Name: 고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: 배우세요 고체 핵 자기 공명 분광학을 활용하여 불용성 단백질 어셈블리의 원자 규모 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 결정화 없이도 고분자 복합체의 상세한 구조 정보를 제공합니다.

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이 작품은 ANR (13-PDOC-0017-01 대형화 및 ANR-14-CE09-0020-01 앨 러 배 마에)에 의해 투자, "미래를 위한 투자" 프로그램 IdEx 보르도/CNRS 대형화 (PEP 2016) 참조 ANR-10-IDEX-03-02 대형화를,는 Fondation la Recherche Médicale ( FRM-앨 러 배 마에 AJE20140630090), FP7 프로그램 (FP7-사람-2013-CIG 앨 러 배 마에) 및 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (ERC 시작 그랜트를 앨 러 배 마, 계약 번호 639020)에서 유럽 연구 회의 (ERC)와 프로젝트 " WEAKINTERACT입니다. "

저자는 공개 없다.

고체 NMR (SSNMR)는 원자 수준에서 고분자 단백질 어셈블리 특성화에 대 한 선택의 방법입니다. SSNMR 기반 구조 결정에 중앙 문제 중 하나는 일반적으로 저해상도 모델 (포함 하는 보조에서에서 배열 하는 다양 한 정밀의 3 차원 구조 모델 구축 있도록 조사 시스템의 스펙트럼 품질 구조 요소와 약간의 3D 정보) 의사 원자 3 차원 구조. 수량 및 품질의 구조 정보를 다차원 SSNMR 실험에서 추출 어셈블리의 고해상도 NMR 구조 계산 하 키입니다.
설명된 프로토콜 13C-13C 15N-13C 구조 억제 여러 2D (그리고 때로는 3D) 스펙트럼 높은 신호-잡음 기록 요구의 검출에 의존 합니다. 적당 한 매스 주파수에서 (&#60; 25 kHz), 샘플은 단백질 양의 최대 ~ 50 mg, 샘플 수 분에 의존에 대 한 허용 하는 3.2-4 m m 직경의 크기와로 터에 도입. 회전자 내부 샘플의 금액은 SSNMR 스펙트럼에서 신호 대 잡음 비율, 장거리 거리 지지대의 검색 및 그들의 명백한 할당에 대 한 결정적 요인에 직접 비례 합니다.
스펙트럼 해상도 순차 공명 할당 및 억제 컬렉션 중 중요 한 매개 변수. 최적의 결과 얻으려면 샘플 준비 매개 변수는 소 단위 및 어셈블리 조건 (pH, 버퍼, 진동, 온도, 등등)의 정화에 특히 최적화가 필요 합니다. 샘플 최적화는 여러 가지 조건에 대 한 어셈블리 관찰 되었습니다, 레이블이 없는 샘플 준비 하 고 1 D 1H-13C CP 스펙트럼 (2.1 단계에서 설명) 각 준비 샘플에 기록 하는 것이 좋습니다. 스펙트럼 스펙트럼 분해능 및 분산 기반으로 최적의 조건을 확인할 수 있습니다 다른 준비 사이 비교를 제공 합니다.
SSNMR 데이터의 품질 강력 하 게 특히 편광 전송 단계에 NMR 인수 매개 변수 선택에 따라 달라 집니다. 높은 자기 분야 강점 (≥600 m h z 1H 주파수)를 사용 하 여 높은 감도 및 스펙트럼 분해능, 고분자 단백질 어셈블리 같은 복잡 한 목표를 직면 하는 때 필요한 필수적 이다.
많은 경우에 제한 요소가 분석기 가용성 이다. 따라서, 준비를 샘플의 현명한 선택 분석기 세션을 앞에 해야 합니다. 어떤 경우에, 균일 하 게 13C, 15에 N 표시 된 샘플은 순차적이 고 내부 잔류 공명 할당을 수행 하는 필수. 단백질 고체 NMR 기법에 의해 할당 된71참조. 적당 한 매스 주파수에서 고분자 어셈블리의 구조 결정 필요 선택적으로 13C 표시 샘플; 장거리 13C-13C와 13C-15N 감지 주소록 샘플 기반 1, 3-13C-및 2-13C-gylcerol / 1-13C-및 2-는13C-포도 당 라벨 일반적으로 위에서 설명한 대로 사용. 두 가지 레이블 구조 사이 선택 스펙트럼 신호 대 잡음 비율 및 해상도 기반으로 합니다. 인트라넷 및 intermolecular 장거리 연락처 사이 구별, 혼합된 레이블 및 희석 샘플 효율적인 밝혀졌다.
즉, 원자 SSNMR 구조 연구를 위한 중요 한 단계는: (i)의 준비는 소 단위 및 어셈블리 최적화 될 필요가 우수한 샘플 수량 및 품질을 얻기 위해, (ii) 분석기 필드 강도 및 수집 매개 변수 될 필요가 선택 신중 하 게; (3) 선택적 라벨 전략 3 차원 구조 결정을 위해 요구 되 고 필요한 데이터의 데이터 품질 및 무료 데이터의 가용성에 따라 다릅니다.
막 단백질에서 homomultimeric 나노-개체에 이르기까지 supramolecular 시스템의 다양 한 범위에 그것의 적용에도 불구 하 고 SSNMR는 종종 mg-isotopically 분류 자료의 수량에 대 한 필요에 의해 제한 됩니다. 최근 기술 개발 1H 검출 NMR로 길을 열어 초고속 마스 (≥100 kHz) SSNMR 고 밀어 최소한의 샘플 수량 제한 하위 mg 72,,7374. 그럼에도 불구 하 고, 상세한 구조 연구에 대 한 13C 라는 샘플 불가결 SSNMR 조립 샘플에서 생체 외에서 또는 어디 셀에서 최소한의 매체에 생존 하는 유기 체에 표현 하는 시스템에 적용을 제한 하는 SSNMR (리뷰 75,,7677,78참조)을 위해 새로운 방법입니다.
고해상도 3D 구조를 가져올 SSNMR 응용에서 중요 한 요소는 스펙트럼 분해능: 어셈블리에 기본 구조적이 스펙트럼 해상도 스펙트럼 분석을 제한할 수 있습니다. 잔류물 특정 13C 라벨 수 있습니다 어떤 경우에는 대안을 제공 (최근 예제 참조 79,80)에 대 한 구조 모델을 얻기 위해 전략적 잔류물에 특정 거리 정보를 가져옵니다.
3 차원 구조 결정을 위한 SSNMR 여전히 필요 합니다 종종 긴 데이터 수집 시간 방식과 시스템에 600-1000 MHz (1H 주파수) 주 몇 일에 따라 정교한 악기에 여러 데이터 집합의 컬렉션을 분 광 계입니다. 따라서, 분석기 시간에 대 한 액세스-깊이 SSNMR 연구에 제한 요소를 수 있습니다.
3,,5764,70, SSNMR에서에서와 같은 구조적 지지대의 높은 숫자를 식별 하기 위해 충분 한 품질의 SSNMR 데이터를 선도 하는 homomultimeric 단백질 어셈블리의 경우 여전히 액세스할 수 없는 미세한 크기에 있습니다. 따라서, homomultimeric 어셈블리의 de novo SSNMR 구조 결정에 그들 또는 길이 당 질량 (MPL) 데이터 이상적으로 보완 SSNMR 데이터를 대칭 매개 변수를 파생. 혼자 SSNMR 데이터는 원자 내부-및 intermolecular 인터페이스 제공
SSNMR는 높은 EM 또는 MPL 측정 등 구조 기술로 보완 하지만 데이터 또한 완벽 하 게 엑스레이 결정학 또는 솔루션 NMR 돌연변이 또는 잘린 소 단위에 의해 얻은 원자 구조와 결합 될 수 있다. 다른 구조적 데이터의 함께 고분자 어셈블리 (대표 예를 들어 그림 6 참조)의 원자 3D 모델을 결정 하기 위한 수 있다 문학에서 연구의 증가 수를 찾을 수 있습니다.
구조 생물학의 분야에서 연구를 유망 기술로 SSNMR 나온다원자 수준에서, 즉 제공 구조 데이터 원자 규모에서 불용 성 및 비 결정 어셈블리입니다. 이 점에서 SSNMR는 솔루션 NMR와 분자 어셈블리, 막 단백질 RNA 뿐만 아니라 바이러스 성 봉투, 세균성 필 라 멘 트 또는 amyloids, 그들의 기본 환경 및 단백질 어셈블리에 포함 하 여 x-선 결정학을 펜 던 트와 RNA-단백질 복합물 (참조 예:81). 그것의 매우 다양 한 응용 프로그램에 체 외에서 세포 맥락에서 2 차, 3 차 및 4 급 구조 변경 내용 추적 등 원자 규모 (예: 82) 파트너 분자와 상호 작용 표면 식별 및 조립된 단지의 맥락에서 매핑 분자 역학 복잡 한 바이오 어셈블리에 미래 구조 연구에 SSNMR의 중요 한 잠재력을 나타냅니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>M9 매체</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2포4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나2HPO4</td>
			<td>6.7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 비타민 믹스 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-포도 당</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 재조합 단백질에 대 한 최소한의 표현 매체의 구성 에서 생산 대장균 BL21 셀.

매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (SSNMR) 발전 구조는 원자 해결책에 고분자 단백질 어셈블리 특성에 대 한 효율적인 도구를 제공 합니다. 이러한 단백질 어셈블리는 많은 생물학 과정에 필수적인 역할을 재생 하는 유비 쿼터 스 시스템입니다. 그들의 분자 구조, 상호 작용 및 역학 SSNMR 연구에 표시 되었습니다으로 액세스할 수 있는 바이러스 성 capsids (1) 세균 감염 메커니즘 (분 비 시스템2,3, 피리4), 막 단백질 복합물5,6,,78 그리고 기능 amyloids 9,,1011. 이러한 유형의 분자 어셈블리 pathologies와 같은 신경 퇴행 성 질환 단백질 misfolded, 녹말 체 상태에서 모이고 탈 셀 동작 시키거나 세포 죽음 12,13에 자극 또한 수 있습니다. 단백질 어셈블리 종종 소, 필 라 멘 트, 모 공, 튜브, 또는 나노 입자를 포함 하 여 다양 한 형태의 큰 supramolecular 개체로 소 단위 단백질의 여러 복사본의 대칭 oligomerization에 의해 만들어집니다. 제 사기 건축 공간 및 시간 어셈블리를 구성 하 고 세련 된 생물학적 기능에 대 한 단백질 소 단위 사이 약한 상호 작용에 의해 정의 됩니다. 이러한 어셈블리에 원자 규모에서 구조 조사는 그들의 본질적인 용해성부터 고해상도 기법에 대 한 도전 및 그들의 비 결정성 기존의 엑스레이 결정학 또는 NMR 해결책의 사용을 제한 하는 매우 자주 접근 한다. 매직 앵글 회전 (MAS) SSNMR 불용 성 고분자 어셈블리에 원자 해상도 데이터를 얻기 위해 신흥 기술 이며 복잡 한 바이오 시스템 등의 증가 대 한 3 차원 원자 모델을 해결 하려면 효율성 입증 세균성 필 라 멘 트, 녹말 체 어셈블리 및 바이러스 성 입자 14,15,,1617,18,19,20, 21,22. 높은 자기장, 방법론 개발 및 샘플 준비 기술 진보는 고분자 다양 한 환경에서 특히 그들의 생물학 관련 불용 성 단백질을 조사 하는 강력한 방법으로 매스 SSNMR 설립 조립 상태 또는 기술은 매우 cryo 전자 현미경 검사 법을 보완 하는 세포 세포 막에서. 대부분의 경우에 대칭의 매우 높은 학위 같은 단백질 어셈블리 특징. Homomolecular 어셈블리에서 모든 단백질 소 단위는 동일한 로컬 구조 했 매스 SSNMR이이 기능을 악용 및 따라서 거의 동일한 SSNMR 시그니처를 크게 분석의 복잡성을 감소.
적당 한 매스에 의해 고분자 단백질 어셈블리의 구조 연구에 대 한 효율적인 프로토콜 (&#60; 25 kHz) SSNMR이이 비디오에 제시 하 고 다른 단계 (그림 1)로 세분화 될 수 있습니다. 우리 filamentous 단백질 어셈블리 ( 그림1에서 참조 강조 단계), 단백질 소 단위 정화를 제외 하 고 각 단백질에 대 한 서로 다른 exemplified SSNMR 구조 연구의 흐름의 중요 한 단계를 보여줄 것입니다. 어셈블리 구조 연구, 그리고 어떤 전문 자습서 SSNMR 분광학 및 구조 계산의 기술/방법론 세부 사항에 가지 않고 중요 하지만 수 있습니다 온라인. 현재 프로토콜은 주로 고체 NMR 실험 MAS 조건 하에서 수행에 초점을, 하는 동안의 사용 생물 환경 23,,2425,26 정렬 , 27, 정렬 된 bicelles 같은 단백질 구조와 매스 기술 없이 막 같은 미디어에서 동적 단백질-단백질 상호 작용의 수사를 위해 수 있습니다. 우리는 중요 한 SSNMR 스펙트럼 분석 및 해석의 기록 뿐만 아니라 단백질 식 및 어셈블리 단계 표시 됩니다. 우리의 목표는 SSNMR 기술로 고분자 어셈블리의 원자 해결책 구조 연구를 수행 하는 독자를 사용 하는 구조 분석 파이프라인에 대 한 통찰력을 제공 하는 이다.
3 섹션을 포함 하는 프로토콜:
1. 고체 NMR 샘플 생산
고체 NMR 분석에 필수, 단백질 표현 될 필요가 고분자 어셈블리의 구성 요소, 동위 원소 분류, 정제 하 고 조립 체 외에 (예를 들어 참조 그림 2)에 대 한 네이티브 처럼 복잡 한 상태에 . 높은 NMR 감도, 13C와 15N 라벨에 동위 원소 농축이 필요한 최소한의 세균성 식 미디어 13C와 균일 하 게 13 같은 15N 소스 보완 사용 C 라는 포도 당/글리세롤과 15NH4Cl 각각. 프로토콜의 나중 단계에서 선택적으로 13C 라는 샘플 생산 선택적으로 13C 표시와 같은 소스 (1, 3-13C)-와 (2-13C)-글리세롤 (또는 (1-13C)-와 (2-13C)- 포도 당) NMR 분석을 촉진 하는 데 사용 됩니다. 50 15N-및 50 13C 표시 또는 50%의 아데닌 혼합물에 해당 하는 혼합된 레이블된 샘플 (1, 3-13C)-50% (2-13C)-포도 당 intermolecular의 탐지를 설명 하기 위해 도입 상호 작용입니다. 어셈블리 단계에서 엄격한 조건으로 단백질 순도 높은 수준의 최종 샘플의 균질 구조 순서를 보장 하기 위하여 핵심 요인이 있습니다.
2. 예비 구조 특성화 기반 1 차원 (1d) 고체 NMR
선물이 SSNMR에 의해 구조 분석에 대 한 필수적인 실험. 1 차원 (1d) 크로스-편광 (CP)와 무능 / RINEPT28 실험, 13C 핵에 어셈블리에 각각, 견고 하 고 유연한 단백질 세그먼트를 감지 하 고 구조의 정도 추정 하는 데 사용 됩니다 동질성 그리고 로컬 다형성 (대 한 예를 들어 그림 3참조).
<st></st>룽 > 3. 구조적 분석 및 3 차원 구조 결정
하위 섹션 1과 2 우려 화학 변화는 지역 환경에 매우 민감한 프로브와 피/psi를 예측에 사용할 수 있습니다 단백질 어셈블리의 모든 단단한 잔류물의 SSNMR 공명 지정에 따라 구조적 분석 2 면 각 하 고 그로 인하여 이차 구조를 결정 합니다. 그림 4 단백질 어셈블리. 의 딱딱한 코어에서 순차적 공명 지정의 예를 보여 줍니다. 3 차원 구조 결정은 구조적 데이터의 수집 같은 기반 거리 억제 인코딩 가까운 근거리 (&#60; 7-9 Å), 인트라넷 및 intermolecular 정보 포함. 하위 섹션 3와 4는 장거리 먼 구속 수집 및 해석 설명합니다. 장거리 연락처에서에서 발생 하는 찌 꺼 기 나 j,와 함께 intramolecular 13C-13C 근거리로 정의 | i j | ≥4, 그로 인하여 3 차 단백질 겹 intermolecular 13C-13C 근거리 또는 단위체 소 단위의 정의 어셈블리에 단백질 소 단위 사이 intermolecular 인터페이스 정의 내부-및 intermolecular 인터페이스는 그림 5에 나와 하 고 있습니다. SSNMR 억제 감지 13C-13C와 15N-13C recoupling 실험은 일반적으로 internuclear 거리에 대 한 인코딩 &#60; 1 nm. 하위 4 intermolecular 거리 지지대의 검색에 설명합니다. 균질 분류 샘플 (즉, 균일 하 게 또는 선택적으로 표시는 100%)를 사용 하 여 대칭 단백질 어셈블리에서 intermolecular 소 단위-소 단위 상호 작용을 식별 하는 것은 제한 된로 두 내부-및 남북-molecular 연락처 이어질 탐지 가능한 신호입니다. Intermolecular 근거리의 명백한 탐지 집계 이전 결합 2 개의 다르게 분류 샘플의 아데닌 혼합물 포함 된 혼합된 레이블이 지정 된 샘플을 사용 하 여 이루어집니다. 하위 5 간단히 구조 모델링을 소개합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
그림 1 : 고체 NMR에 의해 원자 해결책 구조 연구의 워크플로. 13 C 15N 동위 원소 라는 단백질 생산, 소 단위 정화, 소 단위 어셈블리, 어셈블리 형성, SSNMR 실험, SSNMR 실험 분석 및 거리 지지대의 추출의 제어 및 구조 모델링 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR 분광계 (> 11.7 Tesla)</td><td>Bruker-triple</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>resonance MAS SSNMR 프로브 헤드&nbsp;</td><td>Bruker-SSNMR</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>로터 4mm</td><td>Bruker</td><td>K1910</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5804 R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5805000629</td><td></td></tr><tr><td>GeneQuant 1300 분광계</td><td>Dutscher</td><td>28-9182-13</td><td></td></tr><tr><td>IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td><td>Dutscher</td><td>228001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4450 벤치탑 오비탈 쉐이커</td><td>Dutscher</td><td>78376</td><td></td></tr><tr><td>튜브 리볼버 교반기</td><td>Dutscher</td><td>79547</td><td></td></tr><tr><td>sonopuls HD 3100</td><td>Bandelin</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser electroporator</td><td>Biorad</td><td>165-2100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mini-PROTEAN 테트라 셀 시스템</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>AKTA 순수 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td></td></tr><tr><td>캐필러리 마이크로맨 M25 피펫</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>F148502</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>amiconR ultra-15</td><td>sigma</td><td>Z740199-8EA</td><td></td></tr><tr><td>모세관 및 피스톤</td><td>Gilson&nbsp;</td><td></td><td></td>F148112</tr><tr><td>주걱</td><td>Fisher</td><td>13263799</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 13C6</td><td>시그마</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>암모늄-15N-클로라이드</td><td>시그마</td><td>299251</td><td></td></tr><tr><td>1,3 13C2 글리세롤</td><td>시그마</td><td>492639</td><td></td></tr><tr><td>2 13C 글리세롤</td><td>시그마</td><td>489484</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>시그마</td><td>K1876</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린</td><td>시그마</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>염화철</td><td>시그마</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>염화아연</td><td>시그마</td><td>793523</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비타민 용액 (100&times;)</td><td>시그마</td><td>M68954</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>피셔</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>시그마</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>178837</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unicorn 6.3</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Akta systems</td></tr><tr><td>ccpNMR</td><td>CCPN&nbsp;</td><td></td><td>분광계 시스템</td></tr></tbody></table>

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular 단백질 어셈블리는 호스트 병원 체 상호 작용, 신경 퇴행 성 질환의 전파에 바이러스 성 감염에서에서 배열 하는 생물 학적 과정에 근본적인 역할을 재생 합니다. 이러한 어셈블리는 다양 한 세포 기능을 실행 하거나 해로운 결과 가져올 수 있는 큰 고분자 개체를 형성 하는 비 공유 방법에는 여러 단백질 소 단위에서 구성 됩니다. 어셈블리 메커니즘 및 그 고분자 어셈블리의 기능에 원자 통찰력 남아 그들의 고유한 용해성 이후 종종 부족 및 비 결정성 종종 크게 대부분 기술에서 얻은 데이터의 품질을 감소 구조 생물학, 엑스레이 결정학 및 솔루션 핵 자기 공명 (NMR) 등에서 사용. 여기 선물이 매직-각도 회전 고체 NMR 분광학 (SSNMR) 원자 해상도 고분자 어셈블리의 구조를 조사 하는 강력한 방법으로. SSNMR는 원자 크기와 가용성 제한 없이 조립된 복잡 한 내용을 밝힐 수 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 13C의 생산에서 필수적인 단계를 설명 합니다 /15N 동위 원소 표시 된 고분자 단백질 어셈블리 표준 SSNMR 스펙트럼 분석 및 해석의 수집. 예를 들어, 우리는 filamentous 단백질 어셈블리의 SSNMR 구조 분석의 파이프라인을 보여줍니다.

전형적인 SSNMR 워크플로 그림 1에 나와 있는 몇 가지 단계를 포함 합니다. 일반적으로 단백질 소 단위는 시험관에서 분리 식에서에서 생성 대장균, 정화 그리고 조립 떨고 아래 하지만 때로는 또한 정적 조건에서. SDS 젤 착 색 인쇄기 (그림 2A) 식과 단백질 소 단위의 정화를 뒤. 고분자 어셈블리의 대형 다음 전자 현미경 (EM) 분석에 의해 확인 될 수 있다 (filamentous 어셈블리의 예는 그림 2B 참조).
SSNMR 회전자에 단백질 어셈블리의 도입, 후 터는 분석기에 삽입 하 고 매스 주파수 및 온도 규제 스펙트럼 기록 된다. 첫 번째 통찰력 1 D SSNMR 기법에 의해 얻을 수 있습니다. 그림 3 은 전형적인 SSNMR FID 구조적으로 균질 단백질 샘플, 1H-13C CP 스펙트럼,13C 공명 단백질 소 단위에서의 경직 된 코어에 드러내는에 13C 채널에는 조립과 모바일 잔류물을 대표 한 2D 1H-13C 부적 절 한 스펙트럼. 에 대 한 원자 어셈블리 구조의 경직 된 코어, 다차원 SSNMR 실험 필요에 기록 균일 하 게 그리고 선택적으로 표시 된 샘플을 먼저 SSNMR 공명을 할당 한 다음 장거리 근거리 ( 그림 4를 참조 하십시오 감지 ).
모든 스펙트럼 및 처리 SSNMR 공명 할당 하 고 내부-그리고 intermolecular 거리 (그림 5) 추출 적절 한 소프트웨어로 분석. SSNMR 거리 지지대는 혼자 사용 되거나 또는 보완적인 기법에서 데이터와 함께, 있는 모델링 프로그램으로 통합 될 수 있습니다.
고분자 어셈블리 SSNMR 기술로 해결의 대표적인 원자 구조에 대 한 그림 6 세균성 부속 및 녹말 체 소 여러 filamentous 어셈블리를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
그림 6:Filamentous 고분자 구조 고체 NMR 접근 방식에 의해 결정: 세균성 필 라 멘 트와 녹말 체 단백질 소. A) uropathogenic 대장균, PDB 코드 2N7H 4;의 유형 1 pilus B) ASC 필 라 멘 트, PDB 코드 2N1F 63; C) 유형 III 분 비 시스템 바늘, PDB 코드 2MME, 2LPZ 및 2MEX 2,,364; D) 아 밀 로이드-베타 AB42 소, PDB 코드 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,,6667 및 오사카 돌연변이 PDB 코드 2MVX 57, 아이오와 돌연변이 PDB 코드 2MPZ 58; E) 알파 synuclein 소, PDB 코드 2N0A 68; F) 한의 프리온 도메인, PDB 코드 2RNM, 2KJ3, 6970. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 매직각 회전(magic angle spinning) 고체 NMR 분광법을 통해 불용성 및 비결정성 초분자 단백질 복합체의 구조를 원자 해상도로 연구하는 것입니다. 본 영상에서는 고체 NMR을 이용하여 생체 분자 단백질 복합체의 원자 구조를 연구하기 위한 필수적인 방법론적 단계들을 제시하겠습니다. 이러한 복합체들은 본질적으로 불용성이며 비결정성이기 때문에 원자 구조를 연구하는 것이 매우 어렵습니다.고체 상태 NMR은 조립된 객체의 크기나 용해도의 제한 없이 원자 수준의 해상도로 분자 구조와 역학을 연구할 수 있는 신흥 기술입니다. 본 영상에서는 동위원소가 표지된 시료의 준비, 고체 상태 NMR을 이용한 구조 데이터의 수집 및 분석을 포함하여, 고체 상태 NMR로 생체 분자 단백질 조립체의 원자 구조를 시각화하는 핵심 단계를 설명합니다. 고체 상태 NMR 워크플로우의 첫 번째 단계는 C13 N15 표지 단백질 하위 단위를 생성하고 이를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 것입니다.미리 데워둔 LB 배지 15 mL의 사전 배양액에 형질전환된 E.coli 세포 한 개의 콜로니를 접종합니다. 37 °C에서 200 RPM으로 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 본 배양을 위해, 필요한 동위원소 표지 탄소 및 질소원이 포함된 미리 데워둔 N9 배지 1 L에 사전 배양액 전체를 옮깁니다.여기에는 N15 표지 염화암모늄, 균일 C13 표지 글루코스, 선택적 C13 표지 글루코스 또는 선택적 C13 표지 글리세롤이 포함될 수 있습니다. 37 °C에서 배양하고, 배양이 혼탁해지는 즉시 600 nm에서 흡광도를 측정하십시오. OD 값이 0.8에 도달하면, 0.75 mM IPTG로 4시간 동안 단백질 발현을 유도하십시오. 최적의 유도 조건은 단백질마다 다를 수 있음에 유의하십시오.6,000 G, 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 단백질 하위 단위체들을 정제한 후, 인비트로(in vitro)에서 조립합니다. 원심분리 필터 장치를 사용하여 단백질을 약 1 mM 농도로 농축합니다.이를 위해 시료를 필터 유닛에 넣고 4,000 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 단계 사이에는 필터 막에 단백질이 침착되는 것을 방지하기 위해 피펫으로 필터 유닛 내의 용액을 부드럽게 섞어줍니다. 원하는 농도에 도달할 때까지 이 과정을 반복합니다.샘플을 팔콘 튜브로 옮기고 실온에서 일주일 동안 교반하며 배양합니다. 일반적으로 서브유닛이 필라멘트로 중합되면서 용액이 탁해집니다. 세균 오염을 방지하기 위해 0.02% w/v sodium azide를 첨가합니다.단백질 어셈블리를 수확하려면 샘플을 20,000 G, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리하십시오. 샘플이 건조되는 것을 방지하기 위해 표면을 덮을 정도의 액체만 남기고 상층액의 대부분을 흡입하여 제거한 후, 측정 전까지 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 이제 고체 NMR을 이용한 구조 분석에 필수적인 실험들을 제시하겠습니다.C13 핵에서 검출되는 1차원 교차 편극(cross polarization, CP) 및 INEPT 실험은 각각 어셈블리 내의 강직한 단백질 세그먼트와 유연한 단백질 세그먼트를 검출하는 데 사용됩니다. 또한, 이를 통해 구조적 균질성과 국소적 다형성의 정도를 추정합니다. 본 실험에서는 표준 실험값을 사용합니다.일반적인 파라미터 범위는 프로토콜에 표시되어 있습니다. 로터를 NMR 자석에 삽입하고 프로토콜에 설명된 대로 매직각 회전(magic angle spinning)을 시작하십시오. 원하는 회전 주파수를 설정하고, 오차 범위 ±10 hertz 이내로 안정화되었는지 확인하십시오.16회의 스캔을 사용하여 단일 펄스 1차원 양성자 스펙트럼을 기록하십시오. 1D 양성자 탄소 CP를 설정하십시오. CP 실험은 단단한 구조의 잔기에서 발생하는 신호를 보여줍니다. 초기 실험 파라미터는 표준 화합물에 대한 표준 최적화 절차를 통해 설정합니다.감도가 충분히 높을 때 샘플 내에서 펄스 보정과 디커플링 파라미터를 최적화할 수 있습니다. 여기서는 16회 스캔으로 CP를 기록합니다. CP 접촉 시간의 최적화 과정에서 보여지는 것과 같이, 최대 신호 강도를 기준으로 CP 접촉 시간과 전력 레벨을 선택합니다.이 예시에서 최대 강도는 800 milliseconds에서 도달합니다. 디커플링 파라미터 또한 표준 화합물 보정 시 원래 설정했던 값에서 다시 조정해야 합니다. 마지막으로, 신호와의 중첩을 피하기 위해 여기서는 18 kilohertz로 표시된 주어진 매직 각 회전 주파수에서의 스피닝 사이드 밴드 위치를 주의 깊게 관찰하십시오.1차원 스펙트럼 지문 역할을 하는 참조 1D proton carbon CP 스펙트럼을 기록합니다. 여기서는 800 millisecond CP 접촉 시간, 100 kilohertz 디커플링 강도, 3초의 리사이클 지연 시간 및 20 millisecond의 획득 시간으로 128회 스캔을 누적합니다. apathi-zation 없이 CP 실험을 처리합니다.시료 내의 C39를 추정하여 구조적 질서와 균질성을 나타내는 분리된 피크를 선택하십시오. 여기서 반치폭으로 측정된 선폭은 약 60~70 Hz이며, 이는 어셈블리 내의 단백질 구조가 잘 정렬되어 있음을 나타냅니다. 단백질 어셈블리의 가동성이 높은 부분을 조사하기 위해 1차원 proton-carbon INEPT 실험을 설정하십시오.모바일 단백질 세그먼트의 핑거프린트로 사용할 참조 inept 실험을 기록하십시오. 일반적인 파라미터는 128회 스캔 및 25 milliseconds의 획득 시간입니다. 양성자 탄소 inept 실험을 처리하십시오.신호의 수와 그 위치는 각각 잔기의 유동성 범위와 아미노산 조성을 나타냅니다. 여기서는 전체 단백질이 조립 구조 내에서 강직한 영역에 있으므로, twist buffer CH2 merit-y의 신호만 관찰됩니다. 단백질 구조의 형태 분석은 조립체의 모든 강직한 잔기에 대한 고체 NMR 공명 할당을 기반으로 합니다.화학적 이동(chemical shifts)은 국소 화학 환경에 매우 민감한 프로브이므로, 이를 통해 단백질의 2차 구조를 예측할 수 있습니다. 전체 3D 구조 결정은 9 Å까지의 분자 내 및 분자 간 원자 근접성을 암호화하는 거리 구속(distance restraints)과 같은 구조 데이터의 수집을 바탕으로 이루어집니다. 여기서는 기본적인 2차원 실험의 기록 방법과 순차적 할당(sequential assignment)의 예를 보여드리겠습니다.그런 다음, 선택적으로 C13 표지된 시료에서 기록된 실험으로부터 거리 구속 조건을 수집하는 방법에 대해 간단히 시연하겠습니다. 잔기 내 탄소-탄소 상관관계를 검출하기 위해 짧은 혼합 시간을 갖는 2차원 탄소-탄소 PDSD 실험을 설정하십시오. 1차원 CP 실험의 초기 양성자-탄소 교차 편극 단계 값을 복사하십시오.균일하게 C13 표지된 시료의 경우 혼합 시간은 50 milliseconds로 설정할 수 있습니다. 여기서는 간접 차원과 직접 차원의 획득 시간을 각각 15 milliseconds 및 20 milliseconds로 선택하였습니다. PDSD 스펙트럼을 처리하기 위해, sine-bell shift가 3.5인 QSINE 윈도우 함수를 사용합니다.잔기별 할당을 가능하게 하려면, 짧은 혼합 시간을 사용한 PDSD 설정을 이용하여 100에서 200밀리초의 혼합 시간을 갖는 중간 혼합 시간 PDSD를 기록하십시오. 완전한 공명 할당을 위해서는 질소 검출 실험을 포함한 추가 스펙트럼이 흔히 필요하며, 이에 대한 자세한 내용은 프로토콜에 기술되어 있습니다. CCPNMR Analysis와 같은 NMR 분석 프로그램을 선택하십시오.2D 스펙트라를 소프트웨어로 불러오고, 일차 단백질 서열을 이용하여 분자 객체를 생성합니다. 짧은 혼합 시간의 PDSD 스펙트럼에서 관찰되는 아미노산 종류의 식별부터 시작하십시오. 스핀 시스템의 탄소 원자들을 연결하면 잔기 유형별 지정이 가능합니다.여기서는 threonine 잔기의 스핀 시스템을 할당합니다. C-alpha, C-beta 및 C-gamma 핵 사이의 편극 전이는 PDSD 스펙트럼에서 물리적 교차 피크를 생성합니다. 이 절차를 통해 가능한 많은 잔기를 식별해 보십시오.짧은 혼합 시간과 중간 혼합 시간의 PDSD 스펙트럼을 겹쳐서 표시합니다. 중간 혼합 시간 PDSD에서 관찰되는 보조 피크는 일반적으로 연속된 잔기 간의 접촉으로 인해 발생합니다. 하나의 스핀 시스템의 공명 피크를 표시하고, 중간 혼합 시간 PDSD에서 다른 스핀 시스템의 공명 주파수와의 상관관계를 찾습니다.우리는 필라멘트형 단백질 조립체에서 thenium 33에서 isolutane 32로 이어지는 순차적 할당을 보여줍니다. thenium 스핀 시스템의 공명 주파수는 32의 isolutes 탄소 주파수에서 관찰되며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 질소 검출 스펙트럼을 이용한 할당 절차와 할당 결과로부터 단백질 2차 구조를 얻는 방법은 프로토콜에 설명되어 있습니다.철저한 공명 할당 후에, 장거리 구속 조건의 식별을 진행할 수 있습니다. 장거리 구속 조건은 서로 떨어진 잔기 사이의 분자 내 또는 분자 간 탄소-탄소 근접성을 의미하며, 이는 단량체 하위 단위의 3차 구조와 어셈블리 내 하위 단위의 배열을 모두 정의합니다. 여기서는 선택적으로 C13 표지된 시료가 특히 중요합니다.선택적으로 C13 표지된 시료를 사용하여 400 milliseconds에서 1 second 사이의 혼합 시간으로 기록한 긴 혼합 시간 탄소-탄소 PDSD와 중간 혼합 시간 PDSD를 겹쳐서 표시합니다. 가능하다면, 두 PDSD 모두 동일한 선택적 표지 시료에서 기록되어야 합니다. 부수적인 피크들은 더 멀리 떨어진 C13 원자들 사이의 상관관계로 인해 발생합니다.공명 할당 과정에서 선택적 표지법을 고려하십시오. 이 경우에는 1-3-글리세롤입니다. 여기서는 양쪽 차원 모두에서 명확하게 할당된 장거리 접촉 피크의 예를 강조 표시하였습니다.Thenium 33 C-beta와 protein 45 C-alpha입니다. 장거리 거리 식별을 완료한 후, 구속 조건은 모호하지 않음 또는 모호함, 그리고 분자 내 또는 분자 간 구속 조건으로 분류됩니다. 구조 모델링을 위해 준비해야 할 구속 조건 목록은 프로토콜에 기재되어 있습니다.다양한 프로그램을 이용한 구조 모델링 튜토리얼은 온라인에서 확인할 수 있습니다. 고체 NMR 데이터는 단독으로 또는 상호 보완적인 데이터와 결합하여 초분자 집합체의 원자 수준 구조 결정을 가능하게 합니다. 고체 NMR의 장점은 한편으로 2차 구조 정보와 분자 내 인터페이스로부터의 원자 간 거리 제한 조건을 모두 제공할 수 있다는 점이며, 이는 모델링 과정에 통합될 수 있습니다.하지만 다른 한편으로, 고체 NMR 분광법의 독특한 특징은 온전한 초분자 조립체의 분자 간 계면에서 원자 거리 제한 조건을 수집할 수 있는 능력에 있습니다. 그러나 분자 내 및 분자 간 제한 조건 할당을 검출하고 구별하는 것은 지루한 과정이 될 수 있으며, 일반적으로 선택적으로 C13 표지된 시료의 준비가 필요합니다. 하지만 선택적 표지 전략, 분광계 하드웨어 설계 및 고체 NMR 방법론의 새로운 발전으로 인해, 이 기술은 객체의 크기, 장거리 질서 또는 결정성의 제한 없이 원자 수준의 분자 정보를 제공한다는 이론적 잠재력을 점점 더 실현하고 있습니다.이 방법은 생체분자 복합체의 원자 구조를 연구할 수 있게 해줍니다. 고해상도 데이터를 얻기 위해서는 NMR 조건을 최적화할 수 있도록 시료를 세심하게 준비하는 것이 매우 중요합니다. 본 프로토콜을 통해 단백질 복합체에 대한 정보인 원자 수준의 해상도를 얻을 수 있습니다.또한, 이 기술은 구조 생물학의 다른 기술들과 결합하여 3차원 모델을 얻는 데 활용될 수 있습니다.

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이 비디오는 15개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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여기, 우리 현재 금속 유리 구조 변환의 전 situ와 현장에서 조사를 설명 하는 프로토콜. 우리 hyperfine 상호 작용을 검사 하는 핵 기반 분석 방법 채택. 우리 Mössbauer 분 광 분석의 적용 및 온도 제어 실험 동안 싱크 로트 론 방사선의 핵 전달 분산을 보여 줍니다.

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여기, 우리는 어떻게 작은 각 엑스레이 뿌리기 (SAXS) 고분자 구조를 나타내는 저해상도 봉투에 대 한 정보를 활용할 수 있습니다 제시. 고해상도 구조 기술 엑스레이 결정학, 핵 자기 공명 등와 함께에서 사용 될 때 SAXS 다중 도메인 단백질 및 고분자 복합물 솔루션에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

작은 각 엑스레이 뿌리기를 사용 하 여 솔루션에서 고분자의 구조 연구

다차원 고체 NMR 분광학 및 동적인 핵 분극 (DNP) 조사 13C,15N 표시 된 곰 팡이 및 식물 견본을 준비 하기 위한 프로토콜 제공 됩니다.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

고체, 액체, 가스 및 혼합물의 분자 구조와 역학은 다양한 과학적 분야에 매우 중요합니다. Situ MAS NMR의 고온, 고압은 엄격하게 통제된 화학 환경에서 혼합 상 시스템에서 성분의 화학 적 환경을 감지할 수 있게 합니다.

고온 및 고압 시상 매직 앵글 회전 핵 자기 공명 분광기

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

핵 자기 공명(NMR) 분광법은 잔류물 특이적 방식으로 구조적 단백질 역학을 특성화할 수 있습니다. 당사는 피코초에서 나노초의 시간 척도에 민감한 NMR 15NR1 및 R2 이완 및 {1H}-15N 이종 핵 오버하우저 효과(hetNOE) 실험을 기록하기 위한 실습 프로토콜을 제공합니다.

단백질의 피코초에서 나노초까지의 구조 역학 조사를 위한 NMR 15N 이완 실험

여기에서는 Tau 단백질을 사례 연구로 사용하여 핵 자기 공명 분광법(NMR)으로 본질적으로 무질서한 단백질의 다중 인산화를 식별하는 방법을 설명합니다. 재조합 Tau는 데이터 수집 및 분석 전에 kinase에 의해 동위원소로 농축되고 in vitro에 변형됩니다.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

배우세요 고체 핵 자기 공명 분광학을 활용하여 불용성 단백질 어셈블리의 원자 규모 구조를 분석하는 방법을. 이 기술은 결정화 없이도 고분자 복합체의 상세한 구조 정보를 제공합니다.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

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