의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

다음 실험의 전반적인 목표는 엄격하게 제어되고 생리학적으로 관련된 전단 흐름 하에서 처리량이 증가된 세포 롤링 연구를 수행하는 것입니다. 이것은 특수 플레이트의 인접한 우물이 미세유체 채널을 통해 연결되는 다중 웰 미세유체 시스템을 사용하여 달성됩니다. 시스템의 인터페이스는 전기 공압 펌프를 멀티 웰 플레이트의 상단에 연결하고 정의된 유속으로 유정 내부에서 미세유체 채널을 통해 유체를 구동하는 공압 압력을 가합니다.

일단 microfluidic 수로가 원한 기질 또는 세포 단청 monolayer로 입히면, 관심사의 세포는 microfluidic 수로 입히는 표면과의 그들의 특정한 회전 상호 작용을 탐구하기 위하여 소개되고, 다른 실험 조건 하에서 기질 또는 단층 입히는 표면과 상호 작용할 때 세포의 회전 재산은 그 때 적합한 소프트웨어로 분석될 수 있습니다. 병렬 플레이트 플로우 챔버와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 시약 및 세포 소비를 최소화하면서 정밀하게 제어되고 생리학적으로 관련된 튜브 흐름에서 훨씬 더 높은 처리량으로 실버 압연 특성을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼은 세포 롤링 및 원점 복귀에 영향을 미치도록 설계된 엔지니어링 접근 방식을 빠르고 정확하게 분석할 수 있도록 하여 외인성 세포 기반 치료법을 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.

단백질 기질로 미세유체 채널을 코팅하려면 먼저 새로 준비된 단백질 용액 25-50마이크로리터를 주입구에 추가합니다. 그런 다음 5분 동안 평방 센티미터당 2다인의 순전한 힘을 가하여 용액을 채널로 관류시킵니다. 액체 비드가 배출구에서 보이면 흐름을 잘 멈추고 관심 단백질로 적절한 시간 동안 플레이트를 배양한 다음 각각에서 용액을 흡인합니다. 잘.

다음으로, 200에서 500 마이크로 리터의 PBS를 출구 우물에 첨가 한 다음 5 분 동안 평방 센티미터당 2 딘의 깎아 지른 듯한 흐름을 적용하여 채널을 세척하여 미세 유체 채널 내부에 세포 단층을 만듭니다. 먼저 배양 접시에서 관심 세포를 3분 동안 부드럽게 트립신하여 진행하고, 2배 용량의 가득 찬 배지로 반응을 중지한 다음 400Gs 및 rt에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, 펠릿을 10ml의 전체 매체로 세척합니다.

그런 다음 1 밀리리터의 신선한 전체 배지에 세포를 재현탁시키고 계수하고 세포 용액을 적절한 농도로 조정 한 다음 각 입구에 25-50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 플레이트합니다. 이제 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 세포가 전체 채널을 채우는 것이 관찰될 때까지 평방 센티미터당 2딘의 순전한 흐름을 적용하여 세포를 채널로 흐르게 합니다. 흐름을 멈춘 후 배출구와 내륙 우물 모두에 200마이크로리터의 적절한 세포 매체를 채운 다음 세포가 5%CO2에서 섭씨 37도에서 침전되고 부착되도록 합니다.

3시간 후 전체 매체로 채널을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 이제 세포가 완전히 융합되어 채널에서 내피 세포의 염증 활성화를 유도하는 데 사용할 준비가 되어야 합니다. 갓 준비한 TNF 알파 용액 100마이크로리터를 주입구 웰에 추가한 다음 5분 동안 제곱센티미터당 2딘의 순류를 적용하여 용액을 채널에 주입합니다.

비활성화 내피 세포 채널을 제어하려면 100마이크로리터의 내피 세포 기저 배지를 주입구에 추가합니다. 내피 세포 표면에서 P 또는 E 셀렉틴을 차단하려면 적절한 중화 항체를 밀리리터당 5마이크로그램으로 채널에 도입하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 롤링 분석을 시작하기 전에 기초 배지로 채널을 세척합니다.

현미경으로 채널을 주의 깊게 검사하여 채널이 제대로 코팅되었는지 확인합니다. 그런 다음 두 번째 세척 횟수 후에 HL 60 세포 현탁액을 기저 배지로 2회 세척한 다음 IMDM에서 10의 5배에서 밀리리터당 6번째 세포 농도로 세포를 재현탁합니다. 25-50 마이크로 리터의 셀 현탁액을 배출구에 첨가 한 후 플레이트를 섭씨 37도 온도 제어 플레이트 홀더에 잘 넣고 플레이트 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.

세포를 미세유체 채널로 도입합니다. 배출구에서 흡입구로 흐르는 10-15초 이내에 관찰해야 합니다. 여기서, 형광 표지된 HL 60 세포를 관찰할 수 있고, P 선택 인코딩 표면과 상호 작용하며, 전단 응력의 함수로서 롤링 응답을 검사하기 위해 롤링 응답을 표시하고, 전단을 제곱센티미터당 0.25 딘으로 감소시키고, 원하는 각 전단에서 스트림 획득 기능을 사용하여 20 내지 32번째 비디오를 획득하고, 그리고 점차적으로 전단을 0.25에서 평방 센티미터당 5 딘까지 증가시킵니다.

마지막으로, CCD 카메라를 사용하여 초당 11프레임의 스트림 획득으로 분석의 비디오를 획득합니다. 예를 들어, 여기에서는 초프 셀의 단층에서 롤링되는 HL 60 셀이 표시됩니다. 적절한 호환 소프트웨어를 사용하여 압연 경로와 속도를 분석합니다.

HL 60 cell은 롤링 리간드, P select 및 glycoprotein ligand one 및 CI Lewis를 포함한 다양한 homing ligand를 발현하기 때문에 골드 스탠다드 롤러로 간주되며, CI Lewis는 멀티 웰 플레이트 미세유체 시스템의 기능을 테스트 X.To, 수많은 미세유체 채널이 서로 다른 기질과 HL 60 셀의 롤링 상호 작용으로 동시에 코팅되었습니다. 이러한 기질을 분석한 결과, 세포는 P select 인코딩 표면에서 강력한 롤링 거동을 보였으며 세포는 먼저 흐름에서 캡처된 후 뚜렷한 롤링 움직임을 보였습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 문헌과 일치하는 HL 60 셀은 e 및 p selectin 표면에서 유사한 롤링 거동을 나타내지만 FiberInc 코팅 기판에서는 그렇지 않습니다.

호환 가능한 소프트웨어를 통해 분석된 세포 속도는 초당 1에서 12미크론 사이의 평균 속도로 p 및 e 셀렉틴에서 세포의 강력한 롤링 반응을 보여주는 순전한 응력에 대해 표시되었습니다. 관심 세포와 표면을 코팅하는 세포 단층 CHO P 세포 간의 상호 작용을 효율적으로 테스트하기 위한 이 미세유체 시스템의 타당성을 평가하기 위해 P를 안정적으로 발현하지만 e selectin은 아닌 것을 본 그림과 같이 사용하였다. HL 60 세포는 HL 60의 롤링 운동이 실제로 펙틴에 의해 매개되는지 여부를 테스트하기 위해 CHO P 세포 단층에서 상당한 롤링 반응을 나타냅니다.

단층은 HL 60 세포가 채널로 풍부하기 전에 P 또는 E 셀렉틴에 대한 차단 항체와 함께 사전 배양되었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, P selectin 항체로 CHO p 단층을 차단하면 표면에서 롤링되는 HL 60 세포의 수가 크게 감소하여 P select가 실제로 HL 60 롤링을 매개함을 입증했습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 다중 웰 미세유체 플레이트는 수많은 개별 미세유체 채널로 구성되어 여러 다른 조건에서 더 높은 처리량 테스트를 수행할 수 있습니다.

이 유리한 설계는 염증 조건을 시뮬레이션하기 위해 다양한 실험 조건에서 HL 60 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 신속하게 분석하기 위해 미세유체 채널 내부의 내피 세포를 플레이트하는 데 사용되었으며, 내피 세포는 전염증성 사이토카인 TNF 알파로 전처리되어 E의 상향 조절을 초래했지만 내피 세포 표면에서 P 셀렉틴은 그렇지 않았습니다. 흥미롭게도, HL 60 세포는 비활성화된 내피 세포와 상호 작용하지 않았으며, 세포가 이 표면에서 굴러가는 것이 관찰되지 않았습니다. 반대로, HL 60 세포는 HL 60 세포와 활성화된 내피 세포 사이의 롤링 상호 작용에서 p 또는 E 셀렉틴의 관여를 조사하기 위해 초당 평균 5 내지 15미크론의 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 강력한 롤링 거동을 보였습니다.

TNF 알파 활성화 내피 세포를 차단 항체에서 P 또는 E 선택으로 사전 배양하고, TNF 알파 내피 세포에서 선택한 차단 그래프에 나타난 바와 같이 HL 60 세포의 롤링을 분석한 결과, 활성화된 내피 단층에서 롤링 세포의 수가 현저히 감소하였다. 대조적으로, 활성화된 내피 세포에서 발현되지 않는 펙틴에 대한 동위원소 대조군 또는 항체를 사용하는 것은 활성화된 내피층에서 HL 60 롤링에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 데이터는 이전 보고서와 일치하는 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 HL 60 롤링에 S 셀렉틴이 직접 관여하는 것을 보여줍니다.

분석 소프트웨어를 사용하면 표면과 상호 작용할 때 개별 세포의 경로를 추적할 수 있습니다. 따라서, e select 및 항체 차단이 있거나 없는 TNF 알파 활성화 내피 세포와 상호 작용할 때 개별 세포의 경로를 구체적으로 추적했습니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 차단되지 않은 활성화된 내피 세포의 롤링 세포 수는 선택 및 차단된 활성 내피 세포보다 훨씬 높았습니다. 또한, 차단되지 않은 내피 세포에서 HL 60 세포의 롤링 이동은 지속적이고 견고한 반면, 선택 세포와 차단된 내피 세포에서 세포의 롤링 경로는 단편화된 것으로 나타났습니다.

이 결과와 일치하게, 차단되지 않은 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 HL 60 세포의 롤링 속도는 e 선택 및 차단된 내피 세포의 롤링 속도보다 현저히 낮았습니다. 이 학문은 다수 microfluidic 체계의 단단히 통제된 관 교류의 밑에 시간 당 10까지 회전 가스의 증가된 처리량으로 능률적으로 세포 회전 실험을 실행하기 위하여 사용을 설명합니다. 전반적으로, 이 미세유체 시스템은 세포 호잉의 핵심 측면인 세포 압연을 연구하기 위한 강력한 기술로 등장합니다.

예를 들어, 저희 연구실에서는 현재 이 시스템을 사용하여 중간엽 줄기세포의 치료 효과를 개선하기 위한 전략으로 중간엽 줄기세포의 원점 복귀를 강화하기 위한 조건을 스크리닝하고 있습니다.