고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

이 프로토콜의 전반적인 목표는 마법의 각도 회전 고체 상태 NMR 분광법에 의해 원자 분해능에서 불용성 및 비결정성 초분자 단백질 어셈블리의 구조를 연구하는 것입니다. 우리는 고체 상태 NMR에 의한 생체 분자 단백질 어셈블리의 원자 구조를 연구하기 위한 필수적인 방법론적 단계를 제시할 것입니다. 이러한 어셈블리의 원자 구조를 연구하는 것은 본질적으로 불용성이고 결정질이 아니기 때문에 매우 어렵습니다.

고체 상태 NMR은 조립된 물체의 크기나 용해도에 의해 제한되지 않고 원자 분해능에서 분자 구조와 역학을 연구할 수 있는 새로운 기술입니다. 여기에서는 동위원소 표지된 샘플의 준비, 고체 상태 NMR의 구조 데이터 수집 및 분석을 포함하여 판매된 상태 NMR에 의한 생체 분자 단백질 어셈블리의 원자 구조를 시각화하는 주요 단계를 설명합니다. 고체 상태 NMR 워크플로우의 첫 번째 단계는 C13, N15 표지 단백질 소단위 및 이들의 시험관 내 조립을 생산하는 것입니다.

예열된 LB 배지의 15mil 사전 배양에 형질전환된 E.coli 세포 1개 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 밤새 흔들어 배양합니다. 주요 배양액을 접종하려면 전체 사전 배양을 필요한 동위원소 표지된 탄소 및 질소 공급원을 포함하는 1리터의 사전 예열 N9 배지로 옮깁니다.

여기에는 N15 표지 염화암모늄, 균일하게 C13 표지 포도당, 선택적으로 C13 표지 포도당, 선택적으로 C13 표지 글리세롤 37도에서 배양하고 배양이 탁해지자마자 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정할 수 있습니다. OD가 0.8 값에 도달하면 4시간 동안 0.75 미니 어금니 IPTG로 단백질 발현을 유도합니다. 최적의 유도 조건은 단백질마다 다를 수 있습니다.

6, 000 G 및 4개의 도에 30 분 동안 분리기분리에 의하여 세포를 재기하십시오. 단백질 소단위체를 정제한 후 시험관내에서 조립합니다. 원심 필터 장치에서 약 1개의 미니 어금니까지 단백질을 농축합니다.

이렇게 하려면 샘플을 필터 장치에 넣고 4, 000G에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 단계 사이에 필터 장치의 용액을 피펫과 부드럽게 혼합하여 필터 멤브레인에 단백질이 침착되지 않도록 합니다. 원하는 농도에 도달할 때까지 절차를 반복합니다.

샘플을 매 튜브로 옮기고 실온에서 일주일 동안 교반하여 배양합니다. 일반적으로 소단위가 필라멘트로 중합되는 것은 용액이 탁해지는 것을 동반합니다. 세균성 오염을 피하기 위하여 양 나트륨 아지드 당 0.02%weight를 추가하십시오.

단백질 집합을 가을걷기 위하여는, 20, 000 G 및 4개의 도에 1 시간 동안 표본을 분리기. 시료 건조를 피하기 위해 표면을 덮을 만큼의 액체만 남기고 상등액의 대부분을 흡인하고 측정할 때까지 시료를 4도에서 보관합니다. 고체 상태 NMR에 의한 구조 분석을 위한 필수 실험을 제시합니다.

C13 핵에서 검출된 1차원 교차 분극(CP) 및 부적절한 실험은 각각 어셈블리에서 강성 및 유연한 단백질 세그먼트를 검출하는 데 사용됩니다. 그리고 구조적 균질성과 국소 다형성의 정도를 추정합니다. 여기서는 표준 실험 값을 사용합니다.

일반적인 매개 변수 범위는 프로토콜에 표시되어 있습니다. 로타를 NMR 자석에 삽입하고 프로토콜에 설명된 대로 매직 앵글 회전을 시작합니다. 원하는 회전 주파수를 설정하고 안정화를 플러스 또는 마이너스 10헤르츠 이내로 확인하십시오.

16개의 스캔을 사용하여 단일 펄스, 1차원 양성자 스펙트럼을 기록합니다. 1D 양성자 탄소 CP를 설정합니다. CP 실험은 단단한 형태의 잔류물에서 발생하는 신호를 보여줍니다. 초기 실험 파라미터는 참조 화합물에 대한 표준 최적화 절차에서 취해집니다.

펄스 교정 및 디커플링 파라미터는 감도가 충분히 높을 때 샘플에서 최적화할 수 있습니다. 여기에서는 16개의 스캔으로 CP를 기록합니다. CP 접촉 시간 및 전력 레벨은 CP 접촉 시간의 최적화를 위해 여기에서 입증된 바와 같이 최대 신호 강도를 기준으로 선택됩니다.

이 예제의 최대 강도는 800밀리초에 도달합니다. 디커플링 파라미터는 또한 reference compound calibration에서 원래 설정된 파라미터에서 재조정되어야 합니다. 마지막으로, 신호와의 중복을 피하기 위해 여기에 표시된 18kHz에서 주어진 마법각 회전 주파수에서 회전하는 측대역의 위치를 주의 깊게 관찰합니다.

1차원 스펙트럼 지문 역할을 하는 참조 1D 양성자 탄소 CP 스펙트럼을 기록합니다. 여기에서 800밀리초의 CP 접촉 시간, 100킬로헤르츠의 디커플링 강도, 3초의 재활용 지연, 20밀리초의 획득 시간으로 128개의 스캔을 누적합니다. 무관심하지 않고 CP 실험을 처리합니다.

표본 내의 C39를 추정하기 위해 분리된 피크를 선택하여 구조적 순서와 균질성을 나타냅니다. 여기서, 절반 높이에서 전체 너비로 측정된 선폭은 약 60-70헤르츠이며, 이는 어셈블리에서 잘 정렬된 단백질 구조를 나타냅니다. 단백질 어셈블리의 이동성이 높은 부분을 조사하기 위해 1차원 양성자 탄소 부적합 실험을 설정합니다.

이동성 단백질 세그먼트에 대한 지문 역할을 하기 위해 참조 부적절한 실험을 기록합니다. 일반적인 매개변수는 128회 스캔이며 획득 시간은 25밀리초입니다. 양성자 탄소 부적합한 실험을 처리합니다.

신호의 수와 그 위치는 각각 잔류 이동도와 아미노산 조성의 정도를 나타냅니다. 여기서, 꼬임 완충액 CH2 merit-y의 신호만 관찰되는데, 이는 전체 단백질이 조립 구조에서 단단한 영역에 있기 때문입니다. 단백질 구조의 구조적 분석은 어셈블리의 모든 단단한 잔류물에 대한 고체 상태 NMR 공명 할당을 기반으로 합니다.

이는 화학적 이동이 국부적 화학 환경에 대한 매우 민감한 프로브이며 단백질의 2차 구조를 예측하는 데 사용할 수 있기 때문에 가능합니다. 그런 다음 완전한 3D 구조 결정은 최대 9옹스트롬까지 분자 내 및 분자 간 원자 근접성을 모두 인코딩하는 거리 구속과 같은 구조 데이터 수집을 기반으로 합니다. 여기에서는 기본적인 2차원 실험이 기록되는 방법을 보여주고 순차적 할당의 예를 제공합니다.

그런 다음 선택적으로 C13 라벨링된 샘플에 기록된 실험에서 거리 제한을 수집하는 방법에 대한 간단한 시연을 제공합니다. 잔류물 내 탄소 탄소 상관관계를 감지하기 위해 짧은 혼합 시간 2차원 탄소 PDSD 실험을 설정합니다. 1차원 CP 실험에서 초기 양성자 탄소 교차 편광 단계의 값을 복사합니다.

균일하게 C13 라벨링된 샘플에 대해 혼합을 50밀리초로 설정할 수 있습니다. 여기서는 간접 및 직접 차원에서 각각 15밀리초 및 20밀리초의 획득 시간을 선택했습니다. PDSD 스펙트럼을 처리하기 위해 사인-벨 시프트가 3.5인 QSINE 윈도우 함수를 사용합니다.

잔류물 특정 할당을 활성화하려면 짧은 혼합 시간 PDSD 설정을 사용하여 100 - 200밀리초의 혼합 시간으로 중간 혼합 시간 PDSD를 기록합니다. 질소 검출 실험을 포함한 추가 스펙트럼은 완전한 공명 할당을 위해 필요한 경우가 많으며 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. CCPNMR 분석과 같은 NMR 분석 프로그램을 선택합니다.

2D 스펙트럼을 소프트웨어에 로드하고 1차 단백질 염기서열을 가진 분자 개체를 생성합니다. 짧은 혼합 시간 PDSD 스펙트럼에서 볼 수 있는 아미노산 유형을 식별하는 것부터 시작합니다. 스핀 시스템의 탄소 원자를 연결하면 잔류 물 유형별 할당이 가능합니다.

여기서, 우리는 테늄 잔류물의 스핀 시스템을 할당합니다. C-알파, C-베타 및 C-감마 핵 사이의 편광 전달은 PDSD 스펙트럼에서 물리적 교차 피크로 이어집니다. 이 절차를 통해 가능한 한 많은 잔류물을 식별하십시오.

단기 및 중간 혼합 시간 PDSD 스펙트럼을 모두 오버레이합니다. 중간 혼합 시간 PDSD에서 볼 수 있는 보조 피크는 일반적으로 순차적 잔류 물 간의 접촉에서 발생합니다. 스핀 시스템의 공진 피크를 표시하고 중간 혼합 시간 PDSD에서 다른 스핀 시스템의 공진 주파수와 상관 관계를 찾습니다.

우리는 필라멘트 단백질 어셈블리에서 테늄 33과 이솔루탄 32로의 순차적 할당을 보여줍니다. 테늄 스핀 시스템의 공명 주파수는 32에서 아이솔류의 탄소 주파수에서 볼 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 질소 검출 스펙트럼을 사용한 할당 및 할당에서 단백질 2차 구조를 얻기 위한 절차는 프로토콜에 설명되어 있습니다.

철저한 공명 할당에 따라 장거리 구속 장치의 식별을 진행할 수 있습니다. 장거리 제약(Long range restraints)은 멀리 떨어진 잔류물 사이의 분자 내 또는 분자 간 탄소 탄소 근접성으로, 단량체 소단위체의 3차 접힘과 어셈블리 내 소단위체의 배열을 모두 정의합니다. 여기서, 선택적으로 C13 표지된 샘플이 특히 중요합니다.

중간 혼합 시간 PDSD를 선택적으로 C13 라벨링된 샘플에 400밀리초에서 1초 사이의 혼합 시간으로 기록된 긴 혼합 시간 탄소 탄소 PDSD와 오버레이합니다. 가능한 경우, 두 PDSD를 동일하게 선택적으로 라벨링된 샘플에 기록해야 합니다. 보충 피크는 더 먼 C13 원자 사이의 상관 관계에서 발생합니다.

공명 할당 중에는 선택적 라벨링 체계를 고려하십시오. 이 경우, 1-3-글리세롤입니다. 여기에서 우리는 장거리 접촉 피크와 두 차원에 대한 명확한 할당을 강조하고 예를 들었습니다.

테늄 33 C-베타와 단백질 45 C-알파. 장거리 식별을 완료한 후, 구속은 모호하지 않거나 모호한 것으로 분류되며, 분자 내 또는 분자 간으로도 분류됩니다. 구조 모델링을 위해 준비해야 할 제한 목록은 프로토콜에 나열되어 있습니다.

다양한 프로그램을 사용한 구조 모델링에 대한 자습서는 온라인에서 찾을 수 있습니다. 고체 상태 NMR 데이터는 단독으로 또는 상보적인 데이터와 함께 초분자 어셈블리의 원자 수준 구조 측정을 허용할 수 있습니다. 고체 상태 NMR의 장점은 한편으로는 모델링 프로세스에 통합될 수 있는 분자 내 계면에서 2차 구조 정보와 원자 거리 제한을 모두 제공할 수 있다는 것입니다.

그러나 다른 한편으로, 고체 상태 NMR 분광법의 독특한 특징은 온전한 초분자 어셈블리의 분자간 계면에서 원자 거리 제한을 수집하는 능력에 있습니다. 그러나 intra molecular restraint assignment와 inter molecular restraint assignment 간의 검출 및 구분은 지루한 과정일 수 있으며 일반적으로 선택적으로 C13 라벨링된 샘플을 준비해야 합니다. 그러나 선택적 라벨링 전략, 분광계 하드웨어 설계 및 고체 상태 NMR 방법론의 새로운 개발로 이 기술은 물체 크기, 장거리 순서 또는 결정도의 제한 없이 원자 수준의 분자 정보를 제공하는 이론적 잠재력을 점점 더 실현하고 있습니다.

이 방법을 사용하면 생체 분자 어셈블리의 원자 구조를 연구할 수 있습니다. 고해상도 데이터를 얻기 위해 NMR 상태를 최적화하기 위해 샘플을 신중하게 준비하는 것이 매우 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하면 단백질 어셈블리의 정보인 원자 분해능을 얻을 수 있습니다.

그리고 이 기술은 구조 생물학의 다른 기술과 결합하여 3차원 모델을 얻을 수 있습니다.