제를 통해 다시 만들어야 시퀀스 바인딩 분석 단계로 이동 할 수 있습니다. 이 기술 발전, 저렴 하 고 더 일상적인 되 고 특히 식민지 격리에 대 한 옵션, 그것은 것입니다 가능성이 있을 biopanning 데이터를 분석 하는 가장 좋은 방법은. 그것은, 진화 방법 개별 시퀀스 및 전체 라이브러리의 이어질 수 있습니다. 또한, 정렬 라이브러리에서 박테리아 빠른 성장 속도와 게놈 단백질에 대 한 디스플레이 비 펩 티 드 식 없이 자료를 바인딩할 수 overexpress 박테리아 세포 쪽으로 정렬 바이어스 수 시간이 지남에 변경할 수 있습니다. 인스턴스입니다. 그 이유로, 유망한 후보자 등장, 일단 그것은 플라스 미드 DNA를 분리, 신선한 대장균, retransforming FACS 통해 펩 티 드 바인딩을 확인 합니다. 셀 무료 형태로 펩 티 드를 사용 하 여 계획 하는 경우 선호도 무료 펩 티 드에 대 한 평가 또한 한다. 예를 들어 대상 셉에 대 한 세균 디스플레이 통해 발견 된 펩 티 드 선호도 시 약 종합적 제작-셀 및 효소 연결 된 immunosorbant 분석 결과 (ELISA), 및 (FACS)를 통해 셀에 셀 오프 같은 더 전통적인 방법으로 분석 된 (ELISA)을 통해 선호도 두 방법 7에 의해 결정 하는 Kds를 사용 하 여 비교 했다.
Biotin streptavidin 상호 작용의 강도 단백질 대상과 바운드 펩 티 드의 캡처에 대 한 이상적인 전략은, 비록 다른 캡처 전략에 대 한이 절차를 수정할 수 있습니다. 에폭시 및 carboxylic 산 구슬 같은 자석 구슬, 단백질의 직접 결합 성공 했다 하 고 바인딩 단계를 제거 합니다. 그러나, 직접 첨부 파일 첨부 파일 전략에 따라 특정 또는 일반적인 방식으로, 잠재적인 바인딩 사이트를 방해 수 있습니다. 추가 streptavidin 비즈를 사용 하 여 장점은 안정적인 단백질 덜 대상 갓 30 분에 biotinylated 일 수 있다 또는 저장 동안 스스로 구슬 cross-linking에 대 한 단백질으로 더 이상 화를 요구 하는 경향이 있으며, 필요한 경우, 냉동 일반적으로 2-8 ° c.에 저장 Biotinylated 단백질의 제안된 시작 농도 대상 여기, 600 nM, 여러 대상에 대 한 성공 했다 하지만이 농도 감소 하는 경우 증가 선호도와 펩 티 드 캡처 시 약을 수 있습니다. 또한,이 메서드를 확장 하 고 다른 세균성 디스플레이 라이브러리와 다른 유기 체에 대 한 수정 될 수 있습니다. 예를 들어 사용할 anaerobes, 산소의 부재에서 또는 독특한 특성을 가진 펩 티 드를 분리 하는 extremophiles와 함께 사용 하기 위해 다른 환경에서 이러한 단계를 수행할 수 있습니다. 펩 티 드 또는 합의 결정에 대 한 관심의 특정 대상 수 있습니다 잠재적으로 사용 셀에 셀에서 생활 소재, 또는 합성으로 생산. 종합적으로 생산된 펩 티 드를 더 성숙 하 더 높은 선호도 및 센서에서 사용 하기 위해 또는 항 체 바인딩을 사용할 수 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 더 강력한 단백질 촉매 캡처 (PCC) 에이전트의 개발에 대 한 수 또는 인식 38,55. 분자 모델링 그림 5C 1에 나열 된 abrax 바인딩 펩 티 드 및 합의 대 한 최근 수행 되었다 목표와 펩 티 드의 위치 바인딩 확인 하는 데 사용할 수 있습니다. 전반적으로, 펩 티 드 선호도 시 약에 대 한 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 인식에 대 한 항 체의 생산, 단백질 목표의 탐지 및이 반자동된 biopanning, 간단, 신속 하 고 강력한 대안 접근 까지 도달 하는 응용 프로그램을 신뢰할 수 있는 결과 생산 하고있다.

Biopanning은 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술, 박테리아와 펩 티 드 선호도 시 약 1,2,3,,45에 대 한 편리한 소스 라이브러리 표시 6,7,,89,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,,2122,23, 24. 마찬가지로 페이지 표시 25,26 효 모 표시 27,28는 펩 티 드 셀 표면에 노출 되는 biotic 및 abiotic 목표, 이러한 상호 작용을 바인딩할 수 있습니다. 펩 티 드 등뼈와 아미노산 사이드 체인 29의 독특한 특성에 의해 구동. 파지 디스플레이, 달리 박테리아 스스로 자기 복제 되며 바인딩된 페이지의 차입 및 세포의 감염 없이 디스플레이에 필요한 모든 유전 물질을 포함. 효 모 디스플레이, 달리 세균 디스플레이 급속 한 (약 20 분 30) 대장균의 시간을 두 배로 때문에 빠릅니다. 결과 펩 티 드 선호도 시 약을 생산 수 있습니다 감지 플랫폼 16,,1726 의 다양 한에서 사용 하기 위한 셀 오프 있고 사용을 위한 잠재력으로 생활 재료 표시에 셀 2 , 31 , 32. 특정 대상의 인식에 대 한 단일 클론 항 체에 비해 펩 티 드 훨씬 작고 더 유연 하 고, 그리고 펩 티 드 디스플레이 라이브러리 시스테인 33 등 특정 아미노산을 피하려고 DNA 수준에서 쉽게 조작할 수 있습니다 . 펩 티 드 치료제 34,,3536 및 항 체 발견, 재현할 수 합성 (오프-셀의 그들의 용이성으로 인해 활용 될 일반적으로 다른 응용 프로그램에 대 한 악용 하는 점점 더 )의 생산 그리고 우수한 정비 기능 시 약을 제공 하는 높은 온도 또는 냉각 37,38없이 장기 저장에 노출 후에 극한 환경에서 성능. 극한 환경에서 작동 해야 하는 국방부, 예를 들어, 특정 관심의 시 약의 저장을 위해 콜드 체인을 극복 하는 능력이입니다. 열 안정성은 그러므로 선호도 시 약이이 원고에 예제로 주어진 선택한 대상 인식에 대 한 바람직한 기능.
최근, 훨씬 더 간단 하 고 반자동된 마그네틱 활성화 셀 맥 (MCS) 방법 9,,1439정렬 사용 하 여 신뢰할 수 있는 biopanning 세균 디스플레이 라이브러리 되고있다. 이러한 방법 자기 활성화 셀 (autoMACS 또는 autoMCS) 악기 분류 자동 정렬 다른 점으로, 상업적으로 사용할 수를 포함 하 여 플랫폼 여러 유사한를 사용 하 여 생물 학적 대상에 대 한 입증 되어 있다 (표 참조 재료) 1,,1415 와는 일회용 카트리지 7,9 또는 칩 39, 귀중 한 사양에 대 한 샘플을 포함 하는 보다 전문적인된 장치 사용 유기 체 또는 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 또는 더 높은7독 소. 이러한 반 자동화 방법 경우는 자료 자석 또는 코팅 자성 구슬에 고 (와 같은 혐 기성 박테리아) 다른 유기 체와 함께 사용할 경우 능력 abiotic 재료에 바인딩할 수 펩 티 드에 대 한 정렬 확장 될 수 있는 정렬 그리고 성장 조건이 변경 될 수 있습니다. 세균성 디스플레이 라이브러리 정렬, 뿐만 아니라 여기 사용 상업 autoMCS 악기도 사용 하 고 일부 효 모, 더 절연 뒤의 화면에 표시 된 인간 단일 체인 항 체 파편의 발견의 초기 단계에 대 한 사용 하는 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 40. 반 자동화에 주요 이점은 정렬 시간 및 노력, 그리고 더 강력 하 고 재현할 수 제거 자석 구슬에서 언바운드 셀의 세척 단계, 감소 가양성을 선도, 더 적은 필요한 정렬 라운드, 갈수록 감소 복잡 한 다운 스트림 분석 9,14. 상업적인 autoMCS 악기의 경우는 여러 사전 로드 된 프로그램을 다른 응용 프로그램, 음수 전 (고갈), 정렬 등 순수성을 우선 순위, 최종 샘플 볼륨을 최소화 하 고 증가 적합 있을 수 있습니다 또는 드문 셀 41의 격리에 대 한 감도 감소.
이 작품의 초점은 상용 autoMCS 악기를 사용 하 여 세균성 디스플레이 라이브러리 biopanning에 대 한 방법론을 설명 하 고 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명 다른 응용 프로그램에 대 한 확장을 용이 하 게 하는 순서입니다. 여기에 사용 하는 디스플레이 라이브러리 (재료의 표 참조) 12,13 포함 약 109-1011 독특한 15-메 르 펩 티 드 세균 외부 막 단백질 OmpX의 수정된 된 버전을 통해 전시에 종합적으로 생산 하는 경우 솔루션에서 무료 펩 티 드의 대표 될 것으로 예상 된다 세포 표면에 무제한 자연. 이 단백질 비 계에는 C-YPet 모나에 바인딩을 통해 식 모니터링에 대 한 긍정적인 제어 P2X 펩 티 드를 또한 포함 되어 있습니다. 그러나, 적당 한 다양성 및 원하는 특정 응용 프로그램에 필요한 다른 특성 구입 또는 새로운 라이브러리를 함께 작동 합니다 마찬가지로 biopanning 절차, 비록 몇 가지 사소한 변경 내용이 필요할 수 있습니다. 이 biopanning 프로토콜의 회로도 그림 1에서 그림입니다. 또한, 프로토콜에 적응 시킬 수 있는 다른 자동화 된 자기 정렬 플랫폼 및 다른 정렬 전략. 벤치탑 자석으로 수동 자기 정렬 성공적으로 입증 되었습니다, 더 복잡 하 고 시간이 걸리는 다운스트림 분석으로 인해 필요한 증가 가양성 14, 이기는 하지만 고 그럼에도 불구 하 고 다른 옵션을 제공 합니다 autoMCS 단계 없는 자동화 된 마그네틱 셀 장치를 정렬 하는 경우 이용하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>마그네틱 비드와 함께 사용하기 위한 자동 세포 분리기</td></tr><tr><td>Luria Broth, Miller (LB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>성장 배지</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>항생제</td></tr><tr><td>한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>증점/겔화제</td></tr><tr><td>eCPX 3.0 박테리아 디스플레이 펩타이드 라이브러리</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td> <td>세포 펩타이드 디스플레이 라이브러리. USCB의 공동 연구자가 제공합니다.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>설탕, 단백질 발현 유도용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 pH 7.4 (PBS)</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>완충액</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>일차 아민에 비오틴 분자 추가</td></tr><tr><td>Pierce 비오틴 정량 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>비오틴 분자가 단백질에 공유 결합되도록 보장</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 비드</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>비오틴 응집 단백질 포획을 위한 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>단백질, 비특이적 결합</td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>당의 차단제로 사용, 성장 및 유도성 단백질 발현 방해</td></tr><tr><td>Ypet, Mona,</td><td>UCSB 및 ARL</td><td>, N/A</td>: <td>eCPX 3.0의 발현 모니터링을 위한 포지티브 컨트롤. 저자와 공동 작업자가 제작했습니다. 참고 문헌 12 및 13 참조.</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS Ester</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>형광단</td></tr><tr><td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate(SAPE)</td>에 대한 단백질 표적 결합용<td>Thermo Scientific</td><td>S866</td><td>Negative control</td></tr>, <tr><td>FACS 기기</td><td></td><td></td> autoMACS 컬럼 실행을 위한 Buffer, 342003 Buffer, BD FACSFlow <td>Becton, Dickinson 및 Company</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>MACS</td></tr><tr><td>분리 autoMACS 실행 버퍼 &ndash; MACS 분리 완충액</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>autoMACS 기기 유지 보수용. 위험: 0.09% 아지드화물 함유.</td></tr><tr><td>autoMACS Pro 세척 솔루션</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>autoMACS 기기 유지 관리</td></tr><tr><td>용 70 % 에탄올</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>autoMACS</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>오염 제거 박테리아 냉동고 재고</td></tr><tr><td>용 Chill 15 랙</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>MACS 분리</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td> BD FACSDiva Software<td>에 대한 펩타이드 결합 평가</td></tr>용 <tr><td></td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>659523</td> Dynabeads MPC-S 자분입자 농축기에 <td>대한 펩타이드 결합 평가</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>마그네틱 비드와 함께 사용하기 위한 벤치탑 세포 분리기</td></tr><tr><td>Colony Sequencing</td><td>Genewiz</td><td>N/A; https://www.genewiz.com/</td> <td>DNA 및 콜로니 염기서열분석 서비스</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>염기서열 분석 매크로</td></tr><tr><td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td>와 함께 사용<td>171</td><td>대표적인 결과를 위한 예시로 사용된 표적 단백질.</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBC 및 ARL</td><td>N/A</td><td>표적 단백질은 대표적인 결과의 예로 사용되었습니다. 저자와 공동 작업자가 제작했습니다. 참고 문헌 1 및 15 참조.</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBC 및 ARL</td><td>N/A</td><td>표적 단백질을 대표적인 결과의 예로 사용했습니다. 저자와 공동 작업자가 제작했습니다. 참고 문헌 1 및 15 참조.</td></tr></tbody></table>

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 biopanning

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 biotic 및 abiotic 목표의 인식에 대 한 펩 티 드 선호도 시 약 발견을 위한 입증 된 기술입니다. 펩 티 드 선호도 시 약 등 감지 치료제, 항 체와 비슷한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다 하지만 더 강력 하 고 더 극단적인 환경에서 수행할 수 있습니다. 관심의 대상 단백질에 펩 티 드 캡처 에이전트의 특정 농축 바인딩 개선 단계를 세척 하 고 따라서 거짓 긍정적인 바인더의 발생을 감소 반자동된 정렬 방법을 사용 하 여 향상 된입니다. 반자동된 정렬 방법은 상용 자동된 활성화 자기 셀 임의의 15-메 르 펩 티 드를 표현 하는 라이브러리를 정렬 무제한 세균성 디스플레이 장치를 정렬 여기 사용에 대 한 설명 이다. 약간의 수정이 메서드는 다른 연장 자동 장치, 다른 정렬 라이브러리 및 다른 유기 체. 이 작품의 주요 목표는 포괄적인 방법론을 제공 하 여 분석 하 고 후보자의 결과 수영장을 최소화 적용 생각 과정을 상세히 설명입니다. 이 기술을 형광 활성화 된 세포 (FACS), 정렬를 사용 하 여 정렬 하는 동안 및 개별 후보자, 비교에 친 화력과 특이성을 평가 하는 셀에 바인딩 분석 등 펩 티 드의 분석 시퀀스 동향을 파악 하 고 이해 하 고 잠재적으로 선호도 관심의 대상에 대 한 특이성을 개선 합의 시퀀스.

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

이 바이오 패닝 절차의 전반적인 목표는 펩타이드 포획 제제를 관심 있는 특정 단백질 표적에 대해 신속하게 분리하고 추가 다운스트림 분석에서 비특이적 후보 물질을 빠르고 효과적으로 제거하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 위협 감지에서 질병 진단에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 강력한 펩타이드 친화성 시약을 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 펩타이드 친화성 시약을 상당한 양의 교육 없이 약 1주일 만에 빠르게 분리할 수 있다는 것입니다.이 방법은 세포 외 사용을 위한 펩타이드 친화성 시약을 발견하는 데 사용할 수 있지만 펩타이드는 살아있는 물질로도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인에게 가장 어려운 측면은 여기에 표시된 실험 프로토콜과 크게 상호 작용하는 후보 물질의 다운스트림 염기서열 분석입니다. Bio-panning 박테리아 디스플레이 라이브러리는 비드 물질 또는 부착된 포획 단백질에 대한 비특이적 결합제를 제거하기 위해 마그네틱 비드 자체에 대한 negative sorting으로 시작하는 주기적 프로세스입니다.마그네틱 비드와 결합하지 않는 음의 분획은 유지되어야 합니다. 잠재적인 교차 반응성 단백질 표적에 대해 추가적인 negative sorting을 수행할 수 있으며, magnetic beads에 결합하지 않는 negative fraction은 다시 유지됩니다. 후속 positive sorting 단계는 단백질 타겟에 대한 negative sorting과 매우 유사하지만, 이번에는 마그네틱 비드 결합 positive fraction이 유지됩니다.박테리아 디스플레이 라이브러리의 양성 분류를 위해 먼저 클로람페니콜 또는 LBCM-25가 보충된 Luria Broth Miller 500ml를 음성 분류에 의해 원치 않는 펩타이드가 미리 고갈된 다양한 박테리아 디스플레이 분류 라이브러리의 11번째 세포의 약 10배에 접종합니다. 배양액이 0.5 - 0.55의 OD 600에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 225RPM으로 라이브러리를 배양합니다. 그런 다음 0.04%L-arabinose로 진탕과 함께 섭씨 37도에서 45분 동안 펩타이드 발현을 유도합니다.유도 시간이 끝나면 배양물을 얼음 위에 놓습니다. 그리고 원심분리에 의해 11번째의 세균 세포를 2배 10번 수집합니다. 펠릿을 1.5ml의 PBS에 부드럽게 소용돌이치며 다시 현탁시킵니다.그리고 두 번째 원심분리에 필요한 만큼 박테리아를 여러 개의 마이크로 원심분리 튜브로 분할합니다. 관심 있는 비오틴화 표적이 보충된 1ml의 PBS에 펠릿을 다시 현탁시켜 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 45분 동안 배양합니다. 그 동안, 100마이크로리터의 스트렙타비딘으로 인코딩된 비드를 1mm의 PBS에 넣고 원심분리를 통해 소 혈청 알부민(BSA)을 보충합니다.세척된 비드를 벤치탑 자성 입자 분리기에 놓고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 슈퍼 나덴트를 조심스럽게 제거합니다. 회전 배양이 끝나면 세포를 원심분리하여 슈퍼 나덴트에서 결합되지 않은 표적을 수집하고 표적 단백질 결합 박테리아 세포 펠렛을 PBS plus BSA 1밀리리터에 다시 현탁시킵니다. 전체 박테리아 세포를 사용하여 비드 펠릿을 다시 현탁시킵니다.섭씨 4도에서 회전 플랫폼에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 구슬과 박테리아 용액을 얼음 위에 놓습니다. 자동 최대 기기를 켜서 시스템을 초기화하고 분리 메뉴에서 지금 세척, 헹굼 및 실행을 선택하여 제조업체의 세척 및 실행 버퍼로 라인을 각각 프라이밍합니다.세척이 끝나면 PBS와 BSA 버퍼를 사용하여 라인을 한 번 더 프라임합니다. 기기가 준비되면 박테리아와 비드 혼합물을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 추가로 500마이크로리터의 새 PBS와 BSA로 튜브를 헹굽니다. 박테리아와 비드 혼합물이 담긴 세척액을 당겨 튜브를 섭씨 4도의 원추형 튜브 랙의 샘플 슬롯에 넣습니다.빈 15ml 수집 튜브를 랙의 양극 및 음극 선택 슬롯에 넣고 랙을 기기 플랫폼으로 옮깁니다. 랙의 각 샘플에 대해 분리 프로그램을 할당하여 각 샘플 사이와 마지막 샘플 뒤에 헹굼 단계를 추가합니다. 실행을 선택하여 셀 분리를 시작하고 확인을 선택하거나 계속하여 충분한 버퍼를 사용할 수 있는지 확인합니다.프로그램이 완료되면 랙을 제거하고 박테리아와 구슬이 모두 포함된 양극 분획을 얼음 위에 놓습니다. 방금 시연한 대로 제조업체의 실행 및 세척 버퍼를 사용하여 라인을 프라이밍한 후 전원 및 예를 선택하여 기기를 종료하고 오염 제거를 위한 저장 용액 병에 70% 에탄올이 있는지 확인합니다. 시스템 종료가 완료되면 병이 보라색으로 바뀝니다.기기를 끌 수 있습니다. 그런 다음 전체 양성 분류 분획을 사용하여 D 포도당이 보충된 LBCM25 1리터를 섭씨 37도에서 야간 배양에 진탕과 함께 접종합니다. 각 분류 라운드 후 친화성 시약 분리 성공을 분석하기 위해 분류 후 펩타이드 유도가 끝날 때 표와 같이 25마이크로리터의 용액에 5마이크로리터의 유도 세포를 추가합니다.얼음에서 45분 동안 배양한 후 원심분리로 각 용액의 박테리아를 수집하고 각 샘플에서 슈퍼 나덴트를 흡인합니다. 샘플 튜브가 얼음 위에 있는 상태에서 FAX 기기 소프트웨어에서 관리자를 선택하고 해당 분석 폴더를 엽니다. 새 실험을 클릭합니다.그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 실험의 이름을 바꾸고 전역 워크시트를 클릭합니다. 글로벌 워크시트 스프레드시트에서 점 그림 아이콘을 클릭하여 새 산점도를 만듭니다. 그런 다음 도트 플롯 그래프 자체를 선택하고 검사기 아이콘을 선택합니다.열린 창에서 X축과 Y축 옆에 있는 상자를 클릭하여 축을 이중 지수 디스플레이로 조정하고 검사기 창을 닫습니다. 실험을 클릭하고 새 표본을 만들고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 실험적으로 적합한 표본의 이름을 바꿉니다. 그런 다음 더하기 기호를 클릭하여 표본을 확장하고 표본의 이름을 바꿉니다.음성 대조군 샘플을 실행하려면 PBS 전용 펠릿을 피펫으로 잘 혼합된 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 FAX 실행 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 샘플을 FAX 튜브로 옮기고, 튕겨서 용액에 세포를 유지하고, 샘플을 기기의 샘플 주입 튜브 또는 SIT에 로드합니다. 현재 샘플 튜브를 두 번 클릭하고 수집된 데이터를 클릭합니다.그런 다음 이전에 준비된 측면 산란 영역 대 전방 산란 영역 점도표의 이벤트를 표시하고, 필요에 따라 임계값 탭 아래의 광 승수 튜브 전압 임계값을 조정하여 네거티브 컨트롤 셀이 중앙 근처에 놓이도록 합니다. 샘플이 제대로 읽히면 초당 200-2, 000 이벤트를 표시하도록 유속을 조정하고 레코드 데이터를 클릭하여 최소 10, 000 이벤트를 캡처합니다. 모든 이벤트가 획득되면 SIT에서 샘플 튜브를 제거합니다.polygon gate 아이콘을 선택하고 산점도에서 대부분의 셀 모집단 주위에 gate를 그립니다. 점도표를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 인구 계층 표시를 선택하고 인구 계층에서 P1을 클릭한 다음 P1 인구를 표시하는 새 점도표를 만듭니다. 각 축을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Y축을 FITC 영역으로, X축을 전방 산란 영역으로 변경하고 축을 이중 지수 표시로 조정합니다.폴리곤 게이트를 사용하여 모집단의 위쪽과 왼쪽 주위에서 음의 제어 셀을 가능한 한 밀접하게 게이트하고, 모집단 계층에서 P2를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 게이트 반전을 선택합니다. 인구의 1% 미만이 게이트 밖으로 떨어져야 합니다. P2 게이트가 있는 점도표를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 모집단 표시를 선택하고 표시할 P2 모집단이 아닌 P2 모집단을 선택합니다.그런 다음 P2 게이트가 있는 점 그림을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Create statistics view(통계 보기 만들기)를 선택하고 통계 보기 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 edit statistics view(통계 보기 편집)를 선택합니다. populations 탭에서 P1 상위 모집단을 포함하여 모집단을 적절하게 추가하거나 제거합니다. P2가 아닌 P2가 이미 표시되어 있어야 합니다.그런 다음 통계 탭에서 FITC 영역, 매체 및 기타 관심 있는 통계를 추가하고 확인을 클릭하여 창을 닫습니다. P2 산점도를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 선택하여 PE 영역과 FSC 영역에 대한 유사한 도트 플롯 그래프를 만듭니다. Y축을 조정하고 PBS만 표본을 사용하여 P3 모집단을 게이트합니다.그런 다음 게이트를 반전시킵니다. 그리고 적절한 모집단을 표시합니다. 모든 적절한 게이트가 설정되면 스프레드시트를 사용하여 튜브당 약 10, 000개의 이벤트를 기록하는 모든 샘플을 실행합니다.이 대표적인 실험에서와 같이, Ypet Mona가 고정 양성 대조군 펩타이드에 결합하면 집단 내 유도 펩타이드 라이브러리의 발현 수준을 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표면에 표시된 펩타이드가 없는 세포는 일반적으로 3차 및 4차에서 관찰된 바와 같이 분류 과정 중에 제거됩니다. 특정 관심 대상에 결합하는 펩타이드에 대한 라이브러리의 농축은 일반적으로 3번의 positive sorting round 내에서 달성됩니다.4차 분류를 계속하는 것은 3차에서 이미 존재하는 가장 높은 친화성 펩타이드 염기서열이 4차에서 더욱 농축되어 잠재적인 후보 물질을 하향 선별하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 도움이 될 수 있습니다. 특이성은 의도된 표적에 대한 결합을 negative sorting에 사용된 것과 같은 잠재적인 교차 반응 표적에 대한 결합과 비교하여 평가됩니다. 4차 정렬의 염기서열 분석은 일반적으로 친화도 및 특이성 분석을 위한 훌륭한 시작점이 되는 반복 염기서열을 보여줍니다.반복 서열의 서열 정렬 분석을 사용하여 후보 물질을 하향 선택하는 데 도움이 될 수 있는 합의 서열의 존재를 밝힐 수 있습니다. 그런 다음 각 반복 염기서열에서 대표되는 콜로니를 세포 내 친화도 및 특이성의 사실에 의해 추가로 분석하여 표적 및 교차 반응성 단백질에 대한 펩타이드 결합을 평가할 수 있습니다. 일단 마스터되면 초기 친화도 및 특이성 분석을 통한 전체 바이오 실험을 적절하게 실행할 경우 2주 이내에 수행할 수 있습니다.전체 절차를 수행할 때 결합 친화력과 관련된 통과를 완전히 이해하기 위해 결합 평가와 염기서열 분석을 여러 번 번갈아 가며 수행해야 할 수도 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 펩타이드 분석의 대부분을 자동화하고 후보 물질 선택을 더욱 간소화하기 위해 개발한 추가 매크로 파일이 포함되어 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 박테리아 디스플레이 라이브러리에서 펩타이드 포획 시원제를 신속하게 분리하는 방법과 추가 다운스트림 분석에서 비특이적 후보 물질을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 따른 후 ALIZA와 같은 다른 방법을 수행하여 세포 결합 친화도 및 특이성을 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 T7 파지 표시 펩타이드 라이브러리의 QCM 바이오센서 기반 바이오패닝을 사용하여 단백질-약물 상호작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. QCM 바이오센서에 특정 펩타이드를 표시하는 파지의 바이오패닝을 통해 친화성이 높은 펩타이드를 특이적으로 분리한 다음 아미노산 염기서열분석을 수행하여 표적 단백질의 특정 상호 작용 부위를 식별할 수 있습니다.

Quartz-Crystal Microbalance 바이오센서 기반 바이오패닝으로 단백질-약물 상호작용 연구

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

방법은 항원 동시에 수백 대해 파지 디스플레이 조합 항체 라이브러리의 합성 확장, 고 스루풋 선택을 수행하기위한 시각적 반주하여 설명한다. 이 병렬 접근 방식을 사용하여, 우리는 표준 면역의 기능적인 다양한 항원에 대한 높은 친화력과 특이성을 나타내는 항체 단편을 격리했다.

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세포 내 단백질 접힘에 대한 고유한 품질 관리 메커니즘을 가진 Escherichia coli twin-arginine translocation pathway를 사용하여 항체 단편 라이브러리에서 결합 친화도 및 세포질 용해도를 동시에 스크리닝하여 내막에 항체 단편을 표시하는 방법을 제공합니다.

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여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

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여기서 우리는 특정 표적 펩티드를 바이오티게팅하는 대장균 비오틴 단백질 리가제 BirA의 신규한 변이체를 선택하는 방법을 제시한다. 프로토콜은 표적 펩티드의 세균 디스플레이를 위한 플라스미드의 생성, BirA 라이브러리의 생성, BirA 변이체의 선택 및 특성화에 대해 설명한다.

새로운 생물항제 효소 선택을 위한 박테리아 펩타이드 디스플레이

임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

이 연구는 약물 펩티드 상호 작용을 식별하기위한 전략을 제시하는 것을 목표로했다. 이 전략은 석영 결정 마이크로 밸런스 (QCM) 바이오 센서에 기초한 약물 인식 짧은 펩타이드의 바이오 패닝을 포함하고, 단백질에 대한 약물 인식 및 약물 결합 부위의 음장 에 대해 얻은 정보를 정량적으로 평가하기위한 생물 정보학 분석이 뒤따릅니다.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

배우세요 세균 디스플레이 라이브러리를 이용한 반자동 바이오패닝으로 특이적 펩타이드 친화성 시약을 신속하게 분리하는 방법입니다. 비특이적 결합자를 효과적으로 제거하여 진단 및 생물학적 탐지에 활용할 수 있습니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

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