라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

이 현미경 기반 접근 방식의 전반적인 목표는 박테리아 세포가 성장하는 동안 중앙 과정을 관찰하는 것입니다. 이 방법을 사용하면 박테리아 세포의 성장과 분열 중에 필수 과정이 어떻게 조정되는지와 같은 세균학의 중요한 질문을 해결할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 시약을 사용하여 살아있는 세포의 박테리아 세포 표면과 구조를 시각화할 수 있다는 것입니다.

여기에서는 이 방법을 사용하여 Agrobacterium tumefaciens의 필수 프로세스에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 이 과정은 다른 박테리아에도 채택되어 성장을 연구할 수 있습니다. 먼저 멸균 나무 막대기 또는 피펫 팁을 사용하여 A.Tumifaciens의 야생형 또는 돌연변이 균주의 단일 콜로니를 3ml의 ATGN 성장 배지에 접종합니다.

하룻밤 동안 섭씨 28도, 225RPM에서 배양물을 성장시킵니다. 다음 날 분광 광도계를 사용하여 OD600을 측정합니다. 그런 다음 세포 배양을 약 0.2의 OD600으로 희석하고 세포를 0.6의 OD600으로 계속 성장시킵니다.

1ml의 지수 배양액을 3개의 마이크로퓨지 튜브에 분배합니다. 그리고 탁상용 원심분리기에서 세포를 7, 000 x g에서 5분 동안 펠릿화합니다. 각 세포 펠릿을 1밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킨 다음 1마이크로리터의 DMSO 오렌지 원액 또는 DAPI 원액을 추가합니다.

피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 다시 부유한 세포를 어둠 속에서 5분 동안 배양합니다. 7, 5 분 동안 000 x g에 원심분리에 의하여 세포를 펠릿 얻고, 과잉 시약을 제거하기 위하여 PBS의 1 밀리리터에 있는 펠릿을 재 중단하십시오. 그런 다음 세포를 두 번 더 세척하고 펠릿을 50 마이크로 리터의 PBS 또는 배지에 다시 현탁시킵니다.

동시 타임 랩스 이미징을 위해 각 처리에서 얻은 10마이크로리터의 세포를 새로운 마이크로분리 튜브에 결합합니다. 세포 이미징을 위해 아가로스 패드를 준비하려면 커버 슬립을 가이드로 사용하고 가장자리 주위에 메스를 대고 22 x 22mm 정사각형의 실험실 필름을 자릅니다. 실험실 필름의 중앙에서 사각형을 잘라내고 아가로스 패드의 개스킷 역할을 할 약 2-5mm 테두리를 남깁니다.

그런 다음 중앙 컷아웃을 버립니다. 필름 개스킷을 유리 슬라이드에 놓고 암모니아와 무알코올 세제로 청소합니다. 그리고 섭씨 70도로 설정된 열 블록이나 화염을 사용하여 필름이 유리에 약간 녹을 때까지 슬라이드를 가열합니다.

다음으로, 작은 플라스크에 약 0.075g의 아가로스와 5ml의 배지를 혼합하여 아가로스 용액을 준비합니다. 아가로스가 용해되고 용액이 투명해질 때까지 주기적으로 소용돌이치면서 용액을 전자레인지에서 가열하여 혼합합니다. 아가로스 용액을 섭씨 55-70도로 유지하고 48시간 이내에 여러 아가로스 패드를 만드는 데 사용하십시오.

따뜻한 아가로스 매체를 개스킷 중앙에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 개스킷 위에 커버 슬립을 놓아 아가로스를 고르게 분포시킵니다. 슬라이드를 서늘하고 평평한 표면에 놓고 약 2분 동안 굳힙니다.

이제 아가로스 패드에서 커버 슬립을 조심스럽게 밀어낸 다음 패드 표면이 건조해 보일 때까지 실온에서 1-2분 동안 아가로스 패드를 자연 건조시킵니다. 아가로스 패드의 적절한 구성은 고품질 이미지를 획득하는 데 매우 중요합니다. 나쁜 패드에서 이미지를 만들려고 하지 마십시오.

아가로스 패드가 마르거나 잔물결이 생기거나 찢어지면 게으르지 말고 대신 새 패드를 만드는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 작은 아가로스 조각을 제거하여 약 2 x 7-10mm의 에어 포켓을 만듭니다. A.Tumefacien 세포는 공기 주머니 근처에서 가장 잘 자라는 경향이 있습니다.

아가로스 패드에서 0.8-1마이크로리터의 세포를 찾아냅니다. 그런 다음 아가로스 패드 상단에 커버 슬립을 부드럽게 놓아 패드 표면 전체에 세포를 분산시킵니다. 장기 타임랩스 이미징의 경우 용융된 Valap을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다.

커버 슬립의 모든 가장자리와 모서리를 따라 Valap으로 밀봉하십시오. 그렇게 하지 않으면 아가로스 패드 타임랩스 이미징 중에 드리프트가 발생할 수 있습니다. epifluorescence microscopy를 수행하려면 원하는 대물렌즈에 이멀젼 오일을 바르고 반전된 슬라이드를 s의 슬라이드 홀더에 놓습니다.tage.

초점 조절 손잡이를 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다. 형광 이미지에 대해 원하는 형광 필터를 사용하여 위상 또는 DIC 및 형광 이미지를 획득합니다. 선택적으로, 아가로스 패드의 에어 포켓에 근접한 10개의 세포 필드를 무작위로 선택하여 여러 x, y 위치를 획득합니다.

원하는 시간 간격으로 In-Phase(DIC)를 이미지화하도록 시간 시퀀스 획득을 설정합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 원심분리로 세척한 후 배양에서 직접 세포를 이미지화하고 세포를 0.1% DMSO로 배양한 후 DMSO 단독으로는 세포 형태에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. Orange와 DAPI 모두 살아있는 A.Tumefaciens 세포 내에 DNA를 표지했습니다.

후기 분열 전 세포에서는 주황색 염색으로 두 개의 뚜렷한 핵체가 관찰되는 반면, DNA 표지는 DAPI 염색에서 더 확산적으로 나타납니다. 비표지, DAPI 표지 및 주황색 표지 야생형 A.Tumefaciens를 동일한 비율로 사용한 이 타임 랩스 실험에서 위상차 현미경으로 이미지화했을 때 모든 세포가 성장했으며, 이는 어느 쪽도 염색이 세포 성장을 저해하지 않음을 나타냅니다. 세포는 또한 TRITC 필터를 사용한 epifluoresence microscopy의 위상차 아래에서 성장했습니다.

그러나 DAPI 필터로 이미징했을 때 세포는 한 시간 이내에 성장을 멈췄습니다. 유사한 방법에 따라 다른 형광 시약을 사용하여 박테리아 세포벽 또는 멤브레인을 시각화할 수도 있습니다. 또한, 이러한 형광 염료 중 다수를 결합하여 박테리아 세포 표면의 포괄적인 이미지를 제공할 수 있습니다.

살아있는 박테리아의 필수 과정을 시각화하는 것은 조건부 돌연변이 또는 비모델 박테리아에서 이러한 과정을 연구할 수 있는 가능성을 열어주기 때문에 흥미진진합니다. 이를 통해 다양한 박테리아 종에 대한 연구를 강화할 수 있습니다.