설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화

이 절차의 전반적인 목표는 약물 발견을 위한 고처리량 화합물 테스트가 가능하도록 감염된 제브라피시 배아를 대량으로 생성하는 것입니다. 이는 먼저 대형 부화 용기를 사용하여 단일 이벤트에서 동기화된 제브라피시 알을 대량으로 얻음으로써 달성됩니다. 다음으로, 알들을 aros 그리드에 정렬하고 자동 미세 주입기를 사용하여 난황에 박테리아를 감염시킵니다.

감염이 배아 전체로 확산되면, 약물 처리 전 대형 입자 유세포 분석기로 사전 분류를 수행합니다. 마지막으로, 화합물 처리 후 감염된 배아의 세균 부하 수준을 분석합니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 통해 척추의 고해상도 분석을 진행합니다.

화합물이 감염에 미치는 영향을 더 자세히 보여주기 위해 자동화된 스크리닝과 대량 입자 샘플링이 사용됩니다. 수동 주입이나 PIX 스캔 분석과 같은 기존 기술에 비해 이 방법의 주요 장점은 균일하게 영향을 받은 배아를 대량으로 생성하여 고처리량 방식으로 분석할 수 있다는 점입니다. S epiderm 접종물을 준비하려면 A PW VW 180 9 유래 M cherry 발현 벡터를 포함하는 S epiderm 균주 O 47 플레이트에서 여러 개의 개별 콜로니를 분리하여 접종하십시오.

10 µg/mL의 Chloramphenicol이 첨가된 LB 25 mL에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날 대수 증식기에 도달하면, 배양액 1 mL를 12,000 ×g에서 1분간 원심 분리하고, 0.3% v/v Tween 80이 포함된 멸균 PBS 1 mL를 사용하여 펠렛을 3회 세척한다. OD 600에서 흡광도를 측정하고, PBS 내의 2% w/v polyvinylpyrrolidone 40(PVP 40)을 사용하여 박테리아 현탁액을 OD 600이 0.3 또는 1 × 10⁸ CFU/mL가 되도록 희석한다.

aminum 접종원을 준비하려면 Middlebrook 7H10 배지에서 PS MT 3M cherry 벡터를 안정적으로 발현하는 M Meum 균주 M 또는 E 11의 단일 콜로니 여러 개를 분리하여 공기 공급을 하며 10% v/v Middlebrook ADC 농축액과 50 µg/mL의 hygromycin이 첨가된 Middlebrook 7H9 액체 배지 10 mL에 접종합니다. 28 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배양액 1 mL를 12,000 ×g에서 1분 동안 원심분리하고, 0.3% v/v Tween 80이 포함된 멸균 PBS 1 mL를 사용하여 펠릿을 3회 세척합니다.

박테리아 현탁액의 OD 600을 측정하고, PBS에 희석한 2% w/v PVP 40을 사용하여 OD 600 0.3 또는 0.3 × 10⁸ CFU/mL가 되도록 희석합니다. 수집 전날 밤, 대형 교배 용기의 하단 챔버에 암컷 제브라피시 최대 50마리를, 용기의 상단 부분에 수컷 70마리를 넣습니다. 다음 날 아침, 용기에서 분리막을 제거합니다. 약 1시간 후, 교배 용기 바닥의 알 수집기를 통해 알을 알 전용수로 채운 50 mL 튜브에 수집합니다.

자동 마이크로 인젝터 작동 소프트웨어의 텍스트 프로토콜에 따라 인젝션 플레이트를 준비한 후, calibrate stage를 클릭하고, 10 24. Well grid를 클릭한 다음 aros 플레이트를 마이크로 인젝터에 배치하십시오. 화면에서 웰의 중앙 위치를 클릭하여 플레이트를 보정하십시오. 그런 다음 needle 메뉴로 이동하여 calibrate needle holder를 클릭하십시오.

마이크로 로더 팁을 사용하여 직경 10 micron의 주입 바늘에 nanoliter당 100 CFU의 S epiderm이 포함된 10 microliters의 PVP 40, nanoliter당 30 CFU의 erum이 포함된 10 microliters의 PVP 40, 또는 모의 주입을 위한 PVP 40 단독 용액을 채웁니다. 바늘을 자동 마이크로 인젝터에 장착하고, 바늘을 내리거나 이동시킨 후 화면에서 바늘의 위치를 클릭하여 XY 위치를 보정합니다. 그런 다음 바늘 끝의 위치를 화면에서 클릭하여 Z 위치를 보정합니다. 이어서 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 aros 그리드 위에 알을 분산시키고 과잉의 알 물을 제거합니다.

그런 다음 알이 채워진 agros 그리드를 주입 메뉴의 자동 마이크로 인젝터에 넣고, 주입 압력 설정을 200 hPa, 주입 시간을 0.2 seconds, 보정 압력을 15 hPa로 조정하십시오. 이는 Femto jet 설정 메뉴의 1 nL에 해당합니다. 'Inject all'을 클릭하여 배아 플레이트 전체를 주입합니다. 주입 후 페트리 접시에서 세척하여 알을 수집하고 28 °C에서 배양하십시오.

대형 입자 유량 세포 분석기 설정이 완료되면, PMT 메뉴로 들어가 적색 채널을 650 volts로, 녹색 및 황색 채널을 0 volts로 설정하십시오. 그다음 임계값(thresholds) 메뉴에서 광학 밀도 임계값 신호를 975 millivolts에 해당하는 50으로 설정하고, 비행 시간(time of flight) 최솟값을 320 microseconds에 해당하는 800으로 설정하십시오. 데브리(debris)의 영향을 줄이기 위해 배아를 샘플 컵에 넣고, 정렬(sort) 메뉴에서 70을 입력하여 플레이트당 정렬할 최대 배아 수를 70개로 설정하십시오.

분류기 아래에 빈 페트리 접시를 놓고 수동 분류(manual sort)를 클릭하십시오. 페트리 접시가 채워지면 저장(store)을 클릭하여 데이터를 저장하십시오. 고해상도 분석이나 이미징이 필요한 경우, 배아를 96웰 플레이트의 각 웰에 개별적으로 분류할 수 있습니다.

배아를 샘플 컵에 넣고 정렬할 웰당 최대 배아 수를 1개로 설정합니다. 그다음 빈 96-웰 플레이트를 왼쪽 플레이트 홀더에 배치하고 플레이트 채우기(fill plate)를 클릭합니다. 플레이트가 채워지면 저장(store)을 클릭하여 데이터를 저장함으로써, 주입 3일 후 erum을 통해 약물 처리된 배아를 분석합니다.

한 그룹의 배아에는 용매에 녹인 관심 화합물을 처리하고, 다른 그룹에는 용매만 처리합니다. 수정 후 4일 및 5일째의 처리된 배아를 유세포 분석기의 샘플 컵에 넣고, 배아를 trica로 마취시킨 후 척추동물 자동 스크리닝 시스템과 대형 입자 샘플러를 설정하여 플레이트당 70개의 배아가 분류되도록 설정합니다. 이미지 객체 검출 설정 메뉴의 텍스트 프로토콜에 따라, 이미지 자동 저장 이미지 메뉴에서 배아의 연령에 해당하는 참조 이미지를 선택하고, 생성할 사진의 수와 사용할 방향을 선택합니다.

배아가 채워진 96-웰 플레이트를 대형 입자 샘플러의 왼쪽 플레이트 홀더에 놓고 'run plate'를 클릭합니다. 배아가 올바르게 위치하면, 10x 평면 건식 대물렌즈를 사용하여 머리와 꼬리를 각각 촬영합니다. 그런 다음 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 스티칭함으로써 난황 감염에 가장 적합한 발달 단계가 언제인지 평가합니다.

1세포기부터 512세포기까지의 모든 서로 다른 단계에서 dermitis와 marum을 이용한 주입을 수행하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, 16세포기와 128세포기 사이에 100 CFU의 dermitis를 주입했을 때 가장 최적의 감염 패턴이 나타났습니다. 박테리아는 난황 내부에서 3일 동안 증식하였으며, 감염 후 3일째부터 신체 전체로 퍼져 나갔습니다.

대형 입자 유세포 분석기를 이용한 형광 강도 분석을 통해 세균 부하량의 고처리량 정량을 수행하였습니다. 여기에서 보여지는 바와 같이, 배아 내부에 존재하는 살아있는 세균의 양은 측정된 형광 신호와 매우 잘 일치합니다. 이 그림은 30 CFU의 aminum을 주입하기 위한 최적의 발달 단계가 E 11 균주의 경우 16세포기에서 128세포기 사이이며, 그 외에는 16세포기에서 64세포기 사이임을 보여줍니다.

더욱 독성이 강한 EM 균주를 이 단계에서 배아에 주입했을 때, 배아 내부의 배축(oak)에서 세균 증식이 나타났으며 세균이 배아 전체로 퍼지는 것이 확인되었습니다. 에메린(emerin)에 감염된 배아를 서로 다른 농도의 리팜피신(rifampicin)으로 사전 처리한 결과, 마이코박테리아 감염이 농도 의존적으로 감소하는 것이 나타났습니다. 200 micromolar 농도로 약물을 사용했을 때, 처리 후 24시간부터 M mein E 11의 세균 진행이 효과적으로 억제됨이 입증되었습니다.

이러한 기술들은 결핵이나 생체 재료 관련 감염과 같은 감염성 질환의 새로운 치료법을 찾는 화합물 테스트 및 약물 개발 분야의 연구자들에게 길을 열어주었습니다.