형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

본 실험 절차의 전반적인 목표는 선충 숙주 내의 형광 표지된 박테리아 공생 관계를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 접합을 통해 박테리아를 형광 단백질로 표지함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 알을 수확하여 AIC 선충을 분리하는 것입니다.

다음으로, 자연적인 결합을 유도하여 최종적으로 선충 숙주 내에서 박테리아 공생체의 위치를 파악할 수 있도록 AIC 선충을 형광 표지된 박테리아 공생체와 함께 배양합니다. 그리고 형광 현미경을 통해 선충 집단 내에서 이러한 결합이 일어나는 빈도를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 박테리아가 숙주 내 어디에 위치하는지, 그리고 숙주 집단 전체에서 박테리아 보유 분포는 어떠한지와 같은 공생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

박테리아 균주를 하룻밤 동안 배양한 후, 공여체, 수용체 및 헬퍼 균주를 항생제가 없는 영양 풍부 배지에 배양액과 배지의 비율을 1:100으로 하여 계대 배양하고, 각 균주에 적합한 온도에서 mid log 성장 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 그다음, 균주들을 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 합치고 혼합 배양액을 17,900 Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 30 µL의 신선한 배지로 현탁합니다. 이 현탁액을 항생제가 없는 영양 풍부 배지 플레이트에 점적(spot)하고, 현탁액이 마를 때까지 기다립니다.

수용균에 최적이며, 해당되는 경우 공여자 및 헬퍼균이 생존 가능한 온도에서 플레이트를 뒤집어 하룻밤 동안 배양합니다. 이제 스팟 부위를 긁어내어 선택적 항생제 플레이트에 단일 콜로니가 형성되도록 획선 도말함으로써 박테리아의 순수 배양물을 얻고, 분리를 위해 단일 콜로니를 선택합니다. 마지막으로, 생성된 콜로니가 공여 균주가 아닌 수용 공생균인지 확인합니다.

수용체 특이적 표현형의 존재 여부를 스크리닝함으로써 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 촉매 테스트를 수행하여 cino abdi 박테리아를 e coli와 구분할 수 있으며, 형광 플라스미드 단백질에 해당하는 파장 하에서 형광을 확인하여 플라스미드의 존재 여부를 스크리닝할 수 있습니다. 천연 박테리아 공생체를 하룻밤 동안 배양한 후, 박테리아 배양액 600 µL를 8~10개의 10 mm 지질 배지에 도말하고, 습기가 없는 어두운 상태의 25 °C에서 플레이트를 배양합니다.

이틀 후, 500 µL의 배지에 5,000마리의 감염성 유s형 선충(infective juvenile nematodes)을 박테리아 도말 영역에 첨가합니다. 플레이트를 25 °C에서 3일 더 배양한 후, 현미경 슬라이드 위에 20 µL의 물을 떨어뜨립니다. 그런 다음 멸균된 스틱을 사용하여 박테리아 도말 영역에서 소량의 선충을 긁어냅니다.

선충이 헤엄쳐 나올 수 있도록 막대를 물속에 넣습니다. 저배율로 이 슬라이드를 관찰하십시오. 알과 암컷이 보이면 계속 진행하며, 암컷에 알이 들어 있는 경우 플레이트 표면에 수 밀리리터의 물을 붓고 플레이트를 부드럽게 돌린 후, 그 물을 50 milliliter 원심분리관에 붓습니다.

선충이 플레이트에서 떨어져 플레이트 표면에서 더 이상 보이지 않아야 합니다. 선충이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 튜브 상단의 과잉수를 피펫으로 제거하고 깨끗한 물로 다시 채웁니다. 성체 선충을 다시 가라앉히고 과잉수를 한 번 더 피펫으로 제거한 다음, 원심 분리 튜브를 알 솔루션으로 채웁니다.

그 다음, 상온에서 정확히 10분 동안 튜브를 가볍게 뒤집어 섞어줍니다. 혼합 후 즉시 원뿔형 튜브를 브레이크가 켜진 상태로 상온에서 1,250 Gs로 정확히 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 빠르게 따라내고, 피펫팅을 통해 펠렛을 난백 용액으로 재현탁시킨 후 원뿔형 튜브를 신선한 난백 용액으로 채웁니다.

튜브를 3~5회 반전시켜 난현탁액을 잘 혼합한 다음, 방금 보여드린 것처럼 즉시 난세포를 침전시키고 상층액을 따라 버립니다. 피펫팅을 통해 침전물을 misogyny broth 또는 LB로 재현탁한 후, 난현탁액을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다. 이제 15mL 튜브에 LB를 채우고, 앞서 시연한 것과 동일한 신속 단계 기법을 사용하여 배지 내에서 난세포를 3회 세척한 다음, 재현탁된 P nematode 난세포를 µL당 최소 10개의 난세포가 되도록 희석합니다.

알을 5 mL의 LB와 정착 세균 억제 항생제가 포함된 6 cm 페트리 접시에 옮깁니다. 형광 세균의 하룻밤 배양 및 선택 후, 플레이트를 파라필름으로 감싸 최대 4일 동안 보관할 수 있습니다. 멸균된 스틱을 사용하여 600 µL의 세균 배양액을 10 mm 지질 에어레이트에 도포하고, 배양액을 25 °C에서 배양합니다.

이틀 후, 각 지질 플레이트에 선충 알을 500개에서 5,000개까지 분주합니다. 플레이트를 보관해 두었다면, 앞서 시연한 것과 같이 이전에 준비한 박테리아 론(lawn)에 알을 접종하기 전 최소 한 번은 15 milliliters의 LB로 알을 세척하십시오. 그런 다음, 플레이트 가장자리에 솜털 같은 흰색 고리 모양의 감염성 유충이 나타날 때까지 선충-박테리아 공배양물을 습기가 없는 25 degrees Celsius의 암소에서 배양합니다.

감염성 유충이 관찰되면, 지질 한천 배지 플레이트의 뚜껑을 제거하고 플레이트 바닥면을 빈 100 mm × 20 mm 페트리 접시 바닥에 놓습니다. 그 다음 페트리 접시에 작은 플레이트 높이의 약 절반 정도까지 찰 만큼 충분한 양의 물을 채우고, 자손 감염성 유충이 물속으로 나올 때까지 워터 트랩을 배양합니다.

물에서 선충을 수집하거나 적절한 박테리아 런(bacterial lawn)에서 원하는 생애 단계의 선충을 수집한 후, 소량의 ole을 30 µL의 물에 녹여, 선충 샘플 50 µL당 1~2 µL의 마비제를 첨가합니다. 그다음 마비된 선충 샘플 약 20~30 µL를 현미경 슬라이드로 옮기고 샘플 위에 커버슬립을 덮습니다. 광학 현미경을 통해 선충이 시야 내에 있는지 확인합니다.

박테리아의 위치를 확인하기 위해, 광학 현미경 설정 외에 형광 현미경으로 선충을 촬영한 후 이미지를 중첩시키십시오. 박테리아를 찾기 위해 선충의 여러 배율과 시야를 시도해야 할 수도 있습니다.

두 가지 배지에서 배양한 선충 집단의 개체 수를 측정하고 박테리아 공생체의 정착 여부를 평가하였습니다. 통계적 신뢰도를 확보하기 위해, 표에 제시된 바와 같이 샘플당 최소 100마리의 선충을 측정하고 각 범주에 최소 30마리가 포함되도록 하는 것이 가장 바람직합니다. 이 선충들은 지질 한천 배지에서 성장했을 때 약 14.6%, 간 및 신장 한천 배지에서 성장했을 때 68.6%의 정착률을 보였습니다.

다른 선충 및 박테리아 종들은 서로 다른 수준의 군집 형성 능력을 갖는 것으로 나타났습니다. 이 모식도는 Steiner NEMA 암컷의 일반적인 외형을 보여줍니다. 삽입도는 20배 배율에서 관찰한 S fot graphic 암컷의 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지입니다.

삽입도의 검은색 화살표는 질을 나타내며, 흰색 화살표는 육안으로 확인 가능한 알을 나타냅니다. 이 이미지는 40배 배율에서 발달했지만 부화하지 않은 볼트 선충 알을 보여주며, 볼타 선충에서 분리된 이 알들은 10배 배율에서 촬영되었습니다. 첫 번째 이미지에는 Xeno aptus 박테리아와 연관된 Steiner Nima 선충의 대표적인 현미경 이미지가 제시되어 있습니다.

이 합성 이미지를 만들기 위해 Alvin의 선충과 GFP를 발현하는 박테리아 공생체를 연관시켰습니다. 위상차 이미지 위에 형광 이미지를 겹쳐 놓았습니다. 화살표는 감염성 유충 선충 내에 존재하는 박테리아를 나타냅니다.

이 이미지는 GFP를 발현하는 X nla가 포함된 S carpa capsi 유충 선충을 보여줍니다. 이 이미지는 이전 이미지와 유사한 방식으로 제작되었으며, 선충의 장강 전체에 분포하는 녹색 막대 형태로 시각화된 녹색 형광 단백질 표지 박테리아가 포함된 유충 선충을 묘사합니다. 설명된 절차 외에도, 숙주-미생물 결합에 필요한 분자적 기전은 무엇인가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 선충 숙주와 결합하기 전 박테리아 공생체의 유전적 조작과 같은 다른 방법들을 통합하여 활용할 수 있습니다.