복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

이 절차의 전반적인 목표는 반투명한 제브라피시 치어의 근섬유 조직화 정도를 평가하고, 두 가지 방법 모두에 대해 촉각 자극에 반응하여 수영하는 거리를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 제브라피시를 교배시킨 후, 근육 구조 평가를 위한 분석의 두 번째 단계에서 생존 가능한 알을 수집함으로써 수행됩니다. 코팅 및 마취된 제브라피시 배아를 실체 현미경 스테이지 위의 두 편광 렌즈 사이에 직접 배치하여, 물고기가 신체의 가로축을 따라 정렬되고 가능한 한 평평한 방향이 되도록 합니다.

그 다음 복굴절을 시각화하고 근육의 무결성을 정량화합니다. 촉각 유발 회피 분석의 두 번째 단계에서는, 코팅된 유충 한 마리를 깊은 페트리 접시에 넣고 스테레오 현미경의 시야 중심에 맞춥니다. 곤충 핀으로 꼬리를 건드려 유충에게 미세 감각 자극을 전달하며, 배아가 수영을 멈추거나 시야 밖으로 빠져나갈 때까지 동물의 반응을 촬영합니다.

궁극적으로 근육 조직의 차이와 운동 반응을 정량화할 수 있습니다. 이러한 비침습적 기술의 주요 장점은 많은 수의 물고기를 빠르게 분석할 수 있으며, 동일한 물고기의 골격근 결함을 수일 동안 인 비보(in vivo)로 모니터링할 수 있다는 점입니다. 편광 렌즈를 설정하고 치어를 적절한 방향으로 배치하는 시각적 시연은 성공적인 실험을 위해 매우 중요합니다.

이러한 분석법을 사용하여, 교배시킨 성어로부터 수집한 모든 클러치에서 생존 불가능한 알을 제거합니다. 이러한 알들은 일반적으로 육안으로 보기에 하얗고 불투명하게 보이거나, 현미경 하에서 어둡고 무질서한 세포 집합체로 보입니다. 수정 후 3~7일 동안 배아가 더 성장할 수 있도록 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 관심 배아가 여전히 난막(chorion) 안에 남아 있는 경우, 날카로운 핀셋을 사용하여 관심 배아의 난막을 조심스럽게 찢은 다음, 배아가 빠져나올 수 있도록 뒤집어 줍니다.

코팅된 배아를 정확하게 배치하기 위해 trica로 마취한 후, 편광 각도를 조절할 수 있도록 회전 가능한 편광 렌즈를 장착한 해부 현미경을 준비합니다. 배아가 펴지면, 현미경 스테이지 위에 상단 렌즈의 바로 아래쪽에 두 번째 편광 렌즈를 배치하고 그 위에 배아를 직접 놓습니다. 그런 다음 분석 대상이 되는 각 배아를 신체의 가로축을 따라 배치해야 합니다.

관심 있는 배아가 보이는 상태에서 상단 렌즈를 회전시켜 두 렌즈의 편광축이 서로 90도를 이루고 배경이 완전히 어두워질 때까지 조절하십시오. 물고기를 움직여 최대한 평평하게 누워 있도록 조정하십시오. 물고기가 굽어 있는 경우, 평평한 방향을 가진 분절만이 편광을 통과하여 형광을 나타냅니다.

이제 야생형 물고기의 복굴절(birefringence) 표현형을 관찰하십시오. 고도로 조직화된 골격근은 근섬유(myofilaments)와 평행한 빛의 굴절률이 이러한 구조에 수직인 편광보다 높기 때문에 밝은 복굴절을 나타냅니다. 신경퇴행성 근병증이나 발달 결함이 의심되는 무질서한 골격근을 가진 물고기는 일반적으로 전반적인 복굴절 감소를 보입니다.

근이영양증의 특징입니다. 일반적으로 정상적인 근육 구조의 밝은 영역 사이에 근육 퇴행을 나타내는 어두운 영역이 섞여 패치 모양의 복굴절 패턴을 보입니다. 복굴절의 정량화를 위해 편광 현미경 하에서 물고기의 이미지를 수집하십시오.

이미지를 tiff 파일로 저장하십시오. 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 복굴절 이미지를 엽니다. 여기에 표시된 것처럼 ImageJ를 사용하는 경우, 먼저 다각형 선택 도구를 사용하여 물고기 몸 주변에 선을 그려 측정할 제브라피시 근육 영역을 설정하십시오.

그 다음 '분석(analyze)' 드롭다운 메뉴에서 '측정값 설정(set measurements)'을 선택하여 이미지에 필요한 통계 항목을 지정합니다. 수정 후 2~7일 된 개체를 대상으로 한 접촉 유발 회피 행동 분석(touch evoked escape behavior assay)을 설정하기 위해 면적 평균 회색값(area mean gray value)과 최소 및 최대 회색값(min and max gray value) 확인란을 선택합니다. 코팅된 대상 물고기를 한 번에 한 배아씩 개별적으로 깊은 페트리 접시에 넣습니다.

디지털 카메라 시스템이 장착된 실체 현미경의 시야 중심에 물고기를 위치시키고 30 Hz 이상의 프레임 속도로 연속 촬영을 시작합니다. 그런 다음 곤충 핀을 사용하여 배아의 꼬리를 터치함으로써 기계적 감각 자극을 전달하고, 배아가 수영을 멈추거나 시야 밖으로 나갔을 때 촬영을 중단합니다. 마지막으로, 연속 이미지들을 비디오 파일로 변환하거나 타임랩스 이미지의 개별 프레임을 분석합니다.

오프라인 복굴절(birefringence)은 살아있는 제브라피시 배아 내 근원섬유 조직 상태를 규명하기 위한 효율적인 비침습적 분석법으로 사용될 수 있습니다. 수정 후 5일 된 야생형 제브라피시는 근필라멘트가 정렬된 배열을 이루고 있어 편광하에서 골격근이 매우 강한 복굴절을 나타냅니다. 이와 대조적으로, distro glycan 또는 DAG1 유전자에 병원성 돌연변이가 있는 동형접합체 배아는 근육 퇴행 부위를 나타내는 패치 형태의 복굴절을 보입니다. 이러한 패치 형태의 패턴과 초기 발달 과정 전반에 걸친 근육 퇴행의 빠른 진행은 다른 근이영양증 어류 모델과 일치합니다.

수정 후 5일 된 dystrophic DAG one 돌연변이체의 복굴절을 정량화한 결과, 야생형 형제에서 관찰되는 최대 복굴절의 27.9 ± 5.3%로 밝기가 유의미하게 감소한 것이 확인되었습니다. 이러한 감소는 수정 후 3일 된 myopathic mtm one morphant에서 관찰된 52.4 ± 5.5%로의 감소보다 더 심각합니다. 근육병성 어류 모델은 주요 축 골격근에서 근원섬유의 무질서함이 자주 나타나지만 퇴행성 변화의 증거는 없기 때문에, 야생형에 비해 전반적인 복굴절 감소를 보이는 경향이 있습니다. 촉각 유발 회피 행동을 통해 골격근 질환의 제브라피쉬 모델이 운동 결함과 수영 어려움을 나타낸다는 것을 입증할 수 있습니다.

첫 번째 영상은 야생형 제브라피시의 촉각 유발 회피 행동 분석법을 보여줍니다. 수정 후 5일째에 정상 치어가 매우 빠르게 헤엄쳐 멀어지는 모습에 주목하십시오. 두 번째 영상에서는 수정 후 1일째 치어의 촉각에 반응하는 촉각 유발 회피 행동이 포착되었습니다.

수정 후 5일째의 돌연변이 배아가 촉각 반응이 손상되어 자극 후에도 시야를 벗어나지 못하는 점에 주목하십시오. 이후 영상을 프레임 단위로 분석하여 DAG one 돌연변이가 촉각 자극에 반응할 때 야생형 대조군에 비해 움직임이 손상되었음을 확인했습니다. 두 유형의 배아가 정해진 시간 간격 내에 이동할 수 있었던 거리를 평균한 결과, DAG one 돌연변이에서 운동 기능이 저하되었음을 나타냈습니다.

이러한 기술들을 숙달하면 짧은 기간 동안 많은 양의 물고기를 대상으로 실험을 수행할 수 있으며, 이는 고처리량 화학 물질 스크리닝이나 돌연변이 유발 스크리닝을 실시할 때 매우 중요합니다. 이 절차 이후에는 면역 조직 화학 염색이나 전자 현미경 관찰과 같은 더 침습적인 접근 방식을 통해 분자 및 구조적 수준에서 골격근의 결함을 조사할 수 있습니다.