Name: 1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 배우세요 NMR 분광법을 사용하여 구리 결합 메탈로챠페론 모델 펩타이드의 구조를 결정하는 방법을. 산소 없는 환경에서 샘플을 준비하고 1D 및 2D ¹H NMR 데이터를 수집하여 공간적 상호작용을 분석합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

재정적 지원을 해주신 휴먼 프론티어 사이언스 프로그램(Human Frontier Science Program, Young investigator grant (RGY)0068-2006)에 감사드립니다.

1. 샘플 준비
<ol>
	<li>Apo-sample: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 중수소화 NMR 등급 용매에 용해시킵니다(생물학적 샘플에 대한 바람직한 용액은 물에 10% D2O 또는 샘플이 물에 용해되지 않거나 반응하는 경우 d6-DMSO 11-12).</li>
	<li>구리 반응 샘플: 약 1-2mg의 펩타이드를 450-500μl의 NMR 용매에 등몰량의 금속염으로 용해시킵니다.</li>
	<li>소결 유리, 여과지 또는 조사 중인 화합물에 적합하고 흡착되지 않는 기타 기술을 사용하여 용액을 여과합니다. 이것은 균질성에 영향을 미치는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.</li>
	<li>용액을 NMR 튜브로 옮기고 닫습니다. 튜브 품질이 사용된 자석 강도에 맞는지 확인하십시오(자세한 내용은 장비 표 참조).</li>
	<li>샘플이 산소에 민감한 경우 이러한 단계는 불활성 환경에서 수행해야 하며 산화를 방지하기 위해 튜브를 밀봉해야 합니다.</li>
</ol>
2. NMR 데이터 수집 및 처리13
<ol>
	<li>apo 및 구리 반응 샘플의 1D 1H 스펙트럼을 기록하고 비교합니다. 구리 함유 펩타이드 스펙트럼은 아미드 영역에서 화학적 변화의 상당한 변화를 보여야 하며 아포-펩타이드가 유연하고 평균적인 형태를 나타내기 때문에 피크가 분해되었지만 구리와 반응할 때 결합 펩타이드 아미드는 단일 구조를 갖습니다(그림 2).
	<ol>
		<li>스펙트럼이 변경되지 않으면 반응이 실패한 것으로 가정합니다.</li>
		<li>샘플이 녹색으로 변하면 구리가 대기 중에서 산화되어 결합 특성이 변경될 수 있습니다.</li>
		<li>이 두 경우 모두 샘플을 다시 만들어야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>좁은 선 너비로 아미드 잔류물의 겹침을 최소화하는 NMR 측정을 위한 최적의 온도 조건을 찾습니다.</li>
	<li>동일한 조건(온도, pH 등)에서 COSY14, TOCSY15 및 NOESY16 또는 ROESY17 NMR 실험을 설정하고 순서대로 실행합니다.
	<ol>
		<li>COSY(그림 3) 및 TOCSY(그림 4) 실험은 각각 인접 및 장거리 인접 양성자-양성자 상호 작용의 결합 통과 상호 작용을 감지합니다. COSY 스펙트럼은 HN-Hα 상관 관계에 대한 정보를 제공하는 반면 TOCSY 스펙트럼은 상관 잔기의 HN 및 기타 H 지방족 양성자에 대한 정보를 제공합니다.</li>
		<li>NOESY 및 ROESY(그림 5) 실험은 구조 정보를 제공하기 위해 결합에 의존하지 않고 공간을 통한 근접성을 감지합니다. 둘 사이의 선택은 화합물의 유효 크기와 전계 강도에 따라 다릅니다. 이러한 조합 중 일부는 이론적인 제로 신호를 제공하며(그림 6) NOE 상호 작용10,18을 감지하기 위해 ROESY 실험을 실행해야 합니다.</li>
		<li>샘플이 물 속에 있는 경우 실험에는 수분 억제 구성 요소가 있어야 합니다. 이것은 경사도19를 사용하여 가장 효율적으로 수행됩니다. 이 경우, Hα 수소에 대한 상호 작용을 얻기 위해 순수D2O에서 일단 할당되면 샘플을 다시 실행하여 유리합니다.</li>
		<li>스핀 확산에 대한 손실을 최소화하면서 최대 신호 축적을 찾기 위해 여러 가지 짧은 실험을 실행하여 TOCSY 및 NOESY 또는 ROESY 혼합 시간의 지속 시간을 최적화합니다. 이것이 빌드업 곡선의 선형 영역인지 확인하십시오. 600MHz 필드에서 펩타이드에 대한 일반적인 값에는 TOCSY의 경우 약 100msec, NOESY 또는 ROESY 실험의 경우 150msec의 혼합 시간이 포함됩니다.</li>
		<li>각 실험 사이에 1D 실험을 실행하여 데이터 수집 전반에 걸쳐 샘플 조성이 일정하게 유지되는지 확인합니다(그림 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>적절한 아포다이제이션 기능을 사용하여 스펙트럼을 처리하여 신호 강도의 손실을 최소화하면서 최대 분해능을 얻고 t1 차원에 영점 충전을 추가합니다.
	<ol>
		<li>F2 차원에서 F1 차원의 기준선을 2차 다항식 함수로 추가로 수정합니다.</li>
		<li>알려진 표준물질(각각 TMSP 또는 TMS)로부터의 이동에 따라 각 용매의 잔류 수분 또는 DMSO 피크에 따라 스펙트럼의 화학적 이동을 신중하게 보정합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SPARKY20을 사용한 피크 할당 및 통합
<ol>
	<li>NOESY 또는 ROESY 스펙트럼에 중첩된 COSY 및 TOCSY 스펙트럼 세트를 준비합니다(그림 8).</li>
	<li>Wüthrich21에서 개발한 순차 할당 방법론에 따라 스펙트럼의 모든 NOE 피크를 할당합니다.
	<ol>
		<li>지문 영역에서 TOCSY 신호와 겹치는 피크를 할당하는 것부터 시작하면 SPARKY 프로그램을 사용하여 후속 피크 할당을 용이하게 할 수 있습니다(그림 9). 할당 화학적 이동(그림 10) 및 3JHNHα 값(그림 11)을 등록합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>피크를 거리 제약 조건으로 변환하고 3JHNHα 값을 이면각으로 변환합니다.
	<ol>
		<li>이는 프로그램 내에서 피크를 통합하고 알려진 거리의 상호 작용(예: 메틸렌기의 두 양성자 또는 방향족 아미노산의 방향족 수소 원자 사이의 거리)을 사용하여 거리 제약 조건으로 변환하여 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>피크가 겹치고 적분 방법을 사용할 수 없는 경우 시각적 추정을 통해 강-중간-약함-매우 약함으로 레이블을 지정할 수 있으며 이러한 지정은 각각 최대 2.5, 3.5, 4.5 및 5.5Å의 거리로 변환될 수 있습니다. 이것은 펩티드와 함께 일할 때 가장 효과적입니다.</li>
		<li>3JHNHα 값은 Karplus 방정식에 따라 이면각을 나타내며, 대부분의 주어진 결합 값은 둘 이상의 이면각에서 발생할 수 있습니다. 이는 2차 구조(나선 또는 시트), 무작위 코일 또는 이의 구조적 평균을 나타낼 수 있습니다. 따라서 제약 조건을 신중하게 사용하거나 구조적 결과를 확인하는 데 사용하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. XPLOR22를 사용하여 구조 앙상블을 생성하기 위한 분자 역학 계산
<ol>
	<li>거리 제약 조건과 이면각을 XPLOR에 대한 올바른 형식으로 가져옵니다. (그림 12, 잔차 간 제약 조건만 해당). XPLOR는 구조적 공간을 검색하여 실험적으로 발견된 거리 제약 조건 외에도 결합 길이, 각도, 키랄성 등과 같은 표준 기하학적 화학적 제약 조건을 준수하는 구조를 찾아 위의 매개변수 중 어느 것도 위반되지 않는 앙상블을 생성합니다. 이것이 선발 앙상블을 구성합니다.</li>
	<li>첫 번째 구조 결정 실행은 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 수행됩니다. 이것은 어떤 잔류물이 편향 없이 금속 결합에 참여하는지 보여줍니다. 4.4단계로 건너뜁니다.</li>
	<li>NMR 유래 거리 제약 조건 외에도 결정된 잔기에 금속 결합 제약 조건을 추가합니다.
	<ol>
		<li>금속 이온과 그 토폴로지를 설명하기 위해 적절한 파라미터를 추가합니다.</li>
		<li>적절한 물리적 정보(질량, 다른 원자와의 결합 길이, 각도 및 비결합 반발 매개변수)를 매개변수 파일에 넣어야 합니다.</li>
		<li>토폴로지 파일에 바인딩 정보를 추가합니다: 어떤 결합이 형성되고 끊어지며 바인딩의 결과로 어떤 공식 전하가 변경되는지.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>보통 10명으로 구성된 소규모 앙상블을 만듭니다.
	<ol>
		<li>백본-백본 상호 작용에서 시작하여 백본-사이드체인, 사이드체인-사이드체인 상호 작용, 잔여 내 순차 상호 작용에서 점점 더 긴 범위의 상호 작용으로 이동하여 제약 조건을 점진적으로 도입합니다. 이렇게 하면 할당의 실수를 쉽게 식별할 수 있습니다.</li>
		<li>NOE 에너지를 50kcal/mol•Å2의 일정한 힘 상수를 갖는 제곱 웰 전위로 소개합니다. 시뮬레이션된 어닐링은 1,500K에서 1,500개의 3-fsec 단계와 500K로 냉각하는 동안 3,000개의 1-fsec 단계로 수행해야 합니다. 마지막으로, 4,000회 반복 동안 켤레 기울기 에너지 최소화를 사용하여 구조를 최소화합니다. 이는 XPLOR 내에서 변경할 수 있는 변수입니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>보통 50명으로 구성된 최종 앙상블을 만듭니다. 전체 앙상블에서 4.4단계의 단계를 수행합니다.
	<ol>
		<li>그림 13과 같이 발견된 각 NOE 상호 작용 유형의 수를 보고합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>표준 화학 기하학과 경험적 NMR 파생 제약 조건을 준수하는 구조의 앙상블을 만듭니다.
	<ol>
		<li>총 형태 수, NMR 유도 제약 조건을 위반하는 이러한 수의 수, 전체 앙상블의 RMSD, 두 백본 및 모든 무거운 원자 RMSD 값을 보고합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 구조 분석
<ol>
	<li>해결된 앙상블은 NMR 측정 중에 펩타이드가 채택한 구조적 공간을 나타냅니다. 국소 유연성은 분자의 다른 영역에서 변할 수 있으며 이는 구조적 또는 기능적 이유에 기인할 수 있습니다(구조 분석의 목적은 안정성과 작용 메커니즘에 대한 구조적 기초를 결정하는 것입니다).
	<ol>
		<li>구조의 모든 형태를 MolMol 프로그램23으로 가져와 시작 앙상블을 만듭니다(그림 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>앙상블을 검사하여 분자의 국소 안정성을 결정합니다.
	<ol>
		<li>시퀀스를 따라 후속 4개 잔기 영역을 선택하고 프로그램이 RMSD를 가장 낮은 에너지 구조 또는 평균으로 계산하도록 하여 backbone 및 sidechain RMSD 값을 결정합니다.</li>
		<li>국소 RMSD를 염기서열의 함수로 플로팅하여 분자의 어느 영역이 국소 안정성을 보이는지 확인합니다(그림 15).</li>
		<li>분자의 이 영역을 따라 앙상블을 오버레이하고 추가 분석을 위해 이 앙상블을 사용합니다(그림 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NMR 유래 제약 조건(위반되지 않음)을 준수하는 저에너지 형태를 선택합니다. 이것들은 "저에너지 앙상블"을 형성할 것입니다.
	<ol>
		<li>앙상블의 형태 수, 형태 선택 기준 및 4.6.1단계에서 정의한 RMSD 값을 보고합니다.</li>
		<li>금속 바인딩 모드가 이미 결정된 경우 다음 단계를 계속합니다. 그렇지 않은 경우: 저에너지 앙상블을 분석하고 금속 이온을 결합할 수 있도록 서로 올바른 근접 위치에 있는 잔류 측쇄를 확인합니다. 이러한 값이 결정되면 3.3단계로 돌아가서 구리 결합 데이터를 포함한 분석을 다시 수행합니다(그림 17은 앙상블, 그림 18은 저에너지 컨포머).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>앙상블을 검사하고 MolMol 프로그램의 기본 검색 파라미터를 사용하여 분자 내의 국소 2차 구조를 결정합니다. 2차 구조는 수소 결합에 의해 유지되며 분자의 안정적인 영역을 나타냅니다.
	<ol>
		<li>각 conformer의 2차 구조를 결정합니다(그림 19).
		<ol>
			<li>각 2차 구조를 보여주는 앙상블의 conformers의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다.</li>
			<li>2차 구조의 영역이 local-RMSD에 의해 안정적인 영역으로 결정된 영역과 겹치는지 여부를 확인합니다. 이것은 종종 경우입니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>분자 내의 거리와 수소 결합을 측정합니다.
	<ol>
		<li>앙상블을 Chimera24로 가져옵니다.</li>
		<li>Chimera를 사용하여 금속 결합이 의심되는 원자 사이의 분자 내 거리를 측정합니다. 앙상블의 평균 거리를 계산합니다.</li>
		<li>Chimera를 사용하여 프로그램의 기본 완화된 수소 결합 매개변수(20%)를 사용하여 앙상블의 각 컨포머에서 분자 내 수소 결합을 측정합니다(그림 20).</li>
		<li>각 수소 결합을 보여주는 앙상블의 컨포머(conformours)의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다. 대부분의 형태에서 반복되는 수소 결합은 구조의 안정성을 더하는 안정적인 결합을 나타냅니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>분자 내의 정전기 상호 작용을 결정합니다.
	<ol>
		<li>충전된 사이드체인 간의 상호 작용을 식별합니다.</li>
		<li>각 정전기 상호 작용을 보여주는 앙상블의 conformers의 백분율에 대한 테이블을 만듭니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delphi25 프로그램 내에서 Amber26 역장을 사용하여 정전기 전위 분포를 계산합니다.
	<ol>
		<li>앙상블에서 정전기 전위 계산을 수행할 단일 대표 구조를 선택합니다.</li>
		<li>Poisson-Boltzman 방정식과 전체 쿨롱 계산을 사용하여 정전기 전위를 도출합니다. 필요한 매개 변수에는 용액의 이온 강도, 용액의 유전 값 (물의 경우 80, DMSO의 경우 40)이 포함됩니다. 내부 펩타이드 (보통 약 5.0); 그리드의 크기(보통 65'65'65 포인트); 펩타이드와 그리드 가장자리 사이의 최소 거리 (10 Å). 결과는 주요 결과가 펩티드 자체에 의해 통제되기 때문에 일반적으로 이러한 값과 관련하여 매우 견고합니다(그림 21).</li>
		<li>펩타이드의 Van der Waals 표면에 매핑된 정전기 전위를 조사합니다(그림 22).</li>
		<li>동일한 전위를 가진 위치를 설명하는 정전기 전위 iso-surfaces를 검사합니다. 다른 단백질이나 리간드를 끌어당기거나 밀어낼 수 있는 확장된 포지티브 또는 네거티브 표면과 같이 생물학적 관련성을 암시하는 iso-surfaces 또는 양친매성 분포 또는 다른 특성의 패치와 같이 중요성을 나타내는 분포를 찾습니다(그림 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>모든 구조적 발견을 요약하여 그들이 어떻게 서로를 강화하는지 확인하십시오.</li>
	<li>해당되는 경우 4.3-5.7.4 단계를 반복합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

결합 메커니즘을 이해하기 위한 구조 정보의 기여는 잘 받아들여지고 있습니다. 펩타이드는 단백질 결합 및 상호 작용의 모델로 유용합니다. 그러나 구조 결정의 주요 방법인 X선 결정학에는 적합하지 않습니다. NMR은 구조가 용액에서 쉽게 해결될 수 있기 때문에 이러한 시스템에 특히 유용합니다. 이는 특히 금속 이온의 산화를 방지하기 위해 불활성 환경에서 구조 결정이 추가로 필요한 메탈로샤페론 모방체의 경우입니다.
보존된 MT/HCXXC 모티프를 포함하는 MTCSGCSRPG 펩타이드는 아포 형태에서 구리와 반응한 펩타이드로 스펙트럼의 유의한 변화에 의해 명백한 바와 같이 Cu(I)에 결합했습니다. NOESY 스펙트럼에서 null 상호 작용이 있는 스펙트럼으로 인해 600MHz 필드에서 ROESY 실험의 필요성은 우리의 경험에 따르면 6-7 잔기의 더 작은 펩타이드가 NOESY 체제의 null 신호에 속하지만 이 크기의 펩타이드는 일반적으로 적절한 신호를 제공합니다. ROESY 스펙트럼...

펩타이드는 단백질 모델, 잠재적인 약물 선도 물질 및 치료제로 널리 사용됩니다. 그러나 작은 크기와 높은 수준의 유연성으로 인해 결정화의 어려움으로 인해 X-ray에 의한 구조 결정이 불가능한 경우가 많습니다.
핵자기공명(NMR)은 펩타이드 구조 및 상호 작용을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 국소 및 전체 구조, 결합 및 낮은 친화성 상호 작용에 관한 정보를 제공할 수 있으며 용액 상태에서 수행할 수 있으므로 어려운 샘플에 적용할 수 있습니다.
생물학적 시스템에서 구리 수송은 Cu (I) 이온을 특이적으로 결합하고 일련의 단백질-단백질 상호 작용을 통해 표적 단백질에 전달하는 세포 내 구리 메탈로샤페론 단백질에 의해 이루어져, 이온이 산화되는 것을 방지하고 독성 구리2-5의 방출을 방지합니다. 결합 부위는 보존된 서열 MXH/TCXanyXanyC를 특징으로 하며, 이는 NMR 및 결정학에 의해 Cu(I)를 두 시스테인 잔기의 부드러운 티올라토 리간드에 결합하는 것으로 나타났지만, 추가 외부 리간드도6-8 제안되었습니다. 이러한 단백질의 구조-기능 관계는 집중적인 연구의 주제였습니다9.
여기에 제시된 연구에서는 구리 메탈로샤페론의 보존된 서열을 포함하는 펩타이드 모델을 합성하고 불활성 환경에서 Cu(I)와 반응시켰습니다. 제시된 프로토콜은 샘플 준비, 데이터 수집, 데이터 처리, 구조 생성 및 구조 분석을 포함하여 NMR에 의한 구조 결정 단계를 설명합니다. 분석은 두 단계로 수행되었습니다.첫 번째 구조는 구리 이온에 대한 펩타이드의 결합 모드에 관한 정보 없이 생성되었습니다. 바인딩 모드가 경험적으로 설정되면 고해상도 구조를 제공하기 위해 이러한 제약 조건이 도입되었습니다. 바인딩 모드는 모델의 필수 포인트이므로 편향되지 않은 방식으로 결정되었습니다.
모델 펩타이드의 NMR 구조 측정은 화학자와 생물학자가 자주 사용하는 매우 가치 있는 기술입니다. 그것은 다른 조건 하에서 다른 펩티드에 상대적으로 쉽게 적용될 수 있으며, 따라서 관련 메커니즘에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다10. 구조 규명 과정을 이해하면 제안된 구조의 강점과 약점을 더 잘 이해할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Avance DMX 600 MHz 분광계</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR 샘플 튜브&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>장갑 상자</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>벤치탑K</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드</td><td>BioChemia</td><td>맞춤 제작</td><td>>95% 순도</td></tr><tr><td>구리(1) 염화</td><td>물 알드리치</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimethylsulfoxide</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>중수소산화물</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

1d 및 2d 1hnmr을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

메탈로샤페론 수송 단백질에 의한 구리(I) 결합은 유해한 산화 환원 반응에 참여할 수 있는 독성 이온의 구리 산화 및 방출을 방지합니다. 서열 MTCSGCSRPG(밑줄이 그어진 것이 보존됨)를 포함하는 Cu(I) 결합 메탈로샤페론 단백질의 펩타이드 모델의 Cu(I) 복합체는 NMR 분광법에 의해 불활성 조건하의 용액에서 측정되었습니다.
NMR은 단백질과 펩타이드의 용액 구조를 결정하기 위해 널리 인정되는 기술입니다. X선 결정학에 적합한 단결정을 제공하기 위한 결정화의 어려움으로 인해 NMR 기술은 특히 고체 상태가 아닌 용액 상태에 대한 정보를 제공하기 때문에 매우 가치가 있습니다. 여기에서는 NMR에 의한 완전한 3차원 구조 결정에 필요한 모든 단계를 설명합니다. 이 프로토콜에는 NMR 튜브의 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집 및 처리, 피크 할당 및 통합, 분자 역학 계산 및 구조 분석이 포함됩니다. 중요한 것은 사전 설정된 금속-리간드 결합 없이 분석이 먼저 수행되어 편향되지 않은 방식으로 신뢰할 수 있는 구조 결정을 보장한다는 것입니다.

구리 결합 단백질 모델에 관한 지속적인 연구의 일환으로, 선형 펩타이드 MTCSGCSRPG 내의 보존된 서열인 MT/HCXXC의 구조를 용액 상태 NMR로 결정하였습니다. 펩타이드를 불활성 환경에서 CuCl과 반응시켰으며, 범용 측정지로 측정한 pH는 ~3.0이었습니다. 펩타이드의 아미드 영역은 구리와 반응한 후 6.7-8.5 ppm에서 6.6-9.0 ppm으로 확장되었습니다(그림 2). 약간의 구리 산화로 인한 선폭 넓어짐 현상이 기선(baseline)에서 확인됩니다.
구리 반응 펩타이드 샘플은 시간이 지나도 안정적이었으며(그림 7), 스펙트럼은 잘 분해되었고(그림 8), ROESY 실험을 통해 81개의 NOE 상호작용을 얻었습니다. 이는 해당 분자가 NOESY 스펙트럼에서 거의 0에 가까운 NOE 상호작용을 보였기 때문입니다(그림 6의 이론적 설명 참조)....

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

이 절차의 전반적인 목표는 구리와 결합한 메탈로 샤페론(Metallo chaperone) 단백질 모방 펩타이드의 구조를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 산소가 없는 환경에서 시료를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수소 원자 간의 상호작용을 보여주는 핵자기공명 또는 NMR 분광법 데이터를 얻는 것입니다.다음으로, 공간적 상호작용을 선형 펩타이드 템플릿에 매핑합니다. 마지막 단계는 데이터에 부합하는 대표적인 저에너지 구조를 찾는 것입니다. 최종적으로, NMR 유도 구조를 사용하여 결합 모드를 결정하고 구리 결합 복합체에 대한 구조 분석을 수행합니다.X선 결정학(x-ray crystallography)과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 약한 결합 복합체뿐만 아니라 결정화되지 않는 분자 및 복합체도 관찰할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 구리 결합 단백질에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 금속 샤페론(metal chaperones)과 같은 다른 시스템에도 적용하여 단백질이 세포 내 환경에서 필수적이면서도 잠재적으로 독성이 있는 금속 이온을 어떻게 안전하게 전달하는지 연구하는 데 활용될 수 있습니다.먼저, 구리가 산화되는 것을 방지하기 위해 산소가 없는 환경에서 시료를 준비합니다. APO 시료를 준비하려면 약 1~2 mg의 펩타이드를 450~500 µL의 중수소화된 NMR 등급 용매에 녹입니다. 구리가 반응한 시료의 경우, APO 펩타이드와 동일한 양에 등몰량의 금속염을 450~500 µL의 NMR 용매에 녹입니다. 각 용액을 센터 글라스 여과지나 조사 대상 화합물에 적합하며 화합물을 흡수하지 않는 다른 기술을 사용하여 여과합니다. 이는 균질성에 영향을 줄 수 있는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.용액을 NMR 튜브로 옮기고 튜브 내의 시료를 닫습니다. 글로브 박스에서 나오기 전, 시료를 글로브 박스 밖으로 꺼내 밀봉합니다. NMR 기기에서 APO 시료와 구리 반응 시료의 1차원 양성자 스펙트럼을 기록하고 이를 비교합니다.APO 펩타이드는 유연하며 평균적인 컨포메이션(confirmation)을 보이지만, 구리와 반응하면 결합된 펩타이드 아미드는 더 경직된 구조를 갖게 됩니다. 따라서 구리를 포함하는 펩타이드 스펙트럼에서는 아미드 영역의 화학적 이동(chemical shift)에 상당한 변화가 나타나야 하며, 피크가 분해되어 보일 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 것과 동일한 조건에서 최적화된 cozy tox, nosy 또는 rosy NMR 실험을 설정하고 순차적으로 실행하십시오.데이터 수집 전반에 걸쳐 시료 조성이 일정하게 유지되는지 확인하기 위해 각 실험 사이에 1차원 실험을 수행하십시오. 텍스트 프로토콜에서 설명한 대로 데이터를 처리한 후, NOESY 및 ROSY 스펙트럼 위에 중첩될 COSY 및 TOCSY 스펙트럼 세트를 준비하십시오. 스펙트럼의 모든 NOE 피크를 할당하십시오.먼저 핑거프린트 영역에서 독성 신호와 겹치는 피크들을 할당하는 것부터 시작하십시오. 이는 이후 Sparky 프로그램을 이용한 피크 할당 입력 과정을 용이하게 하므로, 할당된 피크들을 기록하고 H alpha-amide 단백질 커플링 값을 이면각으로 변환하십시오. 또한, 프로그램 내에서 피크를 적분하고 알려진 거리의 상호작용을 사용하여 변환함으로써 피크를 거리 제약 조건으로 변환하십시오.피크가 겹치거나 자동 적분법을 사용할 수 없는 경우, 시각적 추정을 통해 피크를 강함(strong), 중간(medium), 약함(weak) 또는 매우 약함(very weak)으로 표시할 수 있으며, 이러한 지정은 각각 최대 2.5, 3.5, 4.5 및 5.5 angstroms의 거리로 변환될 수 있습니다. Explore에서 사용할 수 있도록 올바른 형식으로 거리 구속 조건과 이면각을 불러옵니다. Explore는 정준 화학 기하학적 구조를 따르는 구조를 찾기 위해 컨포메이션 공간을 탐색합니다.이러한 매개변수가 하나도 위배되지 않는 앙상블을 생성하기 위해, 실험적으로 발견된 거리 제약 조건을 추가합니다. 이것이 시작 앙상블이 됩니다. 편향 없이 어떤 잔기가 금속 결합에 참여하는지 확인하기 위해, 금속에 대한 어떠한 제약 조건도 사용하지 않고 첫 번째 구조 결정 실행을 수행하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로, 켤레 구배 에너지 최소화(conjugate gradient energy minimization)를 통해 4,000회 반복하여 구조를 최소화하기 전, 할당 오류와 NOE 에너지 및 시뮬레이션된 무릎 굽힘(kneeling) 매개변수를 쉽게 식별할 수 있도록 제약 조건을 점진적으로 도입하십시오. 전체 앙상블에 대해 반복적인 방식으로 제약 조건을 도입하여 일반적으로 50개의 멤버로 구성된 최종 앙상블을 생성하고, 발견된 각 유형의 NOE 상호작용 수를 보고하십시오. 마지막으로, 정준 화학 기하 구조와 경험적 NMR 유도 제약 조건을 준수하는 구조 앙상블을 생성하십시오. 전체 컨포메이션의 수, NMR 유도 제약 조건을 위반한 컨포메이션의 수, 그리고 백본 및 모든 중원자 RMSD 값을 포함한 전체 앙상블의 RMSD를 보고하십시오.저에너지 앙상블을 분석하여 금속 이온과 결합할 수 있도록 서로 적절한 근접 거리에 위치한 잔기 곁사슬을 결정하십시오. 이를 결정한 후, 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복하십시오. NMR 유래 거리 제약 조건 외에, 결정된 잔기들에 금속 결합 제약 조건을 추가하십시오.금속 이온과 그 토폴로지를 기술하기 위해 적절한 파라미터를 추가하십시오. 질량, 다른 원자와의 결합 길이, 각도 및 비결합 반발 파라미터와 같은 적절한 물리적 정보를 파라미터 파일에 입력하십시오. 결합 정보를 토폴로지 파일에 추가하십시오.이 정보에는 어떤 결합이 형성되고 끊어지는지, 그리고 결합의 결과로 어떤 형식 전하가 변경되는지가 포함됩니다. 마지막으로, 앞서와 같이 구조 앙상블을 확보하는데, 해결된 앙상블은 펩타이드가 취하는 구조적 공간을 나타냅니다. NMR 측정 중에, 구조의 모든 컨포메이션을 Mal Mall 프로그램으로 가져와 시작 앙상블을 생성하십시오.앙상블을 조사하여 분자의 국소 안정성을 결정합니다. 서열을 따라 연속된 4개 잔기 영역을 선택하고, 프로그램이 최저 에너지 구조 또는 평균 구조에 대한 RMSD를 계산하도록 하여 백본 및 사이드 체인 RMSD 값을 결정합니다. 서열에 따른 국소 RMSD를 그래프로 그려 분자의 어느 영역이 국소 안정성을 보이는지 결정하고, 분자의 해당 영역을 따라 앙상블을 겹쳐 놓은 후 이 앙상블을 후속 분석에 사용합니다. NMR 유도 구속 조건(constraints)을 준수하는 낮은 에너지의 컨포메이션을 선택하십시오.이들은 저에너지 앙상블 기록을 형성하며, 앙상블 내의 컨포메이션 수, 선택 기준 및 RMSD 값을 보고합니다. 금속 결합 모드가 아직 결정되지 않은 경우, 저에너지 앙상블을 분석하여 어떤 잔기 측쇄가 잘못되었는지 결정하십시오. 금속 이온과 결합할 수 있도록 서로 간의 근접성을 확인하십시오.KYMERA를 사용하여 금속 결합으로 추정되는 원자 간의 분자 내 거리를 측정하십시오. 거리가 결정되면 앙상블 내의 평균 거리를 계산하십시오. 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복하십시오.MAL mall 프로그램의 기본 검색 파라미터를 사용하여 앙상블을 조사하고 분자 내의 국소 2차 구조를 결정하십시오. 다음으로, 앙상블을 kymera로 가져오십시오. 2차 구조는 수소 결합에 의해 유지되며 분자의 안정적인 영역을 나타냅니다.kymera 툴을 사용하여 수소 결합을 결정하십시오. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 구조 분석을 계속하십시오. 그런 다음 모든 구조적 발견 사항을 종합하여 이들이 서로 어떻게 보완하는지 밝히십시오. 구리 결합 단백질 모델을 연구하기 위해, 도출된 선형 펩타이드 내 단백질의 보존된 결합 서열 구조를 용액 상태 NMR로 결정하였으며, 6.7에서 8.5 범위의 펩타이드 아미드 영역을 분석하였습니다.PP M은 구리와 반응하여 6.6에서 9.0 PP M까지 확장됨을 보였습니다. 약간의 구리 산화로 인한 라인 확장(line broadening)이 베이스라인에서 분명하게 나타납니다. 여기에는 구리 결합 펩타이드의 Roy Toxi와 cozy 스펙트럼의 핑거프린트 영역을 겹쳐서 보여줍니다. 샘플은 시간에 따라 안정적이었으며, 스펙트럼은 잘 분해되어 rosy 실험을 통해 획득한 81개의 NOE 상호작용을 나타냈습니다.해당 분자가 NO C 실험에서 거의 제로에 가까운 NOE 상호작용을 보였으므로, 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 반응 샘플로부터 도출된 펩타이드 앙상블은 50개 구조 중 47개가 backbone 및 heavy atom에 대해 각각 1.44 및 2.07 angstroms의 RMSD 값을 나타냈습니다. 이 중 backbone 및 heavy atom에 대해 각각 0.25 및 0.61 angstroms의 RMSD 값을 가진 13개의 저에너지 컨포머가 추가 분석을 위해 선택되었습니다. 국소 RMSD 플롯은 3번과 7번 잔기 사이의 안정 영역을 보여주었습니다. 프롤린 잔기를 포함하는 강직한 C 말단 영역 외에도, 이 영역은 모든 컨포메이션에서 4번과 7번 잔기 사이의 굴곡진 형태로 나타납니다.굽힘 구조의 안정화는 백본 공여체와 수용체인 glycine 5 및 alanine 2, 그리고 cysteine 6과 cysteine 3 사이의 수소 결합에 의해 이루어집니다. 이러한 굽힘은 cysteine 3과 serine 7 영역의 결합 상수(coupling values) 감소를 통해 확인됩니다. 이 영역을 중심으로 구조들을 중첩시킨 후, cysteine 3, cysteine 6 및 methionine 1을 잠재적 결합 잔기로 고려하여 가능한 결합 잔기들에 대해 분석을 수행하였습니다.가장 짧은 황-황 원자 간 거리는 cysteine 3과 cysteine 6의 folat 그룹 사이였으며, 구리 결합을 도입한 후 계산을 반복하여 분석에 사용될 앙상블을 생성하였습니다. 구리가 결합된 펩타이드의 저에너지 앙상블은 말단 아민이 결합된 구리와 인접해 있음을 보여줍니다. 여기에는 양전위는 파란색으로, 음전위는 빨간색으로 표시된 정전기 전위 분포 등전위면이 나타나 있습니다.아르기닌 잔기는 펩타이드의 백본에서 뻗어 나와 정전기 전위의 양의 로브(positive lobe)를 형성하는 반면, 백본 탄소들은 일직선으로 배열되어 덜 두드러진 음의 정전기 전위를 형성합니다. 숙달되면, 약 1주일의 NMR 측정 시간과 며칠간의 후처리 작업을 통해 구조 분석에 사용할 수 있는 컨포메이션 앙상블을 얻어 구조 결정이 가능합니다. 이 절차를 통해 다른 펩타이드 돌연변이체와 다양한 조건을 분석함으로써, 구리 이온의 결합 및 방출 정도에 필요한 조건에 관한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

1D 및 2D 1H NMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 조정 결정

이 프로토콜은 항암제와 BBR3464 picoplatin의 양태를 결합 다핵 백금 착체의 합성에 사용하기에 적합한 가교 리간드를 형성하기 위해 이소 니코틴산 및 디아 미노 알칸의 아미드 커플 링 반응을 사용하는 방법을 설명한다.

이핵 항암제로 플래티넘 비스 피리딘 계 리간드와 이들 착물의 합성 아미드 커플 링 반응

루테늄 포스 핀 복합체는 널리 균질 촉매 수소화 반응에 사용된다. N -triphos 리간드 N (CH 2 PPH 2) (3)을 담지 세자리 신규 한 루테늄 착물의 시리즈의 합성이보고되어있다. 또한, 레 불린 산 디히 Ru- N -triphos 착체의 화학 양 론적 반응을 설명한다.

루테늄의 시리즈의 합성, 특성 및 반응성<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; 박사</sup&gt; 단지

이 기사에서는 비극성 용매에서 재결정화된 1차 암모늄 트리페닐아세테이트를 사용하여 결정에서 일련의 수소 결합 초분자 클러스터를 구성하는 방법을 설명합니다. 초분자 클러스터의 이러한 선택적 구성은 초분자 클러스터와 그 구성 요소 간의 상관 관계에 대한 효과적인 체계적 대칭 연구로 이어집니다.

건설 및 바이너리 또는 삼항 암모늄 Triphenylacetates와 초분자 클러스터의 시리즈의 체계적 대칭 연구

전기 분무 이온화 orbitrap 질량 분석법에 의한 수은(II)과 디시스테인닐 테트라펩타이드의 서로 다른 상대적 비율로 형성된 복합체의 특성화가 제시됩니다.

전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

이민 대사를 위한 새로운 그룹 IV 금속 촉매는 아민 금속 복합체를 탈수산화 실리카 상에 이식함으로써 제조된다. 표면 금속 단편은 FT-IR, 원소 미세 분석 및 고체 NMR 분광법을 사용하는 것이 특징입니다. 또한 동적 핵 분극 표면 강화 NMR 분광법 실험은 조정 구체의 결정을 보완합니다.

표면 유기 금속 화학의 방법론을 사용하여 실리카 지원 촉매에 의해 이민 대사

이온 이동성 질량 분광법 및 분자 모델링 기술은 설계된 금속 결합 펩타이드 및 구리 결합 펩티드 메탄오박틴의 선택적 금속 킬레이트화 성능을 특성화할 수 있다. 금속 킬레이트 펩티드의 새로운 클래스를 개발하는 것은 금속 이온 과다 균형과 관련된 질병에 대한 치료제로 이어질 도움이 될 것입니다.

금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

간 알코올 탈수소효소의 SNS 핀서 코발트(II) 모델 복합체의 제조가 여기에 제시된다. 복합체는 CoCl2·6H2O로 리간드 전구체를 반응시킴으로써 제조될 수 있고, 디에틸 에테르가 코발트 복합체를 함유하는 아세토니트릴 용액으로 천천히 확산되도록 함으로써 재결정화될 수 있다.

SNS 코발트(II) 간알코올탈수소효소의 집게 모델 복합체 의 제조

온도 범위에서 수집된 NMR 스펙트럼의 선 모양 분석은 키랄, 8좌표, 레늄(V) 다수물 복합체, ReH5(PPh 3)2(sec-부틸아민)에서 내부 배위 구 원자의 재배열을 위한 가이드 역할을 합니다. 선 모양 분석은 또한 이러한 원자 재배열에 대한 활성화 매개변수 ΔH‡, ΔS‡ 및 ΔG‡를 결정하는 데 사용됩니다.

키랄 레늄 폴리하이드라이드 복합체에서 배위 구 재배열을 특성화하기 위한 동적 NMR 스펙트럼의 선 모양 분석

배우세요 NMR 분광법을 사용하여 구리 결합 메탈로챠페론 모델 펩타이드의 구조를 결정하는 방법을. 산소 없는 환경에서 샘플을 준비하고 1D 및 2D ¹H NMR 데이터를 수집하여 공간적 상호작용을 분석합니다.

1D 및 2D ^1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

더 많은 동영상 탐색