Name: 형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 사용하여 Xenorhabdus 박테리아와 Steinernema 선충의 공생 관계를 관찰하는 방법을. 형광 단백질 표지 기술로 박테리아의 숙주 내 분포와 빈도를 정량 분석할 수 있습니다.

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저자는 사용이 프로토콜과 도구의 발전에 기여 Eugenio Vivas, 커트 Heungens, 에릭 Martens, 찰스 Cowles, 다비 설탕, 에릭 Stabb, 그리고 토드 Ciche 감사하고 싶습니다. KEM 및 JMC는 건강의 국립 연구소 (NIH) 국립 연구 서비스 상 T32 (AI55397 &quot;건강과 질병에 미생물&quot;)에 의해 지원되었다. JMC는 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (NSF) 대학원의 연구 활동에 의해 지원되었다. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (IOS-0920631 및 IOS-0950873)의 보조금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
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<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
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<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 선충류 호스트 (그림 1) 내 세균의 광학 감지하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 선충류 호스트 (그림 3)에서 박테리아의 생체 분석 있도록 nematodes의 광학 투명성과 휘황 라벨 박테리아 할 수있는 능력을 활용합니다. 특히,이 방법은 호스트 내에서 세균 현지화를 식별합니다. 박테리아의 존재에 대한 선충류 인구 및 점수를 계산함으로써, 선충류 인구에서 박테리아 식민지의 빈도는 (표 1) 결정될 수있다. 이 방법은 선충류의 호스트와 세균 symbionts 사이의 상호 작용을 연구에 활용 될 수있는 잠재적 인 기술 중 하나입니다. 관련 방법은 세균 symbiont를 분리 axenically nematodes 성장하고, 파트너 25-27 모두를 조작하기 위해 이전에 설명되어 있습니다. 프로토콜은 H 설명오히려이 Xen...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 지질 한천 (무균) </td><td></td><td></td><td> 8g 영양 국물, 15g의 한천, 5g 효모 추출물, 890 ML 물 10 ML 0.2 g / ML MgCl 2. 6H 2 0, 96 ML 옥수수 시럽 솔루션 * 4 ML 옥수수 기름 * 번호판을 붓는 동안 미디어를 저어 * autoclaving 후 살균 성분을 추가 </td></tr><tr><td> 옥수수 시럽 솔루션 (무균) </td><td></td><td></td><td> 7 ML 옥수수 시럽, 89 ML 물 믹스와 압력솥 </td></tr><tr><td> 달걀 솔루션 </td><td></td><td></td><td> 16.6 ML 12 % 차아 염소산 나트륨, 5 ML 5M 코, 80 ML 물 </td></tr><tr><td> Lysogeny 국물 (무균) </td><td></td><td></td><td> 5g 효모 추출물, 10g의 tryptone, 5g 소금, 1 L의 물 믹스와 압력솥 </td></tr><tr><td> Microfuge </td><td> 어부 </td><td> 13-100-675 </td><td> microfuge 튜브를 가지고 모든 microfuge는 작동합니다 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> 15 ML 50 ML 원뿔 튜브를 가지고 대형 테이블 탑 원심 분리기 </td></tr><tr><td> 멸균 60mm X 15mm 페트리 접시 </td><td> 어부 </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML의 원심 분리기 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 100mm X 20mm 페트리 접시 </td><td> 어부 </td><td> 0875711Z </td><td> 표준 배양 접시보다 더 </td></tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> Greiner 바이오 한 &lt;/ TD&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 </td><td></td><td></td><td> 현미경은 형광과 florescent 기능이 호환 필요 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (무균) </td><td></td><td></td><td> 8g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g 그렇단 2 HPO 4 0.24 g KH 2 PO 4 1 L의 물 7.4와 물 1 L과 압력솥의 산도에 조정 </td></tr><tr><td> Microfuge 관 </td><td> 어부 </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ML 1.5 ML 튜브 </td></tr><tr><td> 셰이커 </td><td></td><td></td><td> 액체가 부드럽게 이동하는 원인이 모든 흔드는는 작동합니다 </td></tr><tr><td> Diaminopimelic 산 </td><td> 시그마 </td><td&gt; D-1377 </td><td> 필요한 경우 농도 또는 1 mm까지 미디어를 보완 </td></tr></tbody></table>

형광 현미경을 사용하여 nematodes에 박테리아를 머릿속으로

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses은 두 개 이상의 생물의 함께 사는 삶의 모든 왕국 전역에 널리 퍼져 있습니다. 지구상에서 가장 유비쿼터스 생물의 두 바와 같이, nematodes와 세균은 다양한 종류의 유익 1-3 병원성에 공생 협회의 다양한 배열을 형성하고 있습니다. 하나의 협회는 Xenorhabdus 박테리아와 공생 4의 모델 시스템으로 떠오르고있다 Steinernema nematodes, 사이의 상호 이익 관계입니다. Steinernema의 nematodes은 곤충에게 5 죽이기 위해 세균 symbiont을 사용하여 entomopathogenic 있습니다. 곤충 호스트 사이의 전송을 위해, 박테리아가 선충류의 infective의 청소년 단계 6-8의 장을 식민지화. 최근 몇 가지 다른 선충류 종은 곤충에게 9-13를 죽이고 박테리아를 활용하는 표시되었으며, 조사는 이러한 시스템에 nematodes와 박테리아 사이의 상호 작용을 조사하기 시작했습니다 &lt;&gt; 9 논의하게 될 것입니다. 우리는 현미경으로 볼 nematodes의 광학 투명성을 활용 이내 또는 선충류 호스트에 세균 symbiont의 시각화하기위한 방법을 설명합니다. 박테리아는 형광 현미경하여 시각화를 허용하는 형광 단백질을 표현하는 설계되었습니다. 많은 plasmids는 각각 다른 파장 (예 : 녹색 또는 빨간색), 그리고받는 세균 symbiont에 기증 대장균의 변종에서 plasmids의 활용에 형광 단백질을 인코딩 유전자가 박테리아의 광범위한 성공적으로 수행하는 사용할 수 있습니다. 설명 방법은 Steinernema carpocapsae와 Xenorhabdus nematophila 14 층 사이의 연결을 조사하기 위해 개발되었습니다. 비슷한 방법은 다른 선충류 - 세균 협회 9, 15-18을 조사하는 데 사용하고 접근 방식은 따라서 일반적으로 적용되었습니다. 메트로폴리스석탄 통은 협회와 식민지 14, 16, 19 과정의 성격에 통찰력을 제공, 개발의 여러 단계에서 nematodes에서 박테리아의 존재 및 현지화의 특성 수 있습니다. 현미경 분석은 조직 14, 16, 19-21를 호스팅하는 박테리아의 인구 및 현지화에서 식민지 주파수를 모두 보여줍니다. 여기에는 sonication 22 또는 식민지의 평균 수준을 제공 할 수있는 23, 연삭 등의 선충류의 인구, 내 세균을 모니터링하는 다른 방법에 비해 장점이지만, 예를 들어,있는 인구에서 낮은 symbiont로드의 높은 빈도로 인구 차별하지 않을 수 있습니다 높은 symbiont로드의 낮은 주파수. 식민지의 phenotypes 21 세균 돌연변이를 검사하거나 특성화 때 주파수 및 colonizing 박테리아의 부하를 차별하는 것은 특히 중요 할 수 있습니다24. 사실, 형광 현미경은 식민지 17, 18의 결함에 대한 세균의 돌연변이의 높은 처리량 검사에 사용하고, sonication 22, 25-27 및 개인 선충류의 해부 28, 29 등의 다른 방법보다 덜 힘든 것입니다되었습니다.

사이의 mutualism을 공부하려면<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; 박테리아와<em&gt; Steine​​rnema</em&gt; nematodes, 방법은 세균의 존재와 nematodes 내 위치를 모니터링하기 위해 개발되었습니다. 다른 시스템에 적용 할 수있는 실험 방법은, 엔지니어링 박테리아가 투명 선충류에서 형광 현미경 박테리아를 사용하여 녹색 형광 단백질과 시각화를 표현하는 수반.

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

둘 이상의 생물이 함께 살아가는 공생은 모든 생물계 전반에 걸쳐 널리 퍼져 있습니다. 가장 어디에나 존재하는 생물 중 두 가지인...

본 절차의 전반적인 목표는 선충 숙주 내에서 형광 표지된 박테리아 공생 관계를 관찰하는 것입니다. 이는 먼저 접합을 통해 박테리아를 형광 단백질로 표지함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 알을 수확하여 AIC 선충을 분리하는 것입니다.다음으로, AIC 선충을 형광 표지된 박테리아 공생균과 함께 배양하여 자연적인 결합을 유도하고, 최종적으로 선충 숙주 내에서 박테리아 공생균의 위치를 파악합니다. 그리고 형광 현미경을 통해 선충 집단 내에서 이러한 결합이 일어나는 빈도를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 박테리아가 숙주 내 어디에 위치하는지, 그리고 숙주 집단 전체에서 박테리아 보유 분포가 어떻게 되는지와 같은 공생 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.박테리아 균주를 하룻밤 동안 배양한 후, 항생제가 없는 영양 풍부 배지에 공여균, 수용균 및 헬퍼 균주를 배양액 대비 배지 비율 1:100로 계대 배양하고, 각 균주에 적합한 온도에서 대수 증식기 중간 단계에 도달할 때까지 배양합니다. 다음으로, 각 균주를 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 혼합하고 17,900 Gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 펠렛을 30 µL의 신선한 배지로 현탁합니다. 그런 다음 항생제가 없는 영양 풍부 배지 플레이트에 현탁액을 점적하고, 현탁액이 완전히 마를 때까지 기다립니다.수용균에 최적이고, 해당되는 경우 공여균 및 헬퍼균이 생존 가능한 온도에서 플레이트를 뒤집어 밤새 배양합니다. 이제 스팟 부분을 긁어내어 선택적 항생제 플레이트에 단일 콜로니가 형성되도록 스트리킹하여, 분리를 위한 단일 콜로니의 순수 배양균을 얻습니다. 마지막으로, 생성된 콜로니가 공여 균주가 아닌 수용 심비언트(symbiant)인지 확인합니다.수용체 특이적 표현형의 존재 여부를 스크리닝함으로써 확인합니다. 예를 들어, 카탈레이스 테스트를 수행하여 cino abdi 박테리아를 e coli와 구별할 수 있습니다. 형광 플라스미드 단백질에 해당하는 파장에서의 형광을 확인하여 플라스미드의 존재 여부를 스크리닝합니다. 천연 박테리아 공생체를 하룻밤 동안 배양한 후, 박테리아 배양액 600 µL를 8~10개의 10 mm 지질 아가 플레이트에 도말하고, 25 °C의 어두운 곳에서 습기가 없는 상태로 플레이트를 배양합니다.이틀 후, 500 µL의 배지에 5,000마리의 감염성 유충(infective juvenile) 선충을 박테리아 층에 첨가합니다.

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우리는 사는 표피를 시각화하는 방법을...

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

이 비디오는 형광 태그가 지정된 뉴런이 있는 Caenorhabditis elegans에 대한 테스트 화학 물질의 신경 퇴행성 효과를 평가하는 방법을 보여줍니다. 정상 뉴런은 온전한 체세포와 돌기의 밝은 형광을 보이는 반면, 형광 감소, 부풀어 오른 소마, 단속된 돌기는 신경 퇴행을 나타냅니다.

Caenorhabditis elegans 뉴런에 대한 살충제의 영향 연구

이 비디오는 적색 형광 단백질로 표지된 프리온 유사 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 생체 내 이미징 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 컨포칼 현미경 검사를 위해 아가로스 패드에 선충을 고정시켜 세포 내부 및 세포 간 단백질 응집 및 이동을 밝히는 것입니다. 이 기술은 neurodegenerative 질병과 관련있는 단백질 응집을 공부하기를 위해 결정적입니다.

형질전환 선충에서 프리온 유사 단백질의 세포 간 확산을 모니터링하기 위한 타임 랩스 이미징

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

형광 일생 화상 진찰은 생활, 노화 및 응력 C. elegans 질병 모형에 있는 단백질의 집합 경향을 정량화하고 구별합니다.

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.

포토컨버터블 덴드라2를 사용하여 노화 C. 엘레간스의 단백질 회전율의 생체 내 정량화

젊은 성인 Caenorhabditis elegans 선충류는 2-24 시간 동안 상업적 살충제 또는 기타 독성 물질의 농도에 노출됩니다. 이어서, 상이한 뉴런은 형광-발현 균주를 사용하여 가시화될 수 있다. 이 논문은 선충류를 살충제에 노출시키고 뉴런 손상을 평가하는 방법을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans Neurons에 대한 살충제의 영향 조사

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

배우세요 형광 현미경을 사용하여 Xenorhabdus 박테리아와 Steinernema 선충의 공생 관계를 관찰하는 방법을. 형광 단백질 표지 기술로 박테리아의 숙주 내 분포와 빈도를 정량 분석할 수 있습니다.

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

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