고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 매직각 회전(magic angle spinning) 고체 NMR 분광법을 통해 불용성 및 비결정성 초분자 단백질 복합체의 구조를 원자 해상도로 연구하는 것입니다. 본 영상에서는 고체 NMR을 이용하여 생체 분자 단백질 복합체의 원자 구조를 연구하기 위한 필수적인 방법론적 단계들을 제시하겠습니다. 이러한 복합체들은 본질적으로 불용성이며 비결정성이기 때문에 원자 구조를 연구하는 것이 매우 어렵습니다.

고체 상태 NMR은 조립된 객체의 크기나 용해도의 제한 없이 원자 수준의 해상도로 분자 구조와 역학을 연구할 수 있는 신흥 기술입니다. 본 영상에서는 동위원소가 표지된 시료의 준비, 고체 상태 NMR을 이용한 구조 데이터의 수집 및 분석을 포함하여, 고체 상태 NMR로 생체 분자 단백질 조립체의 원자 구조를 시각화하는 핵심 단계를 설명합니다. 고체 상태 NMR 워크플로우의 첫 번째 단계는 C13 N15 표지 단백질 하위 단위를 생성하고 이를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 것입니다.

미리 데워둔 LB 배지 15 mL의 사전 배양액에 형질전환된 E.coli 세포 한 개의 콜로니를 접종합니다. 37 °C에서 200 RPM으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 본 배양을 위해, 필요한 동위원소 표지 탄소 및 질소원이 포함된 미리 데워둔 N9 배지 1 L에 사전 배양액 전체를 옮깁니다.

여기에는 N15 표지 염화암모늄, 균일 C13 표지 글루코스, 선택적 C13 표지 글루코스 또는 선택적 C13 표지 글리세롤이 포함될 수 있습니다. 37 °C에서 배양하고, 배양이 혼탁해지는 즉시 600 nm에서 흡광도를 측정하십시오. OD 값이 0.8에 도달하면, 0.75 mM IPTG로 4시간 동안 단백질 발현을 유도하십시오. 최적의 유도 조건은 단백질마다 다를 수 있음에 유의하십시오.

6,000 G, 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 단백질 하위 단위체들을 정제한 후, 인비트로(in vitro)에서 조립합니다. 원심분리 필터 장치를 사용하여 단백질을 약 1 mM 농도로 농축합니다.

이를 위해 시료를 필터 유닛에 넣고 4,000 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 단계 사이에는 필터 막에 단백질이 침착되는 것을 방지하기 위해 피펫으로 필터 유닛 내의 용액을 부드럽게 섞어줍니다. 원하는 농도에 도달할 때까지 이 과정을 반복합니다.

샘플을 팔콘 튜브로 옮기고 실온에서 일주일 동안 교반하며 배양합니다. 일반적으로 서브유닛이 필라멘트로 중합되면서 용액이 탁해집니다. 세균 오염을 방지하기 위해 0.02% w/v sodium azide를 첨가합니다.

단백질 어셈블리를 수확하려면 샘플을 20,000 G, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리하십시오. 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 표면을 덮을 정도의 액체만 남기고 상층액의 대부분을 흡입하여 제거한 후, 측정 전까지 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 이제 고체 NMR을 이용한 구조 분석에 필수적인 실험들을 제시하겠습니다.

C13 핵에서 검출되는 1차원 교차 편극(cross polarization, CP) 및 INEPT 실험은 각각 어셈블리 내의 강직한 단백질 세그먼트와 유연한 단백질 세그먼트를 검출하는 데 사용됩니다. 또한, 이를 통해 구조적 균질성과 국소적 다형성의 정도를 추정합니다. 본 실험에서는 표준 실험값을 사용합니다.

일반적인 파라미터 범위는 프로토콜에 표시되어 있습니다. 로터를 NMR 자석에 삽입하고 프로토콜에 설명된 대로 매직각 회전(magic angle spinning)을 시작하십시오. 원하는 회전 주파수를 설정하고, 오차 범위 ±10 hertz 이내로 안정화되었는지 확인하십시오.

16회의 스캔을 사용하여 단일 펄스 1차원 양성자 스펙트럼을 기록하십시오. 1D 양성자 탄소 CP를 설정하십시오. CP 실험은 단단한 구조의 잔기에서 발생하는 신호를 보여줍니다. 초기 실험 파라미터는 표준 화합물에 대한 표준 최적화 절차를 통해 설정합니다.

감도가 충분히 높을 때 샘플 내에서 펄스 보정과 디커플링 파라미터를 최적화할 수 있습니다. 여기서는 16회 스캔으로 CP를 기록합니다. CP 접촉 시간의 최적화 과정에서 보여지는 것과 같이, 최대 신호 강도를 기준으로 CP 접촉 시간과 전력 레벨을 선택합니다.

이 예시에서 최대 강도는 800 milliseconds에서 도달합니다. 디커플링 파라미터 또한 표준 화합물 보정 시 원래 설정했던 값에서 다시 조정해야 합니다. 마지막으로, 신호와의 중첩을 피하기 위해 여기서는 18 kilohertz로 표시된 주어진 매직 각 회전 주파수에서의 스피닝 사이드 밴드 위치를 주의 깊게 관찰하십시오.

1차원 스펙트럼 지문 역할을 하는 참조 1D proton carbon CP 스펙트럼을 기록합니다. 여기서는 800 millisecond CP 접촉 시간, 100 kilohertz 디커플링 강도, 3초의 리사이클 지연 시간 및 20 millisecond의 획득 시간으로 128회 스캔을 누적합니다. apathi-zation 없이 CP 실험을 처리합니다.

시료 내의 C39를 추정하여 구조적 질서와 균질성을 나타내는 분리된 피크를 선택하십시오. 여기서 반치폭으로 측정된 선폭은 약 60~70 Hz이며, 이는 어셈블리 내의 단백질 구조가 잘 정렬되어 있음을 나타냅니다. 단백질 어셈블리의 가동성이 높은 부분을 조사하기 위해 1차원 proton-carbon INEPT 실험을 설정하십시오.

모바일 단백질 세그먼트의 핑거프린트로 사용할 참조 inept 실험을 기록하십시오. 일반적인 파라미터는 128회 스캔 및 25 milliseconds의 획득 시간입니다. 양성자 탄소 inept 실험을 처리하십시오.

신호의 수와 그 위치는 각각 잔기의 유동성 범위와 아미노산 조성을 나타냅니다. 여기서는 전체 단백질이 조립 구조 내에서 강직한 영역에 있으므로, twist buffer CH2 merit-y의 신호만 관찰됩니다. 단백질 구조의 형태 분석은 조립체의 모든 강직한 잔기에 대한 고체 NMR 공명 할당을 기반으로 합니다.

화학적 이동(chemical shifts)은 국소 화학 환경에 매우 민감한 프로브이므로, 이를 통해 단백질의 2차 구조를 예측할 수 있습니다. 전체 3D 구조 결정은 9 Å까지의 분자 내 및 분자 간 원자 근접성을 암호화하는 거리 구속(distance restraints)과 같은 구조 데이터의 수집을 바탕으로 이루어집니다. 여기서는 기본적인 2차원 실험의 기록 방법과 순차적 할당(sequential assignment)의 예를 보여드리겠습니다.

그런 다음, 선택적으로 C13 표지된 시료에서 기록된 실험으로부터 거리 구속 조건을 수집하는 방법에 대해 간단히 시연하겠습니다. 잔기 내 탄소-탄소 상관관계를 검출하기 위해 짧은 혼합 시간을 갖는 2차원 탄소-탄소 PDSD 실험을 설정하십시오. 1차원 CP 실험의 초기 양성자-탄소 교차 편극 단계 값을 복사하십시오.

균일하게 C13 표지된 시료의 경우 혼합 시간은 50 milliseconds로 설정할 수 있습니다. 여기서는 간접 차원과 직접 차원의 획득 시간을 각각 15 milliseconds 및 20 milliseconds로 선택하였습니다. PDSD 스펙트럼을 처리하기 위해, sine-bell shift가 3.5인 QSINE 윈도우 함수를 사용합니다.

잔기별 할당을 가능하게 하려면, 짧은 혼합 시간을 사용한 PDSD 설정을 이용하여 100에서 200밀리초의 혼합 시간을 갖는 중간 혼합 시간 PDSD를 기록하십시오. 완전한 공명 할당을 위해서는 질소 검출 실험을 포함한 추가 스펙트럼이 흔히 필요하며, 이에 대한 자세한 내용은 프로토콜에 기술되어 있습니다. CCPNMR Analysis와 같은 NMR 분석 프로그램을 선택하십시오.

2D 스펙트라를 소프트웨어로 불러오고, 일차 단백질 서열을 이용하여 분자 객체를 생성합니다. 짧은 혼합 시간의 PDSD 스펙트럼에서 관찰되는 아미노산 종류의 식별부터 시작하십시오. 스핀 시스템의 탄소 원자들을 연결하면 잔기 유형별 지정이 가능합니다.

여기서는 threonine 잔기의 스핀 시스템을 할당합니다. C-alpha, C-beta 및 C-gamma 핵 사이의 편극 전이는 PDSD 스펙트럼에서 물리적 교차 피크를 생성합니다. 이 절차를 통해 가능한 많은 잔기를 식별해 보십시오.

짧은 혼합 시간과 중간 혼합 시간의 PDSD 스펙트럼을 겹쳐서 표시합니다. 중간 혼합 시간 PDSD에서 관찰되는 보조 피크는 일반적으로 연속된 잔기 간의 접촉으로 인해 발생합니다. 하나의 스핀 시스템의 공명 피크를 표시하고, 중간 혼합 시간 PDSD에서 다른 스핀 시스템의 공명 주파수와의 상관관계를 찾습니다.

우리는 필라멘트형 단백질 조립체에서 thenium 33에서 isolutane 32로 이어지는 순차적 할당을 보여줍니다. thenium 스핀 시스템의 공명 주파수는 32의 isolutes 탄소 주파수에서 관찰되며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 질소 검출 스펙트럼을 이용한 할당 절차와 할당 결과로부터 단백질 2차 구조를 얻는 방법은 프로토콜에 설명되어 있습니다.

철저한 공명 할당 후에, 장거리 구속 조건의 식별을 진행할 수 있습니다. 장거리 구속 조건은 서로 떨어진 잔기 사이의 분자 내 또는 분자 간 탄소-탄소 근접성을 의미하며, 이는 단량체 하위 단위의 3차 구조와 어셈블리 내 하위 단위의 배열을 모두 정의합니다. 여기서는 선택적으로 C13 표지된 시료가 특히 중요합니다.

선택적으로 C13 표지된 시료를 사용하여 400 milliseconds에서 1 second 사이의 혼합 시간으로 기록한 긴 혼합 시간 탄소-탄소 PDSD와 중간 혼합 시간 PDSD를 겹쳐서 표시합니다. 가능하다면, 두 PDSD 모두 동일한 선택적 표지 시료에서 기록되어야 합니다. 부수적인 피크들은 더 멀리 떨어진 C13 원자들 사이의 상관관계로 인해 발생합니다.

공명 할당 과정에서 선택적 표지법을 고려하십시오. 이 경우에는 1-3-글리세롤입니다. 여기서는 양쪽 차원 모두에서 명확하게 할당된 장거리 접촉 피크의 예를 강조 표시하였습니다.

Thenium 33 C-beta와 protein 45 C-alpha입니다. 장거리 거리 식별을 완료한 후, 구속 조건은 모호하지 않음 또는 모호함, 그리고 분자 내 또는 분자 간 구속 조건으로 분류됩니다. 구조 모델링을 위해 준비해야 할 구속 조건 목록은 프로토콜에 기재되어 있습니다.

다양한 프로그램을 이용한 구조 모델링 튜토리얼은 온라인에서 확인할 수 있습니다. 고체 NMR 데이터는 단독으로 또는 상호 보완적인 데이터와 결합하여 초분자 집합체의 원자 수준 구조 결정을 가능하게 합니다. 고체 NMR의 장점은 한편으로 2차 구조 정보와 분자 내 인터페이스로부터의 원자 간 거리 제한 조건을 모두 제공할 수 있다는 점이며, 이는 모델링 과정에 통합될 수 있습니다.

하지만 다른 한편으로, 고체 NMR 분광법의 독특한 특징은 온전한 초분자 조립체의 분자 간 계면에서 원자 거리 제한 조건을 수집할 수 있는 능력에 있습니다. 그러나 분자 내 및 분자 간 제한 조건 할당을 검출하고 구별하는 것은 지루한 과정이 될 수 있으며, 일반적으로 선택적으로 C13 표지된 시료의 준비가 필요합니다. 하지만 선택적 표지 전략, 분광계 하드웨어 설계 및 고체 NMR 방법론의 새로운 발전으로 인해, 이 기술은 객체의 크기, 장거리 질서 또는 결정성의 제한 없이 원자 수준의 분자 정보를 제공한다는 이론적 잠재력을 점점 더 실현하고 있습니다.

이 방법은 생체분자 복합체의 원자 구조를 연구할 수 있게 해줍니다. 고해상도 데이터를 얻기 위해서는 NMR 조건을 최적화할 수 있도록 시료를 세심하게 준비하는 것이 매우 중요합니다. 본 프로토콜을 통해 단백질 복합체에 대한 정보인 원자 수준의 해상도를 얻을 수 있습니다.

또한, 이 기술은 구조 생물학의 다른 기술들과 결합하여 3차원 모델을 얻는 데 활용될 수 있습니다.