포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

이 형광 현미경 검사 실험은 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존력을 평가하고 다양한 세포 내 위치에서 박테리아의 생존력을 결정합니다. 먼저, 외부 박테리아를 식별하기 위해 감염된 세포를 박테리아 투과효소에 특이적인 형광 시약에 노출시키고, 박테리아 투과효소에 특이적인 감염된 숙주를 박테리아 막의 무결성에 따라 생존 가능한 박테리아와 생존 불가능한 박테리아를 구별하는 형광 염료가 있는 상태에서 노출시킵니다. 그런 다음 숙주 세포 내부에서 박테리아가 발견되는 위치를 나타내기 위해 감염된 세포를 관심 마커에 형광 결합 항체로 배양합니다.

그 결과로 생성된 면역형광 이미지는 숙주 세포 내부 및 외부에서 생존 가능한 박테리아의 비율과 생존 가능한 박테리아와 생존 불가능한 세포 내 박테리아의 세포 내 국소화를 결정할 수 있습니다. 콜로니 수 분석, 겐타마이신 보호 분석 및 전자 현미경과 달리 이 방법을 사용하면 개별 박테리아의 생존 능력을 직접 평가할 수 있습니다. 또한 다른 세포 내 구획에 있는 박테리아가 생존력에 차이가 있는지 여부를 밝힐 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 대학원생인 브리트니 존슨(Brittany Johnson)이 원형 유리 커버 슬립에서 배양된 세포에 24개의 웰 플레이트가 관심 박테리아를 추가하고 원하는 시간 동안 배양합니다. 감염된 세포를 한 번 부드럽게 헹굽니다. 그런 다음 Alexa Fluor 6 4 7 결합 항체 또는 박테리아 특이적 렉틴을 추가하여 외부 박테리아를 검출하고 실온의 어둠 속에서 10분 동안 배양합니다.

두 번 헹궈낸 후 배지를 흡인하고 사이토 나인과 프로피듐 요오드가 함유된 살아있는 염색 용액 0.5ml를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 세포를 배양한 다음 걸레 염화마그네슘으로 두 번 헹굽니다. 덮개를 뒤집어 유리 슬라이드에 앞면이 아래로 향하게 합니다.

투명한 매니큐어로 밀봉하십시오. 박테리아를 라벨링하기 위해 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 필터 세트가 있는 형광 현미경을 사용하여 30분 이내에 이미지를 획득합니다. mors로 정의된 매체에 DPI 밀리리터당 10마이크로그램을 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.

이제 부착 세포를 DPI 표지 박테리아로 감염시킵니다. 알데히드 또는 유기 용제로 세포를 고정하지 마십시오. 세포를 한 번 헹굽니다.

그런 다음 Alexa Fluor 6, 4, 7 결합 항체 또는 렉틴을 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 걸레 완충액으로 두 번 헹군 후 관심 세포 내 마커에 Alexa Fluor 5 5, 5 결합 항체를 추가하고 20 분 동안 배양합니다.두 번 후 걸레 완충액으로 RIN을 만들고 걸레 염화 마그네슘으로 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 어두운 곳에서 실온에서 5 분 동안 0.4 마이크로 몰 cyt green 배양 세포를 추가하고 걸레, 염화 마그네슘으로 세포를 두 번 헹굽니다.

그런 다음 세포를 씻으십시오. 걸레에서 염화 마그네슘을 5 분 동안 한 번 더 사용하십시오. 덮개를 뒤집고, 명확한 매니큐어를 가진 유리제 활주에 물개에 얼굴을 아래로 미끄러지고, 형광 현미경에 30 분 안에 활주의 심상을 취득하십시오.

이 실험에서 인간 호중구는 임질에 감염되었습니다. Alexa Fluor 6 4 7 결합 대두 렉틴은 세포외 임질을 감지합니다. 그런 다음 녹색 형광 생존력이 죽고 적색 형광 프로피듐 요오드화물이 사포닌의 존재 하에 첨가되어 콜레스테롤을 격리하여 숙주 세포 원형질막을 우선적으로 투과하지만 감염된 세포의 임질막을 투과하지 않고 진핵 세포핵은 Cyto Nine과 Propidium Iodide로 염색됩니다.

임질에 감염된 호중구의 이러한 이미지는 생존 염료, cyt talk screen 및 dpi를 사용하여 생성되었습니다. 프로피듐 요오드화물 염료는 형광 현미경의 적색 및 자외선 채널 모두에서 형광을 발하기 때문에 사용되지 않았습니다. 모든 임질은 dpi로 염색되지만 손상된 멤브레인이 있는 박테리아만 옥스 그린으로 염색됩니다.

생존 불가능한 세포 내 박테리아는 박테리아를 둘러싼 CD 63에 대한 염색 고리를 가지고 있습니다. 이 고리는 1차 과립이 이 식체에서 농축되어 있음을 나타냅니다. 생존 가능한 세포 내 박테리아는 CD 63에 대한 염색이 부족하여 1차 과립이 phagosome에서 농축되지 않았음을 나타냅니다. 촬영.

이 데이터는 임질의 생존력과 1차 과립 음성 식체(phagosome)에 있는 거주자 사이의 상관관계를 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 숙주 세포에서 박테리아의 생존력을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 이러한 세포 내 구획에 대한 항체를 사용하여 숙주 세포의 다른 구획에 국한된 박테리아의 생존 능력을 결정할 수 있습니다.