포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

본 형광 현미경 실험은 숙주 세포와 연관된 개별 박테리아의 생존력을 평가하고, 서로 다른 세포 내 위치에서의 박테리아 생존력을 결정합니다. 먼저, 외부 박테리아를 식별하기 위해 감염된 세포를 박테리아 퍼미에이스(permease)에 특이적인 형광 시약에 노출시키고, 박테리아 막의 무결성을 기반으로 생존 박테리아와 비생존 박테리아를 구별하는 형광 염료 존재 하에 감염된 숙주를 처리합니다. 그 다음, 숙주 세포 내부의 박테리아 위치를 나타내기 위해 감염된 세포를 관심 마커에 결합된 형광 표지 항체와 함께 배양합니다.

결과로 얻은 면역형광 이미지를 통해 숙주 세포 내부와 외부의 생존 박테리아 비율과, 세포 내 생존 박테리아 및 비생존 박테리아의 세포 내 소기관 위치를 결정할 수 있습니다. 콜로니 계수법, 젠타마이신 보호 분석법, 전자 현미경 관찰과 달리, 이 방법은 개별 박테리아의 생존력을 직접적으로 평가할 수 있게 해줍니다. 또한, 서로 다른 세포 내 소기관에 위치한 박테리아들의 생존력에 차이가 있는지 확인할 수 있습니다.

이 절차는 제 실험실의 대학원생인 Brittany Johnson이 시연하겠습니다. 24웰 플레이트의 원형 유리 커버슬립 상에서 배양된 세포에 대상 박테리아를 첨가하고 원하는 시간 동안 배양하십시오. 감염된 세포를 부드럽게 한 번 헹굽니다. 그런 다음 외부 박테리아를 검출하기 위해 Alexa Fluor 647 결합 항체 또는 박테리아 특이적 렉틴을 첨가하고, 실온의 암소에서 10분 동안 배양하십시오.

두 번 헹군 후, 배지를 흡입하여 제거하고 cyto nine과 propidium iodine이 포함된 live dead 염색액 0.5 milliliters를 첨가합니다. 세포를 상온의 암소에서 15분 동안 배양한 다음, mops magnesium chloride로 두 번 헹굽니다. 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 뒤집어 놓습니다.

투명 매니큐어로 밀봉합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하여 30분 이내에 박테리아를 라벨링한 이미지를 획득합니다. mors 정의 배지에 10 µg/mL의 DPI를 첨가하고 실온의 암소에서 20분 동안 배양합니다.

이제 부착 세포를 DPI로 표지된 박테리아로 감염시킵니다. 알데하이드나 유기 용매로 세포를 고정하지 마십시오. 세포를 한 번 헹굽니다.

그 다음 Alexa Fluor 647 결합 항체 또는 렉틴을 첨가하고 암실 상태의 상온에서 10분 동안 배양합니다. MOPS 완충액으로 두 번 헹군 후, 관심 있는 세포 내 마커에 대한 Alexa Fluor 555 결합 항체를 첨가하고 20분 동안 배양합니다. MOPS 완충액으로 두 번 헹군 뒤, MOPS 염화마그네슘으로 세포를 한 번 세척합니다. 그 후 배지를 흡입하여 제거하고 0.4 µM CytGreen을 첨가하여 암실 상태의 상온에서 세포를 5분 동안 배양한 다음, MOPS 염화마그네슘으로 세포를 두 번 헹굽니다.

그런 다음 세포를 세척합니다. MOPS 염화마그네슘 용액으로 5분 동안 한 번 더 세척하십시오. 커버슬립을 뒤집어 유리 슬라이드 위에 얹고 투명 매니큐어로 밀봉한 후, 30분 이내에 형광 현미경으로 슬라이드의 이미지를 획득합니다.

본 실험에서는 인간 호중구에 임질균을 감염시켰습니다. Alexa Fluor 647이 결합된 대두 렉틴(soybean lectin)은 세포 외의 임질균을 검출합니다. 그런 다음, 사포닌 존재 하에 녹색 형광 생존 염색약과 적색 형광 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)를 첨가하였습니다. 사포닌은 콜레스테롤을 격리하여 숙주 세포의 세포막을 우선적으로 투과시키지만, 감염된 세포 내의 임질균 막은 투과시키지 않습니다. 진핵 세포의 핵은 cyto nine과 프로피디움 아이오다이드 모두로 염색됩니다.

임질균에 감염된 중성구의 이 이미지들은 생존능 염색약인 cyt talk screen과 dpi를 사용하여 생성되었습니다. propidium iodide 염색약은 형광 현미경의 적색 및 자외선 채널 모두에서 형광을 발하므로 사용하지 않았습니다. 모든 임질균은 dpi로 염색되지만, 막이 손상된 박테리아만 ox green으로 염색됩니다.

생존 불가능한 세포 내 세균은 세균 주위를 둘러싼 CD 63 염색 링을 나타냅니다. 이 링은 일차 과립이 해당 파고좀에 농축되어 있음을 나타냅니다. 생존 가능한 세포 내 세균은 CD 63 염색이 나타나지 않으며, 이는 일차 과립이 해당 파고좀에 농축되지 않았음을 나타냅니다.

종합하면, 이 데이터는 임질균의 생존력과 1차 과립 음성 파고솜 내 체류 사이의 상관관계를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 숙주 세포 내 박테리아의 생존력을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 이러한 세포 소기관을 대상으로 하는 항체를 사용하여 숙주 세포의 서로 다른 구획에 위치한 박테리아의 생존력을 결정할 수 있게 됩니다.