형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

이 절차의 전반적인 목표는 선충 숙주 내에서 형광 표지된 박테리아 공감대를 관찰하는 것입니다. 이것은 먼저 접합을 통해 박테리아를 형광 단백질로 라벨링함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 알을 채취하여 AIC 선충을 분리하는 것입니다.

다음으로, AIC 선충은 형광 표지된 박테리아 symbiant와 함께 성장하여 궁극적으로 선충 숙주 내에서 박테리아 symbiant의 국소화를 자연적으로 결합할 수 있도록 합니다. 그리고 선충 집단 내에서 이러한 연관성의 빈도는 형광 현미경 검사에 의해 결정될 수 있습니다. 이 방법은 박테리아가 숙주 내에서 어디에 국한되는지, 숙주 집단 전체에 걸쳐 박테리아 보균의 분포는 어떠한지와 같은 공생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

박테리아 균주, 하위배양, 기증자 수혜자 및 도우미 균주를 배양액 대 배지 1:100의 비율로 항생제가 결핍된 영양이 풍부한 성장 배지로 하룻밤 사이에 성장한 후 중간 로그 단계 성장에 도달할 때까지 각 균주에 적합한 온도에서 배양물을 성장시킵니다. 다음으로, 단일 마이크로 원심분리기 튜브에 균주를 결합하고 혼합 배양물을 17, 900Gs에서 2분 동안 원심분리하고 상등액을 디캔팅하고 펠릿을 30마이크로리터의 신선한 배지에 주입합니다. 그런 다음 항생제 없이 영양이 풍부한 매체 플레이트에 현탁액을 묻히고 현탁액이 건조되면 그 반점을 건조시킵니다.

하룻밤 동안 뒤집힌 플레이트를 수용자 박테리아에 대해 최적인 온도로 배양하고 해당되는 경우 기증자와 도우미에게 허용되는 온도로 배양합니다. 이제 선택적 항생제 플레이트에서 단일 군체에 대한 반점과 줄무늬를 긁어내어 분리를 위한 단일 군집인 박테리아 줄무늬의 순수한 배양을 얻습니다. 마지막으로, 결과 콜로니가 공여체 균주가 아닌 수용자 대칭인지 확인합니다.

수혜자 특이적 표현형의 존재를 스크리닝함으로써. 예를 들어, cino abdi 박테리아는 형광 플라스미드 단백질에 해당하는 파장 아래에서 형광을 확인하여 플라스미드의 존재 여부를 스크리닝하는 촉매 테스트를 수행하여 대장균과 구별할 수 있습니다. 하룻밤 사이에 천연 박테리아 symbiant를 성장시킨 후 600 마이크로 리터의 박테리아 배양을 8-10, 10 밀리미터 지질 폭기 레이트에 퍼뜨린 다음 섭씨 25 도의 수분없이 어두운 곳에서 플레이트를 배양합니다.

2 일 후에, 박테리아 잔디밭에 매체의 500 마이크로리터에 있는 5, 000의 감염성 어린 선충을 추가하십시오. 섭씨 25도에서 3일 동안 플레이트를 배양한 후 20마이크로리터의 물을 현미경 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 멸균 막대기를 사용하여 박테리아 잔디에서 소량의 선충을 긁어냅니다.

선충이 헤엄쳐 갈 수 있도록 막대기를 물 속에 넣으십시오.이 슬라이드를 저배율로 보십시오. 알과 암컷이 보이면 암컷에게 알이 있을 때 계속하고 접시 표면에 몇 밀리리터의 물을 놓고 접시를 부드럽게 휘젓은 다음 50ml 원뿔형 튜브에 물을 붓습니다.

선충은 판에서 떨어져 나와 더 이상 판 표면에서 보이지 않아야 합니다. 선충이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 다음 튜브 상단에서 여분의 물을 파이프로 연결하고 튜브에 깨끗한 물을 다시 채웁니다. 성충 선충이 가라앉도록 하고 여분의 물을 한 번 더 피펫으로 제거한 후 원뿔형 튜브에 난자 용액을 채웁니다.

그런 다음 실온에서 정확히 10분 동안 부드럽게 반전하여 튜브를 혼합합니다. 흔든 후 즉시 브레이크를 켠 상태에서 10, 1Gs 및 실온에서 정확히 250분 동안 원뿔형 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 빠르게 기울이고 피펫팅으로 펠릿을 계란 용액으로 재현탁시키고 원뿔형 튜브에 신선한 계란 용액을 채웁니다.

튜브를 3-5회 뒤집어 난자를 잘 섞은 다음 즉시 계란을 펠릿화하고 방금 그림과 같이 상층액을 디캔팅한 후 혼합합니다. 피펫팅으로 펠릿을 여성 혐오, 육수 또는 LB에 재현탁시킨 다음 계란 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 이제 15 밀리리터 튜브에 lb를 채우고 방금 시연 된 것과 동일한 빠른 단계 기술을 사용하여 국물에 계란을 세 번 씻은 다음 재현 탁 된 P 선충 알을 마이크로 리터 당 최소 10 개의 알로 희석합니다.

5ml의 LB와 집락하는 박테리아에 대한 항생제가 들어 있는 6cm 페트리 접시에 달걀을 옮깁니다. 플레이트는 하룻밤 동안 성장하고 형광 박테리아를 선택한 후 최대 4일 동안 퍼필에 싸서 보관할 수 있습니다. 멸균 스틱을 사용하여 600마이크로리터의 박테리아 배양액을 10mm 지질 폭기액에 펴고 섭씨 25도에서 배양합니다.

2일 후, 500-5, 000 선충 난자를 각 지질 플레이트에 분배합니다. 접시를 보관한 경우 이전에 준비된 박테리아 잔디에 계란을 접종하기 전에 적어도 한 번 시연된 대로 15ml의 LB로 계란을 씻습니다. 그런 다음 감염성 어린 새끼가 플레이트 가장자리에 보송보송한 흰색 고리로 나타날 때까지 섭씨 25도의 수분이 없는 어둠 속에서 선충 박테리아 공동 배양을 배양합니다.

감염성 청소년이 관찰된 경우. 지질 한천 플레이트의 뚜껑을 제거하고 플레이트 바닥을 100mm x 20mm 크기의 빈 페트리 접시 바닥에 놓습니다. 그런 다음 페트리 접시에 작은 접시 높이의 약 절반 높이까지 물을 채우고 자손 감염 청소년이 물 속으로 나올 때까지 물 트랩을 배양합니다.

물에서 선충을 채취하거나 적절한 박테리아 잔디밭에서 원하는 수명 단계에서 올레 몇 알을 30 마이크로 리터의 물에 용해시키고 선충 샘플 50 마이크로 리터당 1-2 마이크로 리터의 이 마비제를 용해시킵니다. 그런 다음 약 20-30마이크로리터의 마비된 선충 샘플을 현미경 슬라이드로 옮기고 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 선충을 관찰하여 선충이 시야에 있는지 확인합니다.

박테리아 국소화를 식별합니다. 광학 현미경 검사 설정 외에도 형광 현미경으로 선충을 촬영한 다음 이미지를 중첩합니다. 박테리아를 찾기 위해 선충의 여러 확대와 견해를 시도해야 할 수도 있습니다.

두 배지의 선충 개체군을 세고 박테리아 symbiant에 의한 집락화를 위해 점수를 매겼습니다. 확실한 통계를 위해서는 표본당 최소 100개의 선충을 세는 것이 가장 좋으며, 표에서 볼 수 있듯이 최소 30개는 각 범주에 속합니다. 이 선충은 지질 한천에서 자랄 때 약 14.6%, 간, 신장 한천에서 자랄 때 68.6% 수준으로 군집화됩니다.

다른 선충과 박테리아 종은 다른 수준의 군집화를 갖는 것으로 나타났습니다. 이 개략도는 Steiner NEMA 암컷의 일반적인 모습을 보여줍니다. 삽입은 20배 배율에서 S fot 그래픽 암의 미분 간섭 대비 이미지를 보여줍니다.

삽입 부분의 검은색 화살표는 외음부를 나타내고 흰색 화살표는 눈에 보이는 난자를 나타냅니다. 이 이미지는 발달했지만 부화하지 않은 볼트 선충 알을 40배 배율로 보여주며, s Volta 선충에서 분리된 이 알은 10배 배율로 이미지화되었습니다. 여기서, Xeno aptus 박테리아와 관련된 Steiner Nima 선충의 대표적인 현미경 이미지가 이 첫 번째 이미지에 나와 있습니다.

Alvin의 선충은 이 합성 이미지를 만들기 위해 GFP를 발현하는 박테리아 symbiant expo와 관련이 있었습니다. 위상차 이미지는 형광 이미지로 오버레이되었습니다. 화살표는 감염성 어린 선충 내에 존재하는 박테리아를 나타냅니다.

이 이미지는 X nla를 발현하는 GFP를 가진 S carpa capsi 어린 선충을 보여줍니다. 이 이미지는 이전 이미지와 유사한 방식으로 구성되었으며, 녹색 형광 단백질로 표시된 박테리아를 가진 어린 선충을 묘사하며, 선충 장 내강 전체에 국한된 녹색 막대로 시각화되었습니다. 설명된 절차 외에도 선충 숙주와 결합하기 전에 박테리아 symbiant의 유전자 조작과 같은 다른 방법을 통합하여 숙주 미생물 결합에 필요한 분자 메커니즘이 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.