파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

이 확장 가능한 절차의 전반적인 목표는 수백 개의 항원 표적 도메인에 대해 병렬 선택을 가능하게 하는 고처리량 접근법을 사용하여 파지 표시 라이브러리에서 특이적이고 친밀도가 높은 팹 파지 클론을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 정제된 항원 도메인을 마이크로 웰 플레이트에 고정화함으로써 달성됩니다. 다음 단계는 연속적인 선별 라운드에서 마이크로플레이트 고정 항원에 특이적으로 결합하는 팹 파지 클론을 노출, 캡처, 방출 및 증폭

이 과정에서 각 단계에서 풀링된 방법을 사용하여 선택의 효과를 모니터링합니다. 마지막 단계는 분리된 fab 클론의 특이성, 친화도 및/또는 활성을 평가하는 것입니다. 궁극적으로, 많은 수의 항원에 대한 특이적 고친화성 fab fragments가 병렬로 분리되어 구조적 또는 기능적으로 관련된 단백질의 전체 클래스를 분석하는 데 유용한 항체를 생성할 수 있습니다.

이 방법의 중요성은 학술 또는 산업 실험실에서 한계를 극복하고 기존 항체 개발 기술의 속도를 가속화하는 데 도움이 될 수 있는 대안을 제공한다는 점에 있습니다. 하이브리도마와 같은 기존 항체 개발 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 동물을 사용할 필요가 없다는 것입니다. 독성 및 비면역원성 단백질을 포함한 거의 모든 단백질에 사용할 수 있습니다.

앞으로 살펴보겠지만, 이 항체는 쉽게 병렬화될 수 있으며 궁극적으로 특정 항원에 특이적인 높은 친화성 항체를 암호화하는 재생 가능한 재조합 DNA를 6주에서 8주 이내에 얻을 수 있습니다. 생물의학 연구에서 항체의 중요성을 감안할 때, 우리는 항원 생성과 항체 선택 및 식별을 고처리량 접근 방식에 적응하고 확장하는 동시에 규모와 가용 자원 모두에서 다양한 실험실에 대한 접근성을 유지할 수 있는 기회를 보았습니다. 파지 선별 당일 아침에 T one 파지 내성 대장균 세포의 단일 콜로니를 선택합니다.

테트라사이클린이 함유된 2개의 yt 매체 밀리리터에 50마이크로그램으로 첨가합니다. 군체가 2.5cm 궤도 쉐이커에서 200RPM으로 흔들면서 배양하도록 합니다. 배양액의 성장이 시각적으로 분명해지면 테트라사이클린이 보충된 필요한 양의 배지로 세포를 옮깁니다.

선택 웰당 100마이크로리터 또는 96개당 약 10밀리리터에 충분해야 합니다. 웰 플레이트는 배양의 부분 표본을 탄소 페니실린과 캐닌 보충 매체 모두로 확장합니다. 이러한 배양은 증폭에 사용되는 세포의 사전 감염을 방지합니다.

배양의 광학 흡광도가 595나노미터에서 0.4 - 0.8에 도달할 때. 5-7시간이 지나면 세포가 항원 플레이트에 적용할 준비가 됩니다. 이 프로토콜이 라이브러리의 원하는 적용 범위를 보장하려면 충분한 복제 항원 플레이트와 비특이적 대조 단백질 플레이트를 준비합니다.

표시된 계산을 사용하여 세부 정보가 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 표적 및 비특이적 대조 단백질을 밤새 고정한 후 플레이트에서 단백질 용액을 제거합니다. 200마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하고 1시간 동안 흔들면서 차단하고 세포가 성장하는 동안 파지 라이브러리를 추가하기 전에 플레이트를 4회 세척합니다.

파지 선택 당일, 100마이크로리터의 파지 라이브러리를 negative selection plate로 전송하여 negative selection을 추가하여 라이브러리에서 비특이적 또는 태그 특이적 결합 파지로 표시된 FAB 클론을 사전 투명화합니다. 과도한 용해성 친화성 태그를 추가하여 태그 결합 파지를 제거합니다. 이렇게하려면 각각에 10 마이크로 몰의 최종 용해성 GST 농도를 추가하십시오.

그런 다음 실온에서 셰이커에서 1-2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 플레이트에서 타겟 단백질 플레이트 흡입 단백질 용액을 준비하려면 200마이크로리터의 차단 버퍼를 추가하고 1시간 동안 흔들어 차단하고 파지 라이브러리를 추가하기 전에 4회 세척합니다. 배양 후 플레이트에서 파지 스내트를 수집합니다.

96채널 Liquid Handler를 사용하여 파지 supinate를 항원 코팅 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 실온의 셰이커에서 1-2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 PT 완충액을 사용하여 웰을 8-15회 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거합니다.

이것은 수동으로 또는 자동 플레이트 세척기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 그런 다음 세포를 추가하기 직전에 세포와 항원 플레이트가 준비되면 여분의 세척 버퍼를 모두 제거합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 성장 세포를 추가하여 파지를 용리시키고 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

처음 몇 차례의 선별 과정에서는 상당한 농축이 이루어지지 않을 것으로 예상되지만, 출력 파지 역가의 정량화는 성공적인 선별에 필요한 최소 파지 농도의 환상을 보장할 수 있습니다. 이를 위해 헬퍼 파지를 추가하기 전에 세포의 분취액을 제거하여 항생제가 보충된 한천 플레이트에서 세포의 연속 희석액을 준비하고 도금하여 파지 출력을 더 타이트하게 할 수 있습니다. 30분 동안 배양한 후 M 13 K oh seven helper phage를 각 웰에 첨가하여 밀리리터당 100억 콜로니 형성 단위의 농도를 높입니다.

플레이트를 45분 더 배양하고 이번에는 200RPM으로 흔듭니다. 다음으로, 웰당 1.2ml의 보충된 2개의 YT 배지를 포함하는 V 바닥이 있는 96웰 깊은 웰 블록으로 세포를 옮깁니다. 딥 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 200RPM으로 흔들어 배양합니다.

4, 000 GS에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 판을 회전시켜서 박테리아를 펠릿으로 만드십시오. 그런 다음 각 복제 플레이트에서 파지를 포함하는 동일한 부피의 상층액을 미니 튜브로 이동합니다. 96웰 마이크로플레이트 블루 박스를 풀링된 파지에 대한 후속 선택 라운드의 입력으로 사용하고, 10 XPBT의 10번째 부피를 추가하고 혼합하여 중화합니다.

이제 라이브러리에서 선택 프로세스를 반복합니다. 사전 허가 및 항원 파지 배양 3-4회 이전 선별 라운드에서 증폭된 파지를 사용하여 배양. 이전에 라이브러리 사전 세척 및 항원 파지 배양에서 설명한 바와 같이 밀리리터 항원 또는 대조 단백질당 2마이크로그램으로 코딩된 Eliza Micro 웰 플레이트에 의한 비특이적 대조 단백질의 결합과 비교하여 표적 결합 농축이 관찰될 때까지 이 작업을 수행하고, 그런 다음 차단 및 세척된 항원 및 대조 단백질 코팅 플레이트에 이전과 같이 차단 및 세척하고, 100마이크로리터의 희석된 파지 봉합을 웰에 적용하고, 플레이트를 진탕하여 배양합니다. 실온에서 15분 배양 후 PT 완충액으로 플레이트를 8회 세척합니다.

그런 다음 세척 후 PBT에서 1-5, 000 루티온으로 100 마이크로 리터의 항 M 13 HRP 항체를 각 웰에 30 분 동안 배양하여 항원 결합 파지에 항체가 결합 할 수 있도록합니다. 그런 다음 PT 버퍼로 플레이트를 6 번 세척하고 스트레이트 PBS로 두 번 더 세척하여 100 마이크로 리터의 1-1 TMB 기질을 준비하고 혼합하여 각 웰에 도포합니다. 5분에서 15분 동안 반응하게 하여 상당한 색상 변화가 있을 때 반응을 멈춥니다.

100 마이크로 리터의 1 몰 인산을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 이제 450나노미터에서 웰의 흡광도를 읽고 표적 결합 신호를 농축 후 대조 단백질의 결합 신호와 비교합니다. 개별 클론은 파지 염기서열분석, 자유 fab에 결합된 파지의 DNA 변환, 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 바와 같이 클론 FabuLisa를 사용한 표적에 대한 직접 결합 평가로 특성화할 수 있습니다.

더 높은 처리량이 필요한 실험실의 경우 이 방법론을 확장하고 자동화할 수 있습니다. 이러한 목표를 염두에 두고 차단, 파지, 결합, 엘루시안 등을 포함한 절차의 모든 측면을 자동화하여 선택 용량을 확장할 수 있는 맞춤형 로봇이 개발되었습니다. 항체 선택에 사용할 항원을 얻는 한 가지 방법은 합성 유전자 기술을 사용하여 분리된 단백질 도메인의 발현을 위한 구성물을 얻는 것입니다.

대부분의 경우, 이를 통해 고처리량 발현이 가능하고 선택을 위해 충분히 순수한 순도의 항원을 적절한 양으로 분리할 수 있습니다. 선별 과정의 연속적인 라운드에서, 항원에 특이적으로 결합된 파지의 농도 및 농축을 회피하는 것은 앞서 보여준 바와 같이 파지 적정을 통해 모니터링하거나 파지 풀로 모니터링했습니다. ELA 분석에서 결합 비율이 2보다 크면 일반적으로 특정 결합 클론의 존재를 나타냅니다.

반대로, 비율이 낮을수록 선택 실패의 원인을 파악하는 데 도움이 될 수 있습니다. 발색 아미노 분석을 사용하여 클론 결합을 특성화하면 결합 음성 대조군 단백질과 비교하여 결합 fab 파지 또는 fab를 고정 항원과 비교할 수 있으므로 로봇 액체 처리 장치로 선택을 확장하고 자동화할 때 특이성을 측정할 수 있습니다. 흡수 발색단을 사용하면 유체역학의 특정 채널이 막히거나 밀봉을 잃어버려 부분적인 부피가 전달되는 경우를 감지하는 데 도움이 될 수 있으며, 세척 절차를 최적화하는 동안 문제 해결을 도울 수 있으며, 알려진 결합 클론을 사용하면 세척 중에 백그라운드 결합이 제거되는 동안 표적 결합이 유지됩니다.

또한 효과적인 오염 제거 프로토콜은 연속적인 선택 라운드 또는 다른 선택 절차로 인한 교차 오염이 없음을 보장하며 텍스트 프로토콜에서 추가 문제 해결 매개변수를 검토하는 것이 좋습니다. 이 기술을 산업적 응용으로 확장함으로써 연구자들이 최대 단백질체 커버리지를 달성하는 궁극적인 목표로 친화성이 높은 재생 가능 항체의 선택 및 식별을 가속화함으로써 구조적 또는 기능적으로 관련된 단백질의 전체 클래스를 탐색할 수 있기를 바랍니다.