1D 및 2D ^1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

이 절차의 전반적인 목표는 구리와 복합체를 이룬 Metallo chaperone 단백질 모방 펩타이드의 구조를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 무산소 환경에서 시료를 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수소 원자 간의 상호 작용을 보여주는 핵 자기 공명 또는 NMR 분광 데이터를 획득하는 것입니다.

다음으로, 공간 상호 작용은 선형 펩타이드 템플릿에 매핑됩니다. 마지막 단계는 데이터에 맞는 대표적인 저에너지 구조를 찾는 것입니다. 궁극적으로 NMR 파생 구조는 결합 모드를 결정하고 구리 결합 복합체에 대한 구조 분석을 수행하는 데 사용됩니다.

X선 결정학과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 매주 결합 복합체를 볼 수 있고 결정화되지 않는 분자 및 복합체를 보는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 구리 결합 단백질에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 다른 금속 챕스와 같은 다른 시스템에 적용하여 단백질이 세포주 환경에서 필수적이지만 잠재적으로 독성이 있는 금속 이온을 안전하게 전달할 수 있는 방법을 연구할 수 있습니다.

먼저, 구리가 산화되는 것을 방지하기 위해 무산소 환경에서 시료를 준비하고, APO 시료를 준비하기 위해, 구리 반응 시료에 대해 450 내지 500 마이크로리터의 중수소화 NMR 등급 용매에 약 1 내지 2 밀리그램의 펩타이드를 용해시키고, APO 펩타이드와 동일한 양을 450 내지 500의 EQU 몰 양으로 금속염으로 용해시킨다. 마이크로리터의 NMR 용매는 중앙 유리 여과지 또는 조사 중인 화합물에 적합하고 흡수하지 않는 기타 기술을 사용하여 각 용액을 여과합니다. 이것은 균질성에 영향을 미치는 금속 입자를 제거하는 데 필수적입니다.

용액을 NMR 튜브로 옮기고 튜브의 샘플을 닫습니다. 글로브 박스를 떠나기 전에 글로브 박스에서 샘플을 꺼내 밀봉하십시오. APO와 구리 반응 샘플의 1차원 양성자 스펙트럼을 NMR 기계에 기록하고 비교합니다.

APO 펩타이드는 유연하며 평균 확증을 보여주지만, 구리와 반응할 때 결합된 펩타이드 아미드는 더 단단한 구조를 갖습니다. 따라서 구리 함유 펩타이드 스펙트럼은 아미드 영역의 화학적 변화에서 상당한 변화를 보여야 하며 피크가 분해될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 것과 동일한 조건에서 최적화되고 아늑한 독소, 코가 많은 NMR 또는 장밋빛 NMR 실험을 설정하고 순서대로 실행합니다.

각 실험 사이에 1차원 실험을 실행하여 데이터 수집 전반에 걸쳐 샘플 구성이 일정하게 유지되는지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에서 논의된 대로 데이터를 처리한 후, noea 및 rosy 스펙트럼에 오버레이된 코지 및 스펙트럼 세트를 준비합니다. 스펙트럼의 모든 NOE 피크를 할당합니다.

지문 영역에서 독소 신호와 겹치는 피크를 할당하는 것부터 시작합니다. 이렇게 하면 Sparky 프로그램 기록으로 후속 피크 할당 항목을 용이하게 할 수 있으므로 할당된 피크는 H 알파에서 아미드 단백질로의 커플링 값을 dedal 각도로 변환합니다. 또한 프로그램 내에서 피크를 적분하고 알려진 거리의 상호 작용을 사용하여 좌표를 변환하여 피크를 거리 제약 조건으로 변환합니다.

피크가 겹치거나 자동 적분 방법을 사용할 수 없는 경우 시각적 추정을 통해 피크를 강, 중간, 약함 또는 매우 약함으로 표시할 수 있으며 이러한 지정은 각각 최대 2.5, 3.5, 4.5 및 5.5 옹스트롬의 거리로 변환될 수 있습니다. 가져올 때 distance constraints 및 dedal angles를 탐색에 대한 올바른 형식으로 가져옵니다. Explore는 표준 화학 기하학을 준수하는 구조를 찾기 위해 확인 공간을 검색합니다.

실험적으로 발견된 거리 제약 조건 외에도 이러한 파라미터 중 어느 것도 위반되지 않는 앙상블을 생성합니다. 이것이 선발 앙상블을 구성합니다. 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 첫 번째 구조 결정 실행을 수행하여 어떤 잔류물이 바이어스 없이 금속 결합에 참여하는지 찾습니다.

4, 000 반복에 대한 켤레 기울기 에너지 최소화를 사용하여 구조를 최소화하기 전에 텍스트 프로토콜에 설명 된대로 NOE 에너지 및 시뮬레이션 된 무릎 꿇기 매개 변수뿐만 아니라 할당의 실수를 쉽게 식별 할 수 있도록 제약 조건을 점진적으로 도입하고, 일반적으로 50 명의 구성원으로 구성된 최종 앙상블을 만듭니다. 마지막으로, 표준 화학 기하학 및 경험적 NMR 파생 제약 조건 보고서를 준수하는 구조의 앙상블을 만듭니다. 총 확인 횟수, NM Rived 제약 조건 및 전체 앙상블의 RMSD를 위반하는 이러한 수의 수(백본 및 모든 무거운 원자 RMSD 값 포함).

저에너지 앙상블을 분석하고 금속 이온을 결합할 수 있도록 어떤 잔류 측쇄가 서로 올바르게 근접해 있는지 확인합니다. 이러한 값이 결정되면 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복합니다. NMR 파생 거리 제약 조건 외에도 이제 결정된 잔류물에 금속 결합 제약 조건을 추가합니다.

금속 이온과 그 토폴로지를 설명하기 위해 적절한 파라미터를 추가합니다. 다른 원자와의 질량 결합 길이, 각도 및 비결합 반발 매개변수와 같은 적절한 물리적 정보를 매개변수 파일에 입력합니다. 토폴로지 파일에 바인딩 정보를 추가합니다.

이 정보에는 어떤 결합이 형성되고 끊어지는지, 그리고 결합의 결과로 어떤 공식 요금이 변경되는지가 포함됩니다. 마지막으로, 풀린 앙상블이 펩타이드에 의해 채택된 확인 공간을 나타내기 전과 같이 구조의 앙상블을 획득합니다. NMR 측정 중에 구조의 모든 확인을 Mal Mall 프로그램으로 가져와 시작 앙상블을 만듭니다.

앙상블을 검사하여 분자의 국소 안정성을 결정합니다. 염기서열을 따라 연속적인 4개의 잔기 영역을 선택하고 프로그램이 RMSD를 가장 낮은 에너지 구조 또는 평균으로 계산하도록 하여 골격 및 측쇄 RMSD 값을 결정하고, 국소 RMSD를 염기서열의 함수로 플로팅하여 분자의 어느 영역이 국소 안정성을 보이는지 결정하고, 분자의 이 영역을 따라 앙상블을 오버레이하고, 이 앙상블을 추가 분석에 사용합니다. NMR 파생 제약 조건을 준수하는 저에너지 확인을 선택합니다.

이것들은 저에너지 앙상블 기록을 형성하고 앙상블의 확인 횟수, 선택 기준 및 RMSD 값을 보고합니다. 금속 결합 모드가 아직 결정되지 않은 경우 저에너지 앙상블을 분석하고 어떤 잔류 측쇄가 올바르지 않은지 확인합니다. 금속 이온을 결합할 수 있도록 서로 근접합니다.

KYMERA를 사용하여 금속 결합이 의심되는 원자 사이의 분자 내 거리를 측정합니다. 앙상블의 평균 거리가 결정되면 이를 계산합니다. 구리 결합 데이터를 포함하여 분석을 반복합니다.

앙상블을 검사하고 MAL 몰 프로그램의 기본 검색 매개변수를 사용하여 분자 내의 국소 2차 구조를 결정합니다. 다음으로, 앙상블을 kymera로 가져옵니다. 2차 구조는 수소 결합에 의해 유지되며 분자의 안정적인 영역을 나타냅니다.

kymera 도구를 사용하여 수소 결합을 측정합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 구조 분석을 계속합니다. 그런 다음 모든 구조적 발견을 요약하여 그들이 어떻게 서로를 강화하는지 밝힙니다.구리 결합 단백질 모델을 연구하기 위해, 파생된 선형 펩타이드 내 단백질의 보존된 결합 서열의 구조는 용액 상태 NMR, 펩타이드의 아미드 영역이 6.7에서 8.5까지인 것에 의해 결정되었습니다.

PP M은 구리와의 반응시 6.6 내지 9.0 PP M으로 팽창을 보였으며 약간의 구리 산화로 인한 라인 확장은 기준선에서 분명합니다. 여기에 표시된 것은 Roy Toxi의 지문 영역과 구리 결합 펩타이드의 코지 스펙트럼의 오버레이입니다. 샘플은 시간이 지남에 따라 안정적이었고 스펙트럼은 잘 분리되었으며 장밋빛 실험으로 얻은 81개의 NOE 상호 작용을 제공했습니다.

분자가 NO C 실험에서 거의 0의 NOE 상호 작용을 제공했기 때문에 반응 된 샘플에 대해 파생 된 펩타이드의 앙상블은 금속에 대한 제약 조건을 사용하지 않고 백본과 무거운 원자에서 각각 1.44 및 2.07 옹스트롬의 RMSD 값을 가진 50 개의 비 구조 중 47 개를 제공했습니다. 이 중 13개의 저에너지 순응체는 추가 분석을 위해 선택되었으며, 백본과 무거운 원자에서 각각 0.25 및 0.61 옹스트롬의 RMSD 값을 가졌습니다. 국소 RMSD 플롯은 프롤렌 잔기를 포함한 강성 C 말단 영역 외에도 잔기 3과 7 사이의 안정성 영역을 보여주었으며, 이 영역은 모든 확인에서 잔기 4와 7 사이의 굽힘 확인에서 발견됩니다.

굽힘 확인은 골격 공여체와 수용체 글리신 5 및 3 아닌 2, 시스테인 6 및 시스테인 3 사이의 수소 결합에 의해 안정화됩니다. 이 굽힘은 또한 시스틴 3 및 사인 7에서 이 영역의 감소된 결합 값에 의해 분명합니다. 확인은 이 영역에 중첩되고 시스틴 3, 시스틴 6 및 메티오닌 1을 잠재적인 결합 잔기로 간주할 때 가능한 결합 잔기에 대해 분석되었습니다.

황에서 황 원자까지의 가장 짧은 거리는 시스테인 3과 시스테인 6의 엽산 그룹 사이에서 구리 결합이 도입되고 분석에 사용되는 앙상블을 제공하기 위해 계산을 반복하는 것이었습니다. 구리 결합 펩타이드의 저에너지 앙상블은 말단 말단 아민이 결합 구리에 근접하다는 것을 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 정전기 전위 분포 등면으로, 양의 전위는 파란색으로, 음의 전위는 빨간색으로 표시됩니다.

아르기닌 잔류물은 펩타이드의 골격에서 뻗어 정전기 전위의 양성 엽을 형성하는 반면, 골격 탄소 수율은 덜 두드러진 음의 정전기 전위를 형성하는 선으로 배열됩니다.일단 마스터되면 구조 분석에 사용할 수 있는 확인 앙상블을 얻기 위해 약 일주일의 NMR 시간과 또 다른 며칠의 정밀 검사로 구조적 결정을 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 구리 이온의 다양한 결합 및 방출 정도에 필요한 조건을 해결하는 추가 질문에 답하기 위해 다른 펩타이드 뮤탄과 다른 조건을 분석할 수 있습니다.