Name: 포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용하여 포유 동물 세포 내 박테리아의 생존율을 평가하는 방법을. 이 기법은 세포 내 위치에 따른 박테리아 생존 차이를 직접 관찰할 수 있어 감염 연구에 유용합니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기 아샤 스 미르 노프와 Laura Gonyar 감사합니다. 이 작품은 AKCMBJ 보조금 NIH R00 TW008042 및 R01 AI097312는 NIH T32 AI007046에 의해 부분적으로 지원되었다에 의해 지원되었다.

1. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9와 세균 생존 능력을 평가 <ol><li> 그 박테리아를 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> 회 부드럽게 세포를 헹구 0.1 M 3 - (N-모르 폴리 노) 1 mM의 MgCl2를 (MOPS / MgCl2를 2)를 함유하는 프로판 술폰산 (MOPS)의 pH 7.2. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 품어. </li></ol> 참고 : 행동이 관심의 렉틴 또는 항체 (그림 1)에 관계없이 생존의 모든 박테리아를 바인딩 것을 보여주기 위해, 숙주 세포의 부재에서, 라이브와 죽은 세균 제어합니다. <ol start="4"><li> MOPS / MgCl2를 가진 세포를 두 번 씻어. </li><li> 기음 M세포 edia 및 0.5 ㎖ 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가합니다. 라이브 / 죽은 염색 솔루션 MOPS / MgCl2를 5 μM의 SYTO9, 30 μM의 propidium 요오드화, 0.1 %의 사포닌 (최종 농도)입니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 반전의 coverslips는 유리 슬라이드에 얼굴을 아래로하고 명확한 매니큐어로 밀봉. 설치 미디어를 사용하지 마십시오. </li><li> 녹색, 빨강, 및 원적외선 이미지 수집과 호환 필터 세트와 형광 현미경을 이용하여 30 분 이내에 이미지를 획득. </li></ol> NOTE : 종래의 형광 현미경과 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용할 수있다 둘. 30 분 후, 형광 염료가 세균으로부터 새기 시작해야하며 취득한 데이터를 더 이상 정확하다. 이 문서에 표시된 이미지는 Openlab 소프트웨어를 사용하여 하마 오카-ER 디지털 카메라 니콘 이클립스 E800 강직 한 형광 현미경에 인수했다. 650 nm의 663의 발광 필터 - - 알렉사 플 루어 647의 형광은 590 여기 파장 필터를 사용하여 발견 된 735 nm의, 거짓 색 파란색입니다. 580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 요오드화 프로피 듐에서 형광 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTO9의 형광은 465의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. <ol start="10"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 적색 + 청색으로 이미지가 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 빨간색 만 표시, 외부 가능한 박테리아는 녹색 + 청색으로, 내부 가능한 세균은 녹색 나타납니다. 눈으로 외부 생존 할 내부 생존 할 외부 가능한, 내부 가능한 박테리아의 수를 계산합니다. </li><li> 외부 박테리아의 총 수 (기준 외부 생균의 수를 분할함으로써 외부 생균의 퍼센트를 계산 가능한 플러스 nonvi수). 내부 박테리아의 총 수 (가능한 플러스 생존 불가능한) (도 4)에 의해 내부의 생균 수를 나눔으로써 내부 생균의 퍼센트를 계산한다. </li><li> 이 프로토콜을 사용하여 수행 할 수있는 두 가지 중요한 컨트롤이 있습니다. 첫째, 모든 생존 할 박테리아의 propidium 요오드화 양성과 모든 살아있는 박테리아가 SYTO9 양성임을 확인합니다. (모든 호스트 세포의 부재) 박테리아의 중간 대수 문화&gt; 95 % SYTO9 양성해야한다. N.의 중간 로그 문화는 그림 2에 보이는 임질은 라이브 / 죽은 염색 용액을 배양 (10에서 8 식민지 밀리리터 당 단위를 형성). 둘째, 요오드화 프로피 듐 및 SYTO9 모두 permeabilized, 감염된 숙주 세포를 입력 할 수 있음을 확인합니다. <ol><li> 죽은 박테리아의 인구를 생성하려면, 1.5 ML의 microfuge 튜브의 단위를 형성하는 2 × 10 8 세균성 식민지를 수집, 70 % 이소프로판올을 추가하고 10 분 동안 앉아있다. 의 microfuge에 박테리아 펠렛차 잔류 이소프로판올을 제거하기 위해 PBS에 두 번 박테리아를 씻어. 1.7 - 다음에 따라 프로토콜은 1.5 단계를 반복합니다. 유리 슬라이드에 세균 현탁액의 5 μl를 추가하고 coverslip에와 오버레이. 프로토콜 단계 1.9에서와 같이 이미지 샘플. 이러한 조건에서, 인구의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 2)이어야한다. 일부 세균 종에 요오드화 프로피 듐 완전히 SYTO9 염색을 압도하지 않으며, 생존 할 박테리아는 황색 또는 오렌지 나타날 수 있습니다. </li><li> 호중구와 같은 식세포를 들어, 이소프로판올 - 살해 박테리아 세포를 노출하고 세포 내 박테리아의 100 %의 propidium 요오드화 양성 (그림 3)되어 있는지 확인하십시오. 죽은 박테리아를 내면화하지 않을 수 있습니다 nonphagocytic 세포의 경우, 아 지드 화 나트륨 또는 이전에 라이브 / 죽은 염색 솔루션을 추가하는 다른 세포 투과 항균제에 감염된 세포를 치료하기에 충분할 수있다. </li></ol></li></ol> 2. SYTOX GREE와 평가 세균의 생존n 및 DAPI <ol><li> 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 매체 (25)에서 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아. </li><li> DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 세포를 품어. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.5 ml의 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 5 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li&gt; 형광 현미경으로 30 분 이내의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오. </li></ol> 참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 ㎚, 663의 발광 필터 - 735 nm의, 거짓 색 빨간색입니다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다. <ol start="10"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 빨강 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아는 파란색 + 빨간색 표시, 내부 가능한 박테리아는 (그림 4) 블루 나타납니다. 프로토콜 인트의 설명에 따라 외부 및 내부 세균의 비율을 정량화P 1.11. </li><li> 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다. </li></ol> 3. 세포 내 현지화 외에도 세균 생존 능력을 평가 <ol><li> 라벨 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 모스의 정의 중간에 10 ㎍ / ㎖의 DAPI와 관심의 박테리아. </li><li> DAPI 표지 박테리아와 24 - 웰 플레이트에있는 12 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립에 부착되어 세포를 감염. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. </li><li> MOPS / MgCl2를 한 번 세포를 씻어. </li><li> 외부 세균을 검출하기 위해, MOPS / MgCl2를 2, 관심의 세균 종에 결합 알렉사 플 루어 647-결합 항체 또는 렉틴과 어둠 속에서 실온에서 10 분 알을 품다. 제안 컨트롤 프로토콜 단계 1.3에서 참고 사항을 참조하십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와 세포 두 TI 린스MOPS / MgCl2를 2 MES. </li><li> 0.2 %의 사포닌을 포함 MOPS / MgCl2를 2, 20 분에 대한 관심의 세포 내 마커에 대한 알렉사 플 루어 555-결합 항체와 세포를 품어. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li> 기음 세포에서 미디어와는 MOPS / MgCl2를 0.4 μM SYTOX 녹색을 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 세포에게 5 분을 품어. </li><li> MOPS / MgCl2를 셀을 두 번 씻어. </li><li> 5 분 MOPS / MgCl2를 세포를 한 번 씻으십시오. </li><li> 형광 현미경에 30 분 이내에 슬라이드의 이미지를 획득. 현미경, 디지털 카메라, 및 수집 소프트웨어의 설명 프로토콜 단계 1.9를 참조하십시오. </li></ol> 참고 : 알렉사 플 루어 647에서 형광이 590 여기 파장 필터를 사용하여 감지되었습니다 - 650 nm의 663의 방출 필터 - 735 nm의, 거짓 색 보라색입니다. 형광 F580 ㎚, 600의 방출 필터 - - 660 nm의 ROM 알렉사 형석 555은 540의 여기 파장을 가진 필터를 사용하여 검출 하였다. 495 ㎚, 515의 방출 필터 - - 555 nm의 SYTOX 녹색에서 형광 465의 여기 파장 필터를 이용하여 검출 하였다. 375 ㎚, 400 ㎚의 장벽 필터 - DAPI에서 형광은 355 여기 파장 필터를 사용하여 검출되었다. <ol start="14"><li> 이 프로토콜은 외부 생존 할 박테리아가 녹색 + 보라색 이미지가 나타날 발생합니다 내부 생존 할 박테리아가 파란색 + 녹색 표시, 외부 가능한 박테리아가 파란색 + 보라색 표시, 내부 가능한 박테리아는 파란색 표시하고, 세포 내 단백질 (그림 4) 빨간색이 나타납니다. 프로토콜의 설명에 따라 외부 및 내부 가능한 박테리아의 PERECENT 1.11 단계를 정량화. </li><li> 프로토콜 단계 1.12에 기재된 제어 DAPI / SYTOX 녹색 염료 조합 (도 2 및 3)으로 수행되어야한다. </li><li> 에실행 가능하고 생존 할 박테리아를 계산에 추가, 관심의 세포 내 마커 colocalization을 긍정적이거나 부정적인 각 박테리아를 분류합니다. </li><li> 생균의 전체 숫자로 colocalized 생균의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생균의 퍼센트를 계산한다. 생존 불가능한 박테리아의 총 수에 의해 생존 할 colocalized 박테리아의 수를 분할함으로써 세포 내 마커 colocalized 생존 불가능한 박테리아의 퍼센트를 계산한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

DNA는 인간의 세포와 내부에 부착 된 라이브 및 죽은 박테리아를 식별 할 수있는 형광 렉틴과 함께 결합과 생존의 염료를 사용하는 두 개의 프로토콜은 여기에서 소개하고 있습니다. 두 프로토콜 효과적으로 사균의 라이브 판별하기 때문에, 사용하는 프로토콜의 선택은 실험의 목표에 의존한다. 제 1 프로토콜은 생존 불가능한 박테리아 그대로 박테리아를 검출하는 SYTO9를 검출 프로피 듐 요오다 이드를 사용한다. 그림 4a에 도시 N.에 감염된 사람의 호중구에 적용되는 프로토콜 1의 대표 이미지입니다 임질. 이러한 염료는 세포 외 N. 인식하는 렉틴, 대두 응집소와 합하고 임질하지만 형광 결합 박테리아 특이 항체는 대안으로서 사용될 수있다. 프로피 디움 요오드에 의한 SYTO9의 배제가 생존 할 박테리아가 빨간색과 실행 가능한 박테리아가 녹색 형광 형광을 만드는 것이므로 프로토콜 1은 쉽게, 개별 박테리아의 생존 능력을 보여준다. Howeve...

동적 상호 작용과 그들이 거주하는 박테리아와 호스트 사이의 공동 발전이있다. 박테리아 부착 소기관, 분비 시스템, 및 / 또는 호스트 식세포 및 비 식세포 그들의 생산적 감염을 활성화 독소를 생산하는 능력을 진화 해왔다. 박테리아는 또한 인식과 숙주 면역 시스템의 항균 활동을 주장해야합니다. 숙주 면역 시스템은 물리적 및 화학적 장벽, 면역 세포, 보체계 및 체액 성 면역의 다른 구성 요소들을 포함하는 선천성 및 적응 구성 요소로 구성된다. 많은 박테리아가 다층 호스트 면역 반응에 의해 살해 및 통관에 민감하지만, 몇 가지 병원성 및 기회 박테리아가 숙주 세포의 다양한 감염 및 숙주 면역 반응 (1)에 의해 허가를 파괴하는 메커니즘을 진화했다. 임균은 세균성 병원체의 한 예입니다 그는 매우 그 사람의 호스트. N에서 지속하도록되어있다. 임질은 쉽게 비뇨 생식기의 기관, 인두, 결막, 그리고 직장의 점막 상피 세포의 내강 표면을 식민지화한다. 식민지 점막 사이트에서 호중구의 풍부한 모집을 트리거합니다. 호중구는 미생물을 죽이는 항균 다양한 공정을 가지고 전문 식세포 있습니다하지만, N. 임질은 호중구 2-5의 존재하에 생존 할 수있다. 같은 N. 같은 방법 세균성 병원균에 대한 이해 임질은, 파괴 억제하고 궁극적으로 일반적으로 적대적 호스트 환경에서 살아 남기 위해 면역 반응을 납치하는 것은 전염성 질병을 퇴치에 대한 새로운 치료법의 개발에 매우 중요합니다. 종종 숙주 세포에서 박테리아의 생존을 조사하는 데 사용 실험 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 카운트 분석법에서, 감염 세포의 집단은 ㅁ하는 세제, 예를 들어 (용해된다무형 문화 유산 박테리아는 박테리아를 해방하는) 저항한다. 해물 희석 한천 기반 미디어에 도금하고, 용 해물의 콜로니 형성 단위는 각 시점 및 / 또는 실험 조건에 대해 열거된다. 이 접근법은 전체 세균 집단의 생존 능력을보고하지만, 세포 내 및 세포 생존을 구별 할 수 없다는 것이다. 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석에 변화가 구체적으로 진핵 생물의 세포막 6 교차하는 항생제 겐타 마이신의 무능력에 따라 세포 내 박테리아의 생존을 측정한다. 그러나이 분석은 겐타 마이신 (또는 유사 진핵 막 impermeant 또 다른 항생제)와 내부 박테리아에 액세스 할 수있는 항생제의 무능력에 의해 살해에 감염되는 박테리아에 의존합니다. 따라서, 겐타 마이신 보호 분석은 모든 세균 종의 검사를 위해 효과적 일 또는하지 않을 수 있습니다 높은 세균의 생존을 검사 할 때이러한 호중구로 pinocytic 세포. (박테리아가 집계 또는 다른 개별 박테리아 세포에서 행동 microcolonies을 형성하는 경우 예) 둘 중 어떤 방법을 사용해도 세포 내 현지화 각각의 박테리아 또는 다른 동작을 보여준다. 각각의 외부 및 내부 박테리아의 생존을 조사하는 또 다른 자주 사용되는 방법은 얇은 단면 투과 전자 현미경 (TEM)이다. 이 방법은 상기 세포 내 마커에 대해 골드 결합 항체로 면역 전자 현미경으로 조사 할 수있는 숙주 세포에서 박테리아의 위치 (예 phagosome에, 세포질 autophagosome)에 관한 정보를 제공 할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나 전자 현미경은 세균의 생존 능력을 평가에 특히 구분하지 않습니다. 포함 된 섹션은 우라 닐 아세테이트, 리드 시트 레이트, 또는 다른 전자 밀도 시약으로 염색과 전자 현미경에 의해 촬영하는 경우, 전자 밀도가 박테리아는 생존과 ELEC 간주됩니다트론 - 루슨트 생존 할 7,8. 그러나이 가정은 심각한 혼란 세포막과 세포질의 결여와 만 죽은 박테리아 때문에 전자 - 루슨트 표시, 세균의 생존 능력을 과대 평가. 또한, 일부 세균 종은 어려운 생존력을 결정하게하는, 성장의 그들의 단계에 따라 전자 밀도의 범위를 표시 할 수있다. 대체 또는 이러한 널리 사용되는 방법에 추가로, 여기에서 우리는에 부착 숙주 세포에 의해 내면화 된 박테리아의 생존을 평가하는 세균 생존 능력을 나타내는 형광 염료의 사용을위한 프로토콜과 이론적 근거를 제공한다. 세포 외 박테리아를 식별하기 위해, 감염된 세포는 최초의 렉틴이나 박테리아의 특정 항체로 형광 시약에 노출되어 있습니다. 감염된 세포는 다음 permeabilized 및 세균 생존을위한 대리로, 성능이 저하 된 막 대 손상과 세균에 차별적으로 액세스 할 수있는 DNA 특정 염료에 노출되어 있습니다. 제 P 있음프로피 디움 요오드는 세포막을 손상하고, 따라서 생존 불가능한 것으로 간주되는 그 박테리아 만이 액세스 할 수있는 동안 rotocol, 막 투과성 염색 SYTO9는 총 세균 집단을 식별합니다. 프로피 디움 요오드 및 SYTO9는 바이오 필름 ​​세균 생존 능력을 평가하는 비병원성 박테리아 병원성 차별, 실행 가능한 수 인성 박테리아 9-12을 열거하는 데 사용되었습니다. SYTOX 녹색 생존 할 인구 만 액세스 할 수있는 동안 두 번째 프로토콜에서, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)는 총 박테리아를 식별합니다. 이들 생존 염료 쌍은 박테리아 세포 내 현지화를 정의하는 예를 들어, 관심있는 단백질과 관련하여, 각 세균의 위치를​​ 결정하기 위해 면역 형광과 결합 될 수있다. 이러한 분석법의 사용은 숙주 세포의 감염시 세균 살상 또는 생존을 초래할 상호 작용에 대한 통찰력을 제공한다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생존을 평가하기 위해 사용되었다호중구 된 phagosomes 5,13,14의 다른 인구를 포함하여 인간의 기본 호중구와 내부에 부착되어 N. 임질. 그러나, 이들 프로토콜은 프로 식세포, 비전문 식세포 및 원생 동물에 15-24 그람 양성 및 그람 음성 세균의 생존 능력을 평가하기 위해 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>혈액 수집을 위한 21 G 3/4 나비 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>367251</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>나트륨 헤파린이 함유된 혈액 채취 튜브 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>관개용 멸균수</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>덱스트란 500</td><td>시그마</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Ricca 화학 회사</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS no Ca2+ 또는 Mg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll 솔루션</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12mm 원형 유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>풀드 휴먼 세럼</td><td>시그마</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>써모 사이언티픽</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 인터루킨-8</td><td>R& D 시스템</td><td>208-IL/CF</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>걸레</td><td>시그마</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 또는 L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 또는 L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>사포닌</td><td>플루카 분석</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX 그린</td><td>라이프 테크놀로지</td><td>스 S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>마우스 anti-CD63</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 항체 라벨링 키트</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계 Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>펜치</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 현재의 프로토콜은 식민지 카운트 분석, 겐타 마이신 보호 분석 및 전자 현미경 (가) 있습니다. 콜로니 수와 겐타 마이신 보호 분석은 전체 세균 집단의 생존 능력을 평가하고 각각의 세균 가능성을 확인할 수 없습니다. 전자 현미경 개별 박테리아의 생존을 결정하고 숙주 세포에서의 지역화에 관한 정보를 제공하는데 사용될 수있다. 그러나 박테리아는 종종 생존 능력의 평가는 어렵게, 전자 밀도의 범위를 표시합니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 분석은 인간의 기본 호중구에 임균의 생존을 평가하기 위해 원래 개발 된, 그러나해야한다어떤 박테리아 숙주 세포의 상호 작용에 pplicable. 이러한 프로토콜은 막 투과 형광 염료 결합 만 액세스 할 수있는 막 투과성 형광 염료 (요오드화 프로피 듐 및 SYTOX 녹색)로, 모든 박테리아를 얼룩 (SYTO9 및 4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 [DAPI), 생존 할 박테리아. 종래 진핵 세포 permeabilization에, 항체 또는 형광 시약을 세포 외 박테리아를 식별하기 위해 추가된다. 따라서 이러한 분석은 진핵 세포와 내부에 부착 박테리아의 생존 능력을 차별. 프로토콜은 또한 개별 박테리아 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 진핵 세포 마커 형광 항체와 조합 생존력 염료를 사용하여 제공된다. 이 문서에서 설명하는 박테리아의 생존 염료 개별 박테리아의 생존 능력을 평가하고 박테리아가 숙주 세포에서 살아 남기 위치에 관한 정보를 제공하기 위해 기존의 미생물 기술에 민감한 보완 및 / 또는 대안의.

설명 된 프로토콜은 N.의 생존을 검사하는 데 사용되었다 임질은 인간의 기본에 노출 된 후 5,26를 호중구. 호중구는 N. 감염된 임질 및 녹색 형광 생존력 염료 SYTO9 및 빨간색 형광 프로피 디움 아이오다 이드 (도 4A)를 사용하여, 한 프로토콜로 처리. 염료는 우선적으로 숙주 세포의 원형질막 아닌 N.을 투과하는 콜레스테롤 sequesters는 사포닌의 존재하에 첨가 임질 막. 그 박테리아의 세포막 콜레스테롤의 높은 금액을 포함하는 경우에 다른 세제 테스트 할 필요가 있습니다. 모든 N. SYTO9와 임질 얼룩하지만, 손상된 세포막 만 박테리아는 프로피 디움 요오드와 얼룩. 프로피 디움 요오드는 SYTO9 형광을 극복, 그래서 살아있는 박테리아는 녹색과 죽은 박테리아가 27 빨간색 표시가 나타납니다. 일부 세균 종에 요오...

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

본 형광 현미경 실험은 숙주 세포와 연관된 개별 박테리아의 생존력을 평가하고, 서로 다른 세포 내 위치에서의 박테리아 생존력을 결정합니다. 먼저, 외부 박테리아를 식별하기 위해 감염된 세포를 박테리아 퍼미에이스(permease)에 특이적인 형광 시약에 노출시키고, 박테리아 막의 무결성을 기반으로 생존 박테리아와 비생존 박테리아를 구별하는 형광 염료 존재 하에 감염된 숙주를 처리합니다. 그 다음, 숙주 세포 내부의 박테리아 위치를 나타내기 위해 감염된 세포를 관심 마커에 결합된 형광 표지 항체와 함께 배양합니다.결과로 얻은 면역형광 이미지를 통해 숙주 세포 내부와 외부의 생존 박테리아 비율과, 세포 내 생존 박테리아 및 비생존 박테리아의 세포 내 소기관 위치를 결정할 수 있습니다. 콜로니 계수법, 젠타마이신 보호 분석법, 전자 현미경 관찰과 달리, 이 방법은 개별 박테리아의 생존력을 직접적으로 평가할 수 있게 해줍니다. 또한, 서로 다른 세포 내 소기관에 위치한 박테리아들의 생존력에 차이가 있는지 확인할 수 있습니다.이 절차는 제 실험실의 대학원생인 Brittany Johnson이 시연하겠습니다. 24웰 플레이트의 원형 유리 커버슬립 상에서 배양된 세포에 대상 박테리아를 첨가하고 원하는 시간 동안 배양하십시오. 감염된 세포를 부드럽게 한 번 헹굽니다. 그런 다음 외부 박테리아를 검출하기 위해 Alexa Fluor 647 결합 항체 또는 박테리아 특이적 렉틴을 첨가하고, 실온의 암소에서 10분 동안 배양하십시오.두 번 헹군 후, 배지를 흡입하여 제거하고 cyto nine과 propidium iodine이 포함된 live dead 염색액 0.5 milliliters를 첨가합니다. 세포를 상온의 암소에서 15분 동안 배양한 다음, mops magnesium chloride로 두 번 헹굽니다. 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 뒤집어 놓습니다.투명 매니큐어로 밀봉합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 30분 이내에 박테리아를 라벨링한 이미지를 획득합니다. mors 정의 배지에 10 µg/mL의 DPI를 첨가하고 실온의 암소에서 20분 동안 배양합니다.이제 부착 세포를 DPI로 표지된 박테리아로 감염시킵니다. 알데하이드나 유기 용매로 세포를 고정하지 마십시오. 세포를 한 번 헹굽니다.그 다음 Alexa Fluor 647 결합 항체 또는 렉틴을 첨가하고 암실 상태의 상온에서 10분 동안 배양합니다. MOPS 완충액으로 두 번 헹군 후, 관심 있는 세포 내 마커에 대한 Alexa Fluor 555 결합 항체를 첨가하고 20분 동안 배양합니다. MOPS 완충액으로 두 번 헹군 뒤, MOPS 염화마그네슘으로 세포를 한 번 세척합니다. 그 후 배지를 흡입하여 제거하고 0.4 µM CytGreen을 첨가하여 암실 상태의 상온에서 세포를 5분 동안 배양한 다음, MOPS 염화마그네슘으로 세포를 두 번 헹굽니다.그런 다음 세포를 세척합니다. MOPS 염화마그네슘 용액으로 5분 동안 한 번 더 세척하십시오. 커버슬립을 뒤집어 유리 슬라이드 위에 얹고 투명 매니큐어로 밀봉한 후, 30분 이내에 형광 현미경으로 슬라이드의 이미지를 획득합니다.본 실험에서는 인간 호중구에 임질균을 감염시켰습니다. Alexa Fluor 647이 결합된 대두 렉틴(soybean lectin)은 세포 외의 임질균을 검출합니다. 그런 다음, 사포닌 존재 하에 녹색 형광 생존 염색약과 적색 형광 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 첨가하였습니다. 사포닌은 콜레스테롤을 격리하여 숙주 세포의 세포막을 우선적으로 투과시키지만, 감염된 세포 내의 임질균 막은 투과시키지 않습니다. 진핵 세포의 핵은 cyto nine과 프로피디움 아이오다이드 모두로 염색됩니다.임질균에 감염된 중성구의 이 이미지들은 생존능 염색약인 cyt talk screen과 dpi를 사용하여 생성되었습니다. propidium iodide 염색약은 형광 현미경의 적색 및 자외선 채널 모두에서 형광을 발하므로 사용하지 않았습니다. 모든 임질균은 dpi로 염색되지만, 막이 손상된 박테리아만 ox green으로 염색됩니다.생존 불가능한 세포 내 세균은 세균 주위를 둘러싼 CD 63 염색 링을 나타냅니다. 이 링은 일차 과립이 해당 파고좀에 농축되어 있음을 나타냅니다. 생존 가능한 세포 내 세균은 CD 63 염색이 나타나지 않으며, 이는 일차 과립이 해당 파고좀에 농축되지 않았음을 나타냅니다.종합하면, 이 데이터는 임질균의 생존력과 1차 과립 음성 파고솜 내 체류 사이의 상관관계를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 숙주 세포 내 박테리아의 생존력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 이러한 세포 소기관을 대상으로 하는 항체를 사용하여 숙주 세포의 서로 다른 구획에 위치한 박테리아의 생존력을 결정할 수 있게 됩니다.

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 mycobacteria의 열거에 대한 대안적인 접근 방식을...

Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

이 기사에서는 두 가지 프로토콜을 제시합니다: 하나는 숙주 내에서 성공적으로 침입하여 생존할 수 있는 혐기성 박테리아를 측정하기 위한 것이고, 다른 하나는 숙주 세포와 상호 작용하는 혐기성 박테리아를 시각화하기 위한 것입니다. 이 연구는 모든 배양 가능한 혐기성 및 모든 진핵 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

바이러스에 감염된 HeLa 세포 단층의 부착을 위한 왕국 간 연관성 및 경쟁(박테리아 및 진균)을 결정하기 위한 방법이 본원에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 원핵생물, 진핵생물 및 바이러스의 여러 조합으로 확장될 수 있습니다.

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

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박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

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단세포 형광 화상 진찰을 사용하여 세균 간 경쟁의 정량화

배우세요 형광 현미경을 이용하여 포유 동물 세포 내 박테리아의 생존율을 평가하는 방법을. 이 기법은 세포 내 위치에 따른 박테리아 생존 차이를 직접 관찰할 수 있어 감염 연구에 유용합니다.

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