1D 및 2D ^1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

이 절차의 전반적인 목표는 구리와 결합한 메탈로 샤페론(Metallo chaperone) 단백질 모방 펩타이드의 구조를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 산소가 없는 환경에서 시료를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수소 원자 간의 상호작용을 보여주는 핵자기공명 또는 NMR 분광법 데이터를 얻는 것입니다.

다음으로, 공간적 상호작용을 선형 펩타이드 템플릿에 매핑합니다. 마지막 단계는 데이터에 부합하는 대표적인 저에너지 구조를 찾는 것입니다. 최종적으로, NMR 유도 구조를 사용하여 결합 모드를 결정하고 구리 결합 복합체에 대한 구조 분석을 수행합니다.

X선 결정학(x-ray crystallography)과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 약한 결합 복합체뿐만 아니라 결정화되지 않는 분자 및 복합체도 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 구리 결합 단백질에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 금속 샤페론(metal chaperones)과 같은 다른 시스템에도 적용하여 단백질이 세포 내 환경에서 필수적이면서도 잠재적으로 독성이 있는 금속 이온을 어떻게 안전하게 전달하는지 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

먼저, 구리가 산화되는 것을 방지하기 위해 산소가 없는 환경에서 시료를 준비합니다. APO 시료를 준비하려면 약 1~2 mg의 펩타이드를 450~500 µL의 중수소화된 NMR 등급 용매에 녹입니다. 구리가 반응한 시료의 경우, APO 펩타이드와 동일한 양에 등몰량의 금속염을 450~500 µL의 NMR 용매에 녹입니다. 각 용액을 센터 글라스 여과지나 조사 대상 화합물에 적합하며 화합물을 흡수하지 않는 다른 기술을 사용하여 여과합니다. 이는 균질성에 영향을 줄 수 있는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.

용액을 NMR 튜브로 옮기고 튜브 내의 시료를 닫습니다. 글로브 박스에서 나오기 전, 시료를 글로브 박스 밖으로 꺼내 밀봉합니다. NMR 기기에서 APO 시료와 구리 반응 시료의 1차원 양성자 스펙트럼을 기록하고 이를 비교합니다.

APO 펩타이드는 유연하며 평균적인 컨포메이션(confirmation)을 보이지만, 구리와 반응하면 결합된 펩타이드 아미드는 더 경직된 구조를 갖게 됩니다. 따라서 구리를 포함하는 펩타이드 스펙트럼에서는 아미드 영역의 화학적 이동(chemical shift)에 상당한 변화가 나타나야 하며, 피크가 분해되어 보일 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 것과 동일한 조건에서 최적화된 cozy tox, nosy 또는 rosy NMR 실험을 설정하고 순차적으로 실행하십시오.

데이터 수집 전반에 걸쳐 시료 조성이 일정하게 유지되는지 확인하기 위해 각 실험 사이에 1차원 실험을 수행하십시오. 텍스트 프로토콜에서 설명한 대로 데이터를 처리한 후, NOESY 및 ROSY 스펙트럼 위에 중첩될 COSY 및 TOCSY 스펙트럼 세트를 준비하십시오. 스펙트럼의 모든 NOE 피크를 할당하십시오.

먼저 핑거프린트 영역에서 독성 신호와 겹치는 피크들을 할당하는 것부터 시작하십시오. 이는 이후 Sparky 프로그램을 이용한 피크 할당 입력 과정을 용이하게 하므로, 할당된 피크들을 기록하고 H alpha-amide 단백질 커플링 값을 이면각으로 변환하십시오. 또한, 프로그램 내에서 피크를 적분하고 알려진 거리의 상호작용을 사용하여 변환함으로써 피크를 거리 제약 조건으로 변환하십시오.

피크가 겹치거나 자동 적분법을 사용할 수 없는 경우, 시각적 추정을 통해 피크를 강함(strong), 중간(medium), 약함(weak) 또는 매우 약함(very weak)으로 표시할 수 있으며, 이러한 지정은 각각 최대 2.5, 3.5, 4.5 및 5.5 angstroms의 거리로 변환될 수 있습니다. Explore에서 사용할 수 있도록 올바른 형식으로 거리 구속 조건과 이면각을 불러옵니다. Explore는 정준 화학 기하학적 구조를 따르는 구조를 찾기 위해 컨포메이션 공간을 탐색합니다.

이러한 매개변수가 하나도 위배되지 않는 앙상블을 생성하기 위해, 실험적으로 발견된 거리 제약 조건을 추가합니다. 이것이 시작 앙상블이 됩니다. 편향 없이 어떤 잔기가 금속 결합에 참여하는지 확인하기 위해, 금속에 대한 어떠한 제약 조건도 사용하지 않고 첫 번째 구조 결정 실행을 수행하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 켤레 구배 에너지 최소화(conjugate gradient energy minimization)를 통해 4,000회 반복하여 구조를 최소화하기 전, 할당 오류와 NOE 에너지 및 시뮬레이션된 무릎 굽힘(kneeling) 매개변수를 쉽게 식별할 수 있도록 제약 조건을 점진적으로 도입하십시오. 전체 앙상블에 대해 반복적인 방식으로 제약 조건을 도입하여 일반적으로 50개의 멤버로 구성된 최종 앙상블을 생성하고, 발견된 각 유형의 NOE 상호작용 수를 보고하십시오. 마지막으로, 정준 화학 기하 구조와 경험적 NMR 유도 제약 조건을 준수하는 구조 앙상블을 생성하십시오. 전체 컨포메이션의 수, NMR 유도 제약 조건을 위반한 컨포메이션의 수, 그리고 백본 및 모든 중원자 RMSD 값을 포함한 전체 앙상블의 RMSD를 보고하십시오.

저에너지 앙상블을 분석하여 금속 이온과 결합할 수 있도록 서로 적절한 근접 거리에 위치한 잔기 곁사슬을 결정하십시오. 이를 결정한 후, 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복하십시오. NMR 유래 거리 제약 조건 외에, 결정된 잔기들에 금속 결합 제약 조건을 추가하십시오.

금속 이온과 그 토폴로지를 기술하기 위해 적절한 파라미터를 추가하십시오. 질량, 다른 원자와의 결합 길이, 각도 및 비결합 반발 파라미터와 같은 적절한 물리적 정보를 파라미터 파일에 입력하십시오. 결합 정보를 토폴로지 파일에 추가하십시오.

이 정보에는 어떤 결합이 형성되고 끊어지는지, 그리고 결합의 결과로 어떤 형식 전하가 변경되는지가 포함됩니다. 마지막으로, 앞서와 같이 구조 앙상블을 확보하는데, 해결된 앙상블은 펩타이드가 취하는 구조적 공간을 나타냅니다. NMR 측정 중에, 구조의 모든 컨포메이션을 Mal Mall 프로그램으로 가져와 시작 앙상블을 생성하십시오.

앙상블을 조사하여 분자의 국소 안정성을 결정합니다. 서열을 따라 연속된 4개 잔기 영역을 선택하고, 프로그램이 최저 에너지 구조 또는 평균 구조에 대한 RMSD를 계산하도록 하여 백본 및 사이드 체인 RMSD 값을 결정합니다. 서열에 따른 국소 RMSD를 그래프로 그려 분자의 어느 영역이 국소 안정성을 보이는지 결정하고, 분자의 해당 영역을 따라 앙상블을 겹쳐 놓은 후 이 앙상블을 후속 분석에 사용합니다. NMR 유도 구속 조건(constraints)을 준수하는 낮은 에너지의 컨포메이션을 선택하십시오.

이들은 저에너지 앙상블 기록을 형성하며, 앙상블 내의 컨포메이션 수, 선택 기준 및 RMSD 값을 보고합니다. 금속 결합 모드가 아직 결정되지 않은 경우, 저에너지 앙상블을 분석하여 어떤 잔기 측쇄가 잘못되었는지 결정하십시오. 금속 이온과 결합할 수 있도록 서로 간의 근접성을 확인하십시오.

KYMERA를 사용하여 금속 결합으로 추정되는 원자 간의 분자 내 거리를 측정하십시오. 거리가 결정되면 앙상블 내의 평균 거리를 계산하십시오. 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복하십시오.

MAL mall 프로그램의 기본 검색 파라미터를 사용하여 앙상블을 조사하고 분자 내의 국소 2차 구조를 결정하십시오. 다음으로, 앙상블을 kymera로 가져오십시오. 2차 구조는 수소 결합에 의해 유지되며 분자의 안정적인 영역을 나타냅니다.

kymera 툴을 사용하여 수소 결합을 결정하십시오. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 구조 분석을 계속하십시오. 그런 다음 모든 구조적 발견 사항을 종합하여 이들이 서로 어떻게 보완하는지 밝히십시오. 구리 결합 단백질 모델을 연구하기 위해, 도출된 선형 펩타이드 내 단백질의 보존된 결합 서열 구조를 용액 상태 NMR로 결정하였으며, 6.7에서 8.5 범위의 펩타이드 아미드 영역을 분석하였습니다.

PP M은 구리와 반응하여 6.6에서 9.0 PP M까지 확장됨을 보였습니다. 약간의 구리 산화로 인한 라인 확장(line broadening)이 베이스라인에서 분명하게 나타납니다. 여기에는 구리 결합 펩타이드의 Roy Toxi와 cozy 스펙트럼의 핑거프린트 영역을 겹쳐서 보여줍니다. 샘플은 시간에 따라 안정적이었으며, 스펙트럼은 잘 분해되어 rosy 실험을 통해 획득한 81개의 NOE 상호작용을 나타냈습니다.

해당 분자가 NO C 실험에서 거의 제로에 가까운 NOE 상호작용을 보였으므로, 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 반응 샘플로부터 도출된 펩타이드 앙상블은 50개 구조 중 47개가 backbone 및 heavy atom에 대해 각각 1.44 및 2.07 angstroms의 RMSD 값을 나타냈습니다. 이 중 backbone 및 heavy atom에 대해 각각 0.25 및 0.61 angstroms의 RMSD 값을 가진 13개의 저에너지 컨포머가 추가 분석을 위해 선택되었습니다. 국소 RMSD 플롯은 3번과 7번 잔기 사이의 안정 영역을 보여주었습니다. 프롤린 잔기를 포함하는 강직한 C 말단 영역 외에도, 이 영역은 모든 컨포메이션에서 4번과 7번 잔기 사이의 굴곡진 형태로 나타납니다.

굽힘 구조의 안정화는 백본 공여체와 수용체인 glycine 5 및 alanine 2, 그리고 cysteine 6과 cysteine 3 사이의 수소 결합에 의해 이루어집니다. 이러한 굽힘은 cysteine 3과 serine 7 영역의 결합 상수(coupling values) 감소를 통해 확인됩니다. 이 영역을 중심으로 구조들을 중첩시킨 후, cysteine 3, cysteine 6 및 methionine 1을 잠재적 결합 잔기로 고려하여 가능한 결합 잔기들에 대해 분석을 수행하였습니다.

가장 짧은 황-황 원자 간 거리는 cysteine 3과 cysteine 6의 folat 그룹 사이였으며, 구리 결합을 도입한 후 계산을 반복하여 분석에 사용될 앙상블을 생성하였습니다. 구리가 결합된 펩타이드의 저에너지 앙상블은 말단 아민이 결합된 구리와 인접해 있음을 보여줍니다. 여기에는 양전위는 파란색으로, 음전위는 빨간색으로 표시된 정전기 전위 분포 등전위면이 나타나 있습니다.

아르기닌 잔기는 펩타이드의 백본에서 뻗어 나와 정전기 전위의 양의 로브(positive lobe)를 형성하는 반면, 백본 탄소들은 일직선으로 배열되어 덜 두드러진 음의 정전기 전위를 형성합니다. 숙달되면, 약 1주일의 NMR 측정 시간과 며칠간의 후처리 작업을 통해 구조 분석에 사용할 수 있는 컨포메이션 앙상블을 얻어 구조 결정이 가능합니다. 이 절차를 통해 다른 펩타이드 돌연변이체와 다양한 조건을 분석함으로써, 구리 이온의 결합 및 방출 정도에 필요한 조건에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.