Name: 의 체계적인 분석 체외 셀 롤링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 배우세요 다중 웰 마이크로플루이딕 시스템을 활용한 세포 롤링 연구 방법입니다. 생리학적 전단 흐름 조건에서 세포 상호작용을 고효율 분석하여 세포 기반 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

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CHO-P 세포 박사 바바라 Furie (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의과 대학)에서 일종의 선물이었다. 이 작품은 JMK에이 작품은 또한 JMK에 Movember - 전립선 암 재단 챌린지 상에 의해 부분적으로 지원되었다 건강 보조금 HL095722의 국립 연구소에 의해 지원되었다

1. 세포 배양 <ol><li> 인간 골수성 백혈병 (HL-60) 세포 <ol><li> 75cm 문화 HL-60 세포를 20 % (V / V) 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (V / V) L-글루타민 및 1 보충 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 (IMDM), 15 ㎖ 2 플라스크 % (V / V) 페니실린 - 스트렙토 마이신을. </li><li> 세포 현탁액의 볼륨의 절반을 흡입하고 완전한 IMDM 미디어로 교체하여 3 일마다 미디어를 변경합니다. </li><li> 카르복시 디 아세테이트를 들어, 숙신 에스테르 (CFSE) 염색, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 1 μM의 CFSE 용액에 resuspend (데워진 PBS에서 준비) 및 37 ℃에서 15 분 동안 품어 그런 다음 30 분 동안 신선한 데워진 배지에서 원심 분리기 세포, 기음 뜨는에 resuspend 세포. PBS로 세포를 세척 한 후 (P-SEL 코팅 표면에 CFSE 염색 HL-60 세포의 대표 이미지 그림 1B 참조) 롤링 실험을 위해 사용합니다. </li></ol></li></ol><ol start="2"><li> 폐의 미세 혈관 내피 세포 (LMVECs) <ol><li> 코트 100mm 페트리 0.1 % 젤라틴 용액 (PBS에서의 v / V)와 함께 요리와는 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 전체 내피 성장 매체의 젤라틴 코팅 100mm 배양 접시에 문화 LMVECs은 (내피 기초 매체-2 (EBM-2)), 특정 성장 보조 장비 보충은) 시약을 참조하십시오. 미디어에게 80~90% 합류에 도달하면 매일과 하위 문화의 세포를 변경합니다. </li><li> 하위 문화, PBS로 세포를 씻어 준 후 분리 세포를 1X 트립신-EDTA 4 ㎖로 3 분 동안 37 ° C에서 완전 EBM-2 미디어의 동일한 볼륨에 중화. 15 ML 튜브 및 centrifug에 세포 현탁액을 전송E (400 XG, 5 분). 원심 분리 후, 완전한 내피 미디어 1 ML에서 펠렛을 재현 탁하고 혈구와 세포를 계산합니다. 이 모든 실험을위한 통로 (7)에 따라 만 세포를 자신의 형태와 기능 사용에 영향을 미치는 등, 이상하지 통로 세포를 수행합니다. </li></ol></li></ol><ol start="3"><li> 중국어 햄스터 난소-P-셀렉틴 (CHO-P) 세포 <ol><li> 안정적으로 인간의 P-SEL을 표현하는 형질 전환 된 CHO 세포이다 CHO-P 세포, 공동 작업자 (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의대) (11, 12)에 의해 제공되었다. </li><li> F-12 미디어 25 ㎖에있는 T175의 CM 문화 CHO-P는 세포 2 플라스크. </li><li> 계대를 들어, 4 ~ 5 초 동안 PBS 10 ㎖로 세포를 세척 한 다음 전체 미디어에서 중화 한 다음 37 ℃에서 3 분에 대한 1X 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ㎖에를 Trypsinize. </li><li> 원심 분리 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 정중, 상등액을 흡인 전체 미디어 1 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁과 함께 세포를 세어혈구. </li></ol></li></ol> 2. 통합 다 잘 플레이트 미세 유체 시스템의 작동 <ol><li> 모든 장비가 제대로 연결되어 있는지 확인하고, 다른 모듈을 켜 : 컴퓨터, 컨트롤러, 거꾸로 현미경과 CCD 카메라. </li><li> 이미징 소프트웨어를 열고, 멀티 웰 플레이트 모듈과 영상 모듈이 화면에 표시되어 있는지 확인하십시오. </li><li> (컨트롤러에 연결) 증기 트랩에 튜브를 연결하고 또한 그들에게 압력 인터페이스에 연결합니다. </li><li> 플레이트 히터 / 어댑터 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 우물 (아래에 설명)에 시약을 추가하고 접시 위쪽에 인터페이스를 연결합니다. 자동화 된 단계에 이미징 플레이트를 놓습니다. </li><li> 인터페이스는 플레이트의 상부에 부착하고 멀티 웰 플레이트를 이용하여 쉽게 제어 할 정의 유속 미세 유체 채널을 통해 유체를 구동 웰의 상부에 컨트롤러로부터 공기압을 적용수동 모드에서 모듈 화면. </li><li> 웰 사이에 관찰 영역에 걸쳐 채널 흐름 시약. 미세 유체 채널의 크기는 70 μm의 높이 350 ㎛의 넓​​은 x입니다. 선형 채널의 길이가 1mm이고 채널의 바닥은 브라이트, 위상, 및 공 초점 형광 현미경과 호환 180 μM의 유리 커버 슬립을 포함한다. </li><li> CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 단백질 기질 또는 세포 단층과 미세 유체 채널의 코팅 <ol><li> 피브로넥틴 또는 P-/E-selectin과 미세 유체 채널을 코팅 <ol><li> PBS에서 20 ㎍ / ml의 피브로넥틴 용액 1 ㎖를 준비합니다. 코팅되어야하는 채널들의 수 (채널 당 피브로넥틴 25-50 μl를 사용)에 기초하여 부피를 바꾼다. </li><li> 물론 각각의 입구에 피브로넥틴 솔루션의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 2 DYN / ㎠의 전단력 적용5 분 채널을 perfuse하는 데 필요한 권한입니다. 액체가 아니라 콘센트에 나타나는의 구슬을 유의하시기 바랍니다. 실온에서 30 ~ 45 분 알을 품다 </li><li> 우물에서 솔루션 (채널을 공급하는 중간 원에서 직접 흡인하지 않습니다) 1,13 대기음. 콘센트도에 PBS의 200 ~ 500 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 PBS와 채널을 씻어. 채널은 정상적으로 피브로넥틴 및 사용 준비로 코팅된다. </li><li> 표면 코팅을 할 수 있도록 37 ° C에서 1 시간 배양과, 상기 한 바와 같이 P 또는 E-SEL, PBS에서 원하는 사람의 재조합 단백질의 5 ㎍ / ㎖의 용액을 제조하고, 코트 채널 코트. </li></ol></li><li> 미세 유체 채널 내부 CHO-P 또는 LMVEC 단층의 생성 <ol><li> 부드럽게 전체 미디어와 원심 분리기의 2 배 용량 (400 XG에서 5 분)를 사용하여 소멸, 3 분 동안 배양 접시에서 세포를 Trypsinize. 전체 미디어와 원심 분리기 10 ㎖ (400 XG에서 5 분)로 재현 탁 셀 전압 강하N. </li><li> 현탁액으로 세포 농도를 결정하기 위하여 세포를 카운트. 채널 내부 합류 LMVEC 단층의 형성을 보장 15-20000000 세포 / ml로 세포 농도를 가지고. 합류 CHO-P 세포 단일 층의 경우, 50-60000000 세포 / ml를 사용합니다. 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다 - 따라서 실험에 사용되는 결정 초기 셀 수. </li><li> 잘 입구에 적절한 농도로 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 현미경의 무대에서 접시를 놓고 세포가 전체 채널을 작성 화면에서 관찰하고 흐름을 중단 할 때까지 채널 (2 DYN / ㎠)로 세포를 소개합니다. </li><li> 전체 LMVEC 또는 CHO 미디어 중 하나를 200 ㎕ 씩 출구와 입구를 모두 입력합니다. 세포가 정착하자 인큐베이터에서 3 시간 동안 준수 (37 ° C에서 5 % CO 2). </li><li> 3 시간 배양 한 후, 무소속 제거하기 위해 전체 미디어 (2 DYN / ㎠, 10 ~ 15 분)와 채널을 씻어세포. 세포는 이제 완전히 합류 나타납니다과 채널의 사용 준비가 완료됩니다. 초기 셀 시딩 밀도에 따라, 안정화 시간을 추가로 2 ~ 3 시간은 세포 표면의 전체 범위를 확인해야 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. LMVEC 프로 염증 활성화 및 P-/E-selectin의 항체 차단 <ol><li> LMVEC 기초 미디어에서 TNF-α 용액 (10 NG / ML)를 준비합니다. </li><li> , 채널에 LMVEC의 염증 활성을 유도 아니라 입구에 TNF-α 용액 100 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 채널에 솔루션을 소개합니다. 제어 채널 (활성화되지 않은되는 EC)는, 흡입구 LMVEC 기저 매체의 100 μl를 잘 추가 채널 (5 분간 2 DYN / cm 2)로 소개한다. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> P-SEL 및 LMVECs 및 CHO-P 세포에 E-SEL을 차단하기 위해, P-SEL (복제 AK4, 바에서 5 ㎍ / ㎖의 중화 소개샐 미디어) 또는 E-SEL (복제 P2H3, 기저 미디어 5 ㎍ / ㎖)을 채널로 항체 및 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 다음으로, (5 분 2 DYN / ㎠) 기저 매체와 채널을 씻어. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 5. 기판 / 세포 단층 코팅 미세 유체 채널에서 HL-60 롤링 분석 <ol><li> 조심스럽게 채널이 제대로 (세포와 코팅의 경우, 완전히 합류 세포 단층이 관찰되어야한다) 코팅되어 있음을 확인하기 위해 현미경으로 채널을 검사합니다. </li><li> 롤링 실험, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG에서 5 분)에 대한 HL-60 세포 현탁액을 준비하고 기저 매체와 한 번 씻어. 5,000,000 세포 / ml로 HL-60 세포 현탁액을 생성하기 위해 (칼슘 2 + 2 + 및 Mg를 함유 기저 매체) IMDM에서 세포에 resuspend 횟수. 롤링 분석을 수행하기 위해 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다. </li><li> 셀 suspe의 25 ~ 50 μl를 추가합니다nsion 현미경 단계에 온도 조절 플레이트 홀더 (37 ° C) 및 장소 안에 잘 장소 접시를 콘센트에. 다음으로, (세포가 입구에 콘센트에서 흐르는 15 초 이내에 관찰되어야한다) 2 DYN / ㎠의 전단력을 적용하여 채널에 세포를 소개합니다. </li><li> 전단 응력의 ​​함수로서 압연 응답을 검사하려면, (5 DYN까지 0.25부터 서서히 전단력을 증가 DYN / cm 2 0.25 전단을 줄이고 원하는 각 전단에 ( &quot;스트림 취득&quot;기능을 사용) 20 ~ 30 초의 영상을 취득 / cm 2. 그것은) 높은 가위를 사용하는 것도 가능하다. </li><li> CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 경로를 회전하고 회전 속도를 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 표면 분자의 발현을 감지하는 유동 세포 계측법 <ol><li> 트립신 처리 후, 원하는 세포 유형 (HL-60,-CHO의 (1-2 × 105 세포 / 샘플을 사용) 세포 현탁액을 준비PBS에서 P 또는 LMVECs) (- / -), 2 % FBS가 보충. 두 번 세포를 세척하고 50 μL (같은 버퍼를 사용하여)에 샘플 볼륨을 가져온다. </li><li> 20 분 4 ° C에서 원하는 형광 - 복합 AB (자세한 내용은 첨부 표 참조) (알루미늄 호일로 커버) 각 샘플을 품어. </li><li> 두 번 (같은 버퍼) 세포를 세척하고 200 μL에 스테인드 세포 현탁액의 최종 볼륨을 가져옵니다. 표면 분자의 발현을 검출하는 유동 세포 계측기를 사용하여 샘​​플을 분석한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이익의 갈등을 선언하지 않습니다.

외인성 세포 기반 치료의 성공적인 번역의 주요 과제 중 하나는 효율적으로 높은 생착 효율 3 부상과 염증의 사이트에 세포를 제공 할 수 없다는 것입니다. 셀룰라 롤링 결국 조직 (5)에 내피 통해 확고한 부착 및 이주에 이르는, 혈관의 벽에 세포의 감속을 용이 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계를 나타낸다. 후보 세포 유형에 대한 압연 공정의 더 나은 이해는 세포 호밍을 강화하고 세포 기반 치료를 개선하는쪽으로 크게 기여하는 기술의 개발로 이어질 수 있습니다. PPFC 전단 흐름에 따라 세포 압연뿐만 아니라 다른 세포의 행동을 탐구하는 널리 사용되는 도구입니다. 내피 세포에서 호중구의 접착력을 조사하기위한 PPFC의 적용은 1987에 처음. 로렌스 등으로 공부했고, 그 이후 시중에서 생산 된TS는 8,9를 개발되었다. PPFCs은 챔버 (7)의 크기를 제어하는 개...

세포 기반 치료의 성공적인 임상 번역의 주요 과제 중 하나는 비효율적 인 배달 또는 원하는 사이트 3,4에 체계적으로 주입 된 세포를 대상으로합니다. 따라서, 휴대폰 호밍을 개선하기위한 방법 일정한 검색이있어, 특히 세포 치료를 개선하기위한 전략으로, 압연 전지. 혈관에 롤링 세포는 고전적인 질병 사이트 5 모집 백혈구에 대해 정의 된 세포 유도 폭포,에서 중요한 단계입니다. 이 단계는 내피 셀렉틴 사이 특정 상호 작용에 의해 지배된다, 즉, P-및 E-셀렉틴 (P-및 E-SEL), 백혈구 5,6의 표면에 자신의 카운터 리간드. 더 나은 이해와 셀 원점 복귀의 효율 향상, 특히 압연 단계는 세포 기반 치료를 개선하기 위해 새로운 플랫폼에 대한 탐구에 매우 중요합니다. 지금까지이 두 평면 플랫폼을 포함, 평행 판의 흐름 챔버 (PPFCs)를 사용하여 달성되었다세포 현탁액을 주사기 7,8, 9 펌프 사용하여 관류 통해 상부 플레이트에있는 유입과 유출 포트와 그들 사이 가스켓와 에스. 바닥 판의 표면은 중요한 세포 단층 / 기질로 코팅 될 수 있고, 전단 유동하 관류 세포와 표면 사이의 상호 작용은 다음 7을 탐구이다. 그러나 PPFC 거품 형성, 누출, 주요 단점을 제시 제대로 제어 흐름과 낮은 처리량, 시약 소모 및 매우 지루한 방법입니다. 전통적인 PPFC에 대한 대안 기술은 낮은 시약 소비 1,10으로, 정확하고, 컴퓨터로 제어되는 전단 흐름에서 세포 분석의 높은 처리 성능 (PPFCs보다 최대 10 배 이상)을 허용, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템입니다. 셀 롤링 실험은 USI를 세포 단일 층 또는 설계 기판 코팅 및 이미지가 될 수는 미세 유체 채널 내에서 수행된다NG 롤링 특성을 가진 현미경은 쉽게 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 이 연구에서, 우리는 인간 골수성 백혈병 다른 표면에 (HL-60) 세포의 회전 특성을 연구하여이 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 보여줍니다. HL-60은 P-및 E-SEL뿐만 아니라 다른 롤링 수용체를 발현하는 세포의 단층을 분석 하였다 같은 기판 상에 롤링. 또한, 항체 (AB)에 그 표면에 HL-60의 회전 운동을 중재의 특정 셀렉틴의 직접 참여를 설명하는 데 사용되었다 블로킹. 롤링 실험은 같은 회전 속도, 회전 세포 수 및 압연 경로 속성으로 키 롤링 매개 변수의 효율적인 분석을 허용하는, 최소한의 시약 / 셀 소비, 안정적인 전단 흐름에 따라, 용량 증가 하였다.

<table><tbody><tr><td>인간 폐 미세 혈관 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)</td><td>Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HL-60 Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture Reagents</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>내피 기저 배지 보충제</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV SingleQuots</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>IMDM - Iscove의 변형 Dulbecco's Medium 1x</td><td>Gibco</td><td>12440</td><td></td></tr><tr><td>F-12 (1x) 영양소 혼합물 (햄)</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신(P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(L/G) 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Sa550</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>BD Falcon</td><td>BD-353003</td><td></td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 접시, 조직 배양 처리된 폴리스티렌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브(15ml 폴리프로필렌 원추형 튜브)</td><td>MedSupply Partners</td><td>TC1500</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 용액(2%)</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>dPBS(염화칼슘 및 염화마그네슘 제외)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 용액(10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">항체</td></tr><tr><td>Anti-hE-Selectin/CD62E</td><td>R& D Systems</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>FITC 활용 마우스 IgG1</td><td>R& D 시스템</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HP-Selectin</td><td>R& D Systems</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC 활용 마우스 IgG1</td><td>R& D 시스템</td><td>BBA34</td><td></td></tr><tr><td>FITC 마우스 IgG&shy; 1 &갓파; Isotype Control</td><td>BD Bioscience</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SLeX /CD15s Ab, 클론 : 5F18</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>FITC Conjugated</td><td>Santa Cruz</td><td>SC70545</td><td></td></tr><tr><td>Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control</td><td>Santa Cruz</td><td>SC2859</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD162, 클론 : KPL-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556055</td><td></td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG1 k Isotype Control</td><td>BD Pharmingen</td><td>550617</td><td></td></tr><tr><td>Anti-P-Selectin Ab (AK4)</td><td>Santa Cruz</td><td>SC19996</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3</td><td>Millipore</td><td>MAB2150</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype Control</td><td>Santa Cruz</td><td>SC3877</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">기타 시약</td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-알파</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>세포 추적 CFSE 세포 증식 키트 - 유세포 분석용</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>인간 P-selectin-FC 재조합 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>137-PS-050</td><td></td></tr><tr><td>인간 E-selectin-FC 재조합 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>724-ES-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human, Plasma</td><td>Invitrogen</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Bioflux 1000</td><td>Fluxion Biosciences</td><td>Bioflux Montage는 실험을 실행하고 데이터를 분석하는 데 사용된 소프트웨어였습니다.</td> BioFlux 48-well plates Fluxion Biosciences BD Accuri C6 Flow <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>CFlow Plus는 실험을 실행하고 데이터를</td><td></td>분석하는 데 사용 된 소프트웨어였습니다</tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD 카메라</td><td>광도</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

세포 기반 치료를위한 주요 과제는 전신 정맥 내 또는 동맥 내 주입 다음 그 조직에 고효율로 생존 세포의 대량을 대상으로 할 수 없다는 것이다. 따라서, 휴대폰 호밍을 증가하는 것은 현재 세포 치료를 개선하기위한 전략으로 연구된다. 혈관 내피 세포에 압은 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계이며 평행 평판 유동 챔버 (PPFC)를 이용하여 시험관 프로빙 할 수있다. 그러나,이 저조한 제어 흐름 조건, 매우 지루한, 낮은 처리량 분석이다. 대신, 우리는 정밀하게 제어, 생리학 관련 전단 흐름 1,2에서 높은 처리량 세포 롤링 특성의 연구를 가능하게하는 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 이 논문에서, 우리는 P-및 E-셀렉틴 코팅 표면뿐만 아니라 세포 단층 코팅 표면에 HL-60 (인간 골수성 백혈병) 세포의 회전 특성이 readil 할 수있는 방법을 보여y를 조사했다. 더 염증성 조건을 시뮬레이트하도록, 미세 유체 채널 표면이어서 상당히 동적 조건하에 HL-60 세포와의 상호 작용을 증가 종양 괴사 인자-α (TNF-α)로 활성화 된 내피 세포 (EC에)으로 코팅 하였다. 향상된 처리량과 같은 속도를 압연과 경로를 압연과 같은 매개 변수의 신속한 분석을 허용 통합 된 다중 매개 변수 소프트웨어 분석 플랫폼은 체외 세포 롤링 특성을 평가하기위한 중요한 장점이다. 세포 압연 및 원점 복귀에 영향을 미칠 수 있도록 설계 엔지니어링 방식의 신속하고 정확한 분석을 허용,이 플랫폼은 사전 외인성 세포 기반 치료를하는 데 도움이 될 수 있습니다.

HL-60 세포가 피브로넥틴에 P-및 E-셀렉틴 표면에 롤 아니지만 그들은 롤링 리간드 P-SEL 당 단백질 리간드-1 (PSGL-1) 시알 릴 루이스 X (SLEX)을 포함하여 원점 복귀 리간드의 다양한 5,14 (그림 1A 표현으로 HL-60 세포는 황금 표준 "롤러"로 간주됩니다 ). 과 특정 상호 작용을 매개하는 테트라 당 SLEX위한 발판으로 표면 단백질 PSGL-1의 역할, P-및 E-SEL, 염증 5,6,15시 내피에 상향 조절되는. 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 테스트하기 위해, 다수의 미세 유체 채널은 그 표면을 분석 하였다 서로 다른 기질과 HL-60 세포의 구름 상호 작용과 동시에 코팅 하였다. HL-60 세포는 별개의 회전 운동에 의해 다음에 제 1 유동에서 캡처 한 세포로, P-SEL 코팅 표면에 강력한 회전 동작을 보였다. 도 1C에 도시 한 ...

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

다음 실험의 전반적인 목표는 엄격하게 제어되고 생리학적으로 관련된 전단 흐름 하에서 처리량이 증가된 세포 롤링 연구를 수행하는 것입니다. 이것은 특수 플레이트의 인접한 우물이 미세유체 채널을 통해 연결되는 다중 웰 미세유체 시스템을 사용하여 달성됩니다. 시스템의 인터페이스는 전기 공압 펌프를 멀티 웰 플레이트의 상단에 연결하고 정의된 유속으로 유정 내부에서 미세유체 채널을 통해 유체를 구동하는 공압 압력을 가합니다.일단 microfluidic 수로가 원한 기질 또는 세포 단청 monolayer로 입히면, 관심사의 세포는 microfluidic 수로 입히는 표면과의 그들의 특정한 회전 상호 작용을 탐구하기 위하여 소개되고, 다른 실험 조건 하에서 기질 또는 단층 입히는 표면과 상호 작용할 때 세포의 회전 재산은 그 때 적합한 소프트웨어로 분석될 수 있습니다. 병렬 플레이트 플로우 챔버와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 통해 시약 및 세포 소비를 최소화하면서 정밀하게 제어되고 생리학적으로 관련된 튜브 흐름에서 훨씬 더 높은 처리량으로 실버 압연 특성을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼은 세포 롤링 및 원점 복귀에 영향을 미치도록 설계된 엔지니어링 접근 방식을 빠르고 정확하게 분석할 수 있도록 하여 외인성 세포 기반 치료법을 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.단백질 기질로 미세유체 채널을 코팅하려면 먼저 새로 준비된 단백질 용액 25-50마이크로리터를 주입구에 추가합니다. 그런 다음 5분 동안 평방 센티미터당 2다인의 순전한 힘을 가하여 용액을 채널로 관류시킵니다. 액체 비드가 배출구에서 보이면 흐름을 잘 멈추고 관심 단백질로 적절한 시간 동안 플레이트를 배양한 다음 각각에서 용액을 흡인합니다. 잘.다음으로, 200에서 500 마이크로 리터의 PBS를 출구 우물에 첨가 한 다음 5 분 동안 평방 센티미터당 2 딘의 깎아 지른 듯한 흐름을 적용하여 채널을 세척하여 미세 유체 채널 내부에 세포 단층을 만듭니다. 먼저 배양 접시에서 관심 세포를 3분 동안 부드럽게 트립신하여 진행하고, 2배 용량의 가득 찬 배지로 반응을 중지한 다음 400Gs 및 rt에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 다음으로, 펠릿을 10ml의 전체 매체로 세척합니다.그런 다음 1 밀리리터의 신선한 전체 배지에 세포를 재현탁시키고 계수하고 세포 용액을 적절한 농도로 조정 한 다음 각 입구에 25-50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 플레이트합니다. 이제 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 세포가 전체 채널을 채우는 것이 관찰될 때까지 평방 센티미터당 2딘의 순전한 흐름을 적용하여 세포를 채널로 흐르게 합니다. 흐름을 멈춘 후 배출구와 내륙 우물 모두에 200마이크로리터의 적절한 세포 매체를 채운 다음 세포가 5%CO2에서 섭씨 37도에서 침전되고 부착되도록 합니다.3시간 후 전체 매체로 채널을 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 이제 세포가 완전히 융합되어 채널에서 내피 세포의 염증 활성화를 유도하는 데 사용할 준비가 되어야 합니다. 갓 준비한 TNF 알파 용액 100마이크로리터를 주입구 웰에 추가한 다음 5분 동안 제곱센티미터당 2딘의 순류를 적용하여 용액을 채널에 주입합니다.비활성화 내피 세포 채널을 제어하려면 100마이크로리터의 내피 세포 기저 배지를 주입구에 추가합니다. 내피 세포 표면에서 P 또는 E 셀렉틴을 차단하려면 적절한 중화 항체를 밀리리터당 5마이크로그램으로 채널에 도입하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 롤링 분석을 시작하기 전에 기초 배지로 채널을 세척합니다.현미경으로 채널을 주의 깊게 검사하여 채널이 제대로 코팅되었는지 확인합니다. 그런 다음 두 번째 세척 횟수 후에 HL 60 세포 현탁액을 기저 배지로 2회 세척한 다음 IMDM에서 10의 5배에서 밀리리터당 6번째 세포 농도로 세포를 재현탁합니다. 25-50 마이크로 리터의 셀 현탁액을 배출구에 첨가 한 후 플레이트를 섭씨 37도 온도 제어 플레이트 홀더에 잘 넣고 플레이트 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.세포를 미세유체 채널로 도입합니다. 배출구에서 흡입구로 흐르는 10-15초 이내에 관찰해야 합니다. 여기서, 형광 표지된 HL 60 세포를 관찰할 수 있고, P 선택 인코딩 표면과 상호 작용하며, 전단 응력의 함수로서 롤링 응답을 검사하기 위해 롤링 응답을 표시하고, 전단을 제곱센티미터당 0.25 딘으로 감소시키고, 원하는 각 전단에서 스트림 획득 기능을 사용하여 20 내지 32번째 비디오를 획득하고, 그리고 점차적으로 전단을 0.25에서 평방 센티미터당 5 딘까지 증가시킵니다.마지막으로, CCD 카메라를 사용하여 초당 11프레임의 스트림 획득으로 분석의 비디오를 획득합니다. 예를 들어, 여기에서는 초프 셀의 단층에서 롤링되는 HL 60 셀이 표시됩니다. 적절한 호환 소프트웨어를 사용하여 압연 경로와 속도를 분석합니다.HL 60 cell은 롤링 리간드, P select 및 glycoprotein ligand one 및 CI Lewis를 포함한 다양한 homing ligand를 발현하기 때문에 골드 스탠다드 롤러로 간주되며, CI Lewis는 멀티 웰 플레이트 미세유체 시스템의 기능을 테스트 X.To, 수많은 미세유체 채널이 서로 다른 기질과 HL 60 셀의 롤링 상호 작용으로 동시에 코팅되었습니다. 이러한 기질을 분석한 결과, 세포는 P select 인코딩 표면에서 강력한 롤링 거동을 보였으며 세포는 먼저 흐름에서 캡처된 후 뚜렷한 롤링 움직임을 보였습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 문헌과 일치하는 HL 60 셀은 e 및 p selectin 표면에서 유사한 롤링 거동을 나타내지만 FiberInc 코팅 기판에서는 그렇지 않습니다.호환 가능한 소프트웨어를 통해 분석된 세포 속도는 초당 1에서 12미크론 사이의 평균 속도로 p 및 e 셀렉틴에서 세포의 강력한 롤링 반응을 보여주는 순전한 응력에 대해 표시되었습니다. 관심 세포와 표면을 코팅하는 세포 단층 CHO P 세포 간의 상호 작용을 효율적으로 테스트하기 위한 이 미세유체 시스템의 타당성을 평가하기 위해 P를 안정적으로 발현하지만 e selectin은 아닌 것을 본 그림과 같이 사용하였다. HL 60 세포는 HL 60의 롤링 운동이 실제로 펙틴에 의해 매개되는지 여부를 테스트하기 위해 CHO P 세포 단층에서 상당한 롤링 반응을 나타냅니다.단층은 HL 60 세포가 채널로 풍부하기 전에 P 또는 E 셀렉틴에 대한 차단 항체와 함께 사전 배양되었습니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이, P selectin 항체로 CHO p 단층을 차단하면 표면에서 롤링되는 HL 60 세포의 수가 크게 감소하여 P select가 실제로 HL 60 롤링을 매개함을 입증했습니다. 앞서 설명한 바와 같이, 다중 웰 미세유체 플레이트는 수많은 개별 미세유체 채널로 구성되어 여러 다른 조건에서 더 높은 처리량 테스트를 수행할 수 있습니다.이 유리한 설계는 염증 조건을 시뮬레이션하기 위해 다양한 실험 조건에서 HL 60 세포와 내피 세포 간의 상호 작용을 신속하게 분석하기 위해 미세유체 채널 내부의 내피 세포를 플레이트하는 데 사용되었으며, 내피 세포는 전염증성 사이토카인 TNF 알파로 전처리되어 E의 상향 조절을 초래했지만 내피 세포 표면에서 P 셀렉틴은 그렇지 않았습니다. 흥미롭게도, HL 60 세포는 비활성화된 내피 세포와 상호 작용하지 않았으며, 세포가 이 표면에서 굴러가는 것이 관찰되지 않았습니다. 반대로, HL 60 세포는 HL 60 세포와 활성화된 내피 세포 사이의 롤링 상호 작용에서 p 또는 E 셀렉틴의 관여를 조사하기 위해 초당 평균 5 내지 15미크론의 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 강력한 롤링 거동을 보였습니다.TNF 알파 활성화 내피 세포를 차단 항체에서 P 또는 E 선택으로 사전 배양하고, TNF 알파 내피 세포에서 선택한 차단 그래프에 나타난 바와 같이 HL 60 세포의 롤링을 분석한 결과, 활성화된 내피 단층에서 롤링 세포의 수가 현저히 감소하였다. 대조적으로, 활성화된 내피 세포에서 발현되지 않는 펙틴에 대한 동위원소 대조군 또는 항체를 사용하는 것은 활성화된 내피층에서 HL 60 롤링에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 데이터는 이전 보고서와 일치하는 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 HL 60 롤링에 S 셀렉틴이 직접 관여하는 것을 보여줍니다.분석 소프트웨어를 사용하면 표면과 상호 작용할 때 개별 세포의 경로를 추적할 수 있습니다. 따라서, e select 및 항체 차단이 있거나 없는 TNF 알파 활성화 내피 세포와 상호 작용할 때 개별 세포의 경로를 구체적으로 추적했습니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 차단되지 않은 활성화된 내피 세포의 롤링 세포 수는 선택 및 차단된 활성 내피 세포보다 훨씬 높았습니다. 또한, 차단되지 않은 내피 세포에서 HL 60 세포의 롤링 이동은 지속적이고 견고한 반면, 선택 세포와 차단된 내피 세포에서 세포의 롤링 경로는 단편화된 것으로 나타났습니다.이 결과와 일치하게, 차단되지 않은 TNF 알파 활성화 내피 세포에서 HL 60 세포의 롤링 속도는 e 선택 및 차단된 내피 세포의 롤링 속도보다 현저히 낮았습니다. 이 학문은 다수 microfluidic 체계의 단단히 통제된 관 교류의 밑에 시간 당 10까지 회전 가스의 증가된 처리량으로 능률적으로 세포 회전 실험을 실행하기 위하여 사용을 설명합니다. 전반적으로, 이 미세유체 시스템은 세포 호잉의 핵심 측면인 세포 압연을 연구하기 위한 강력한 기술로 등장합니다.예를 들어, 저희 연구실에서는 현재 이 시스템을 사용하여 중간엽 줄기세포의 치료 효과를 개선하기 위한 전략으로 중간엽 줄기세포의 원점 복귀를 강화하기 위한 조건을 스크리닝하고 있습니다.

systematic-analysis-vitro-cell-rolling-using-multi-well-plate

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

우리는 비대칭 수용체 - 패턴 기판에서 셀을 회전 궤도를 관찰하고 분석하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 결과 데이터는 레이블이없는 세포 분리 및 분석을위한 수용체 - 패턴 기판의 엔지니어링하는 데 유용합니다.

비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

이 비디오 기사는 성공적으로 전체 동물의 척추 생물을 사용하여 복합 검사 및 약물 발견을위한 새로운 강력한 도구를 제공하는 제브라 피쉬 배아 많은 수의 감염 및 분석하기 위해 설립 된 높은 처리 파이프 라인에 대해 설명합니다.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

셀 마이그레이션 개발, 조직 유지 보수 및 수리, 및 tumorigenesis, 필수적 이며, 성장 요인, 발산, 및 cytokines에 의해 규제 됩니다. 이 프로토콜 점 분석 결과를, microenvironmental 신호에 연결 된, 응집력 있는 셀 시트의 철새 형을 평가 하기 위해 2 차원, 무제한 마이그레이션 분석 결과 설명 합니다.

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

여기, 우리 악기를 포함 한 녹색 형광 단백질을 표현 하는 녹 농 균 biofilms에 전단 응력 효과의 분석을 위한 형광 현미경과 함께 더 높은 처리량 미세 생물의 사용 설명 설정, biofilm 범위, 성장 율, 및 형태학 속성의 결정.

라이브 셀 분석의 전단 응력에 녹 농 균 등 처리량 미세 자동 시스템을 사용 하 여

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 전단 응력 응용을 위한 6웰 플레이트의 특정 영역으로 내피 세포 성장을 제한하는 코팅 방법을 설명한다.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

배우세요 다중 웰 마이크로플루이딕 시스템을 활용한 세포 롤링 연구 방법입니다. 생리학적 전단 흐름 조건에서 세포 상호작용을 고효율 분석하여 세포 기반 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

의 체계적인 분석 체외 셀 롤링

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