Name: 서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 학습하세요 V3 워크플로우를 이용한 웨스턴 블로팅에서 얼룩 없는 젤을 활용한 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 정량화 방법을. 이 기술은 전송 효율 검증과 정확한 로딩 제어를 제공합니다.

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저자는 늑대 디이터 스탈츠 박사, 아르노 레미 박사, 안톤 포쉬 박사, 패트리샤 피아티 박사, 톰 데이비스, 크리스 시모니, 제프 더반 박사에게 이 원고의 비판적 검토와 편집에 감사드립니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 앨리슨 슈워츠에게 감사드립니다.

1. 단백질 샘플 준비
(세포 배양에서 단백질을 추출하는 전형적인 절차가 설명되어 있습니다)
<ol><li>HeLa 세포 배양 접시를 얼음에 놓고 얼음차가운 트리스 버퍼링 식염수(TBS; 20m M Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)로 세포를 세척합니다.</li>
	<li>TBS를 흡기한 다음, 100mm 접시 얼음-차가운 RIPA 버퍼 당 1 ml를 추가 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1% SDS) 인산염 및 프로테아제 억제제로 보충.</li>
	<li>차가운 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 부착 세포를 긁어; 셀 서스펜션을 미리 냉각된 미세 원심 분리기 튜브로 부드럽게 전달합니다.</li>
	<li>회전기에서 4°C에서 30분 동안 일정한 교반을 유지합니다.</li>
	<li>4°C 미리 냉각된 원심분리기에서 20분 동안 16,000 x g에서 회전합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 상체를 얼음 위에 보관한 신선한 튜브로 옮기고 펠릿을 버리십시오.</li>
	<li>단백질 분석기를 수행하기 위해 용액의 소량(10-20 μl)을 제거합니다. RC DC 분석 키트를 사용하여 각 시료의 단백질 농도를 결정합니다.</li>
	<li>필요한 경우-20°C에서 장기 저장을 위해 단백질 샘플을 알리쿼트합니다. 반복 동결 및 해동 주기 단백질 저하를 일으키는 원인이 되 고 피해야 한다.</li>
	<li>각 샘플의 약 20 μg를 복용하여 2x Laemmli 샘플 버퍼(4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% 글리세롤, 0.004% 브로모페놀 블루, 125mM Tris-HCl, pH 6.8)의 동일한 부피를 추가합니다.</li>
	<li>각 셀용액을 샘플 버퍼에서 95°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	<li>1 분 동안 미세 원심 분리기에서 16,000 x g의 원심 분리기.</li>
</ol>2. 얼룩이없는 젤을 가진 젤 전기 포레시스 (~30분)
<ol><li>기준 TGX 어떤 KD 얼룩없는 프리 캐스트 젤 (미디 포맷 젤)을 가지고, 카세트의 바닥에서 빗과 테이프를 제거합니다.</li>
	<li>카세트를 기준 셀에 놓고 통합 된 상부 버퍼 챔버를 60ml 러닝 버퍼 (25 mM Tris, 190 mM 글리신, 0.1 % SDS, pH 8.3)로 채웁니다. 러닝 버퍼로 우물을 헹도 헹넘습니다.</li>
	<li>하부 버퍼 탱크의 각 절반을 400ml 실행 버퍼로 채우는 것이 표시된 채우기 선으로 작성합니다.</li>
	<li>단백질 샘플과 적절한 단백질 마커를 적재합니다.</li>
	<li>뚜껑을 탱크에 놓고 색상으로 구분된 바나나 플러그를 뚜껑에 해당 잭과 정렬합니다.</li>
	<li>젤을 ~30분 ~200V로 또는 300V에서 20분 간 실행합니다.</li>
</ol>3. 화학모독 MP 시스템을 사용하여 단백질 분리 품질을 확인하기 위해 얼룩이 없는 젤 이미징(~5분)
<ol><li>셀에서 젤 카세트를 제거합니다. 기준 셀 뚜껑에 젤 카세트 개구부 도구를 사용하여 카세트를 열고 젤을 방출하십시오.</li>
	<li>ChemiDoc MP 이미저의 UV 샘플 트레이 의 중앙에 몇 밀리리터의 물을 적용합니다. 조심스럽게 카세트에서 젤을 들어 올려 트레이에 놓습니다.</li>
	<li>이미지 랩 소프트웨어를 실행하고 다음과 같은 설정으로 얼룩없는 젤 이미지(그림 1A)를캡처합니다. 응용 프로그램: 얼룩없는 젤 젤 활성화 시간: 1분 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 가장 강렬한 밴드에 자동으로 최적화</li>
	<li>샘플 트레이에서 젤을 제거하고 즉시 진행하여 스텝을 전달합니다.</li>
</ol>4. 트랜스 블롯 터보 시스템과 단백질 전송 (~10분)
<ol><li>트랜스 블롯 터보 미디 PVDF 전송 팩을 엽니 다; 아래 스택(멤브레인 포함)을 전달 카세트의 베이스에 놓습니다.</li>
	<li>젤을 멤브레인 위에 놓고 상단 스택을 젤 위에 놓고 거품을 굴립니다.</li>
	<li>카세트 베이스에 뚜껑을 놓고 다이얼을 돌려 잠급니다.</li>
	<li>카세트를 블로터 베이에 삽입합니다.</li>
	<li>사전 설정 터보 프로그램을 선택하고 기준 젤 크기 (미디)를 선택하여 전송을 시작한 다음 RUN을 누릅니다. 일반적인 실행은 7분밖에 걸리지 않습니다.</li>
	<li>이송이 끝나면 블로팅 샌드위치를 분해하고 블롯과 젤을 탈온화 된 물이있는 용기에 두어 두습니다.</li>
</ol>5. 화학 MP 시스템을 사용하여 단백질 전달 효율성과 품질을 확인하기 위해 얼룩이없는 젤 및 블롯 이미징 (~5 분)
<ol><li>케미독 MP 이미저의 샘플 트레이에 전달 후 젤을 놓습니다.</li>
	<li>이미지 랩 소프트웨어를 실행하고 다음과 같은 설정으로 전송 후 젤(도 1B)의얼룩없는 이미지를 캡처합니다. 응용 프로그램: 얼룩없는 젤 젤 활성화 시간: 없음 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 사전 전달 젤 이미지에 대한 노출 시간과 동일</li>
	<li>샘플 트레이에서 젤을 제거한 다음 다음 설정으로 블롯(그림1C)을이미지합니다. 이미징 할 때 몇 방울의 물 이나 TBST로 얼룩을 젖은 상태로 유지합니다. 응용 프로그램 : 얼룩이없는 얼룩 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 가장 강렬한 밴드에 자동으로 최적화</li>
	<li>샘플 트레이에서 블로팅 멤브레인을 제거하고 TBST(TBS에서 0.1% Tween 20)가 있는 용기에 놓습니다.</li>
</ol>6. 항체 인큐베이션
<ol><li>블록은 1 시간 동안 방 온도에서 TBST에 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 용액에 블롯을 배치하여 차단합니다.</li>
	<li>제1표적 단백질 및 토끼 1차 항체에 대하여 제기된 마우스 1차 항체를 포함하는 용액에서 4°C에서 하룻밤 동안 블롯을 배양하여 제2표적 단백질에 대하여 제기하였다.</li>
	<li>1차 항체를 함유한 용액을 부어낸다. 다음으로, TBST 20ml에서 5분 동안 교반하여 블롯을 씻으시고 블롯을 씻으시고 말입니다. 총 5개의 세차재에 대해 4x를 반복합니다.</li>
	<li>Dylight 650 공주 염소 항마우스 항체 및 Dylight 549 공주 염소 항토끼 항체를 포함하는 이차 항체 용액에서 방 온도에서 1 시간 동안 배양한다.</li>
	<li>1차 항체를 함유한 용액을 부어낸다. 다음으로, TBST 20ml에서 5분 동안 교반하여 블롯을 씻으시고 블롯을 씻으시고 말입니다. 총 5개의 세차재에 대해 4x를 반복합니다.</li>
</ol>7. 이미지 랩 소프트웨어에 의한 이미징 및 데이터 분석- 총 단백질 정규화(~5분)
<ol><li>새로운 멀티채널 프로토콜을 열어 블롯(도1E)의멀티플렉스 형광 이미지를 획득하고, 3개의 형광 채널을 구성하고 프로토콜을 실행한다. 채널 1: 응용 프로그램: 블롯 다이라이트 650 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 가장 강렬한 밴드에 자동으로 최적화 채널 2: 응용 프로그램: 블롯 다이라이트 549 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 가장 강렬한 밴드에 자동으로 최적화 채널 3: 응용 프로그램 : 얼룩이없는 얼룩 이미징 영역: 기준 젤 이미지 노출 시간: 가장 강렬한 밴드에 자동으로 최적화</li>
	<li>분석 도구 상자에서 정규화 아이콘을 클릭하고 예를 클릭하여 차선과 대역을 검색합니다.</li>
	<li>"차선 및 밴드 도구"를 선택하고 사용하여 필요한 경우 차선과 대역을 조정합니다.</li>
	<li>무첨가 이미지를 정규화 채널로 선택합니다.</li>
	<li>MW 분석 도구를 선택하고 아래 상자를 확인하여 MW 표준 차선을 할당합니다.</li>
	<li>정규화된 볼륨을 보려면 도구 모음의 분석 테이블을 클릭합니다. 모든 계산은 정규화 계수 및 정규화된 볼륨을 포함하여 소프트웨어에 의해 자동으로 수행됩니다. 대상 단백질 밴드 강도 값은 이제 단백질 부하의 변이를 위해 조정됩니다. 이것은 견본 중 표적 단백질의 정확한 비교를 허용할 것입니다.</li>
</ol>

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<li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins%3A+application+to+corneal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li>
</ol>

저자, 안톤 포쉬, 조나단 콘, 케네스 오, 맷 해먼드, 닝 리우는 바이오 라드 연구소의 직원입니다, Inc.

전술한 V3 얼룩 없는 프로토콜은 형광 서부 블로팅을 멀티플렉싱하기 위한 것입니다. 또한 화학 발광 검출을 사용하여 서부 블로팅에 적용 될 수 있습니다. 멀티플렉스 형광 웨스턴 블롯 프로토콜에서, 얼룩없는 얼룩 이미지는 두 시간 지점에서 획득됩니다 : 1) 단백질 전달 직후; 2) 항체 배양 후 멀티플렉스 형광 화상 진찰 단계에서. 첫 번째 얼룩 없는 이미지는 전송 효율을 계산하는 데 사용되며 두 번째 얼룩없는 이미지는 로딩 컨트롤로 사용됩니다. 화학 발광 방법이 적용될 때, 화학발광 신호가 얼룩이 없는 채널에도 나타나기 때문에 얼룩이 없고 표적 단백질 신호에 대한 멀티플렉스 영상을 취할 수 없다. 이 경우, 로딩 제어 및 정규화 분석을 위해 단백질 전달 단계 직후에 찍은 얼룩없는 이미지를 사용하는 것이 좋습니다.
V3 웨스턴 워크플로는 하우스키핑 단백질을 로딩 컨트롤로 사용하는 기존의 서부 블롯 워크플로우에 비해 다음과 같은 고유한 이점을 제공합니다.
첫째, V3 워크플로는 관심 있는 단백질 의 수준의 변화를 검증하기 위해 실용적이고 편리하며 보다 신뢰할 수 있는 로딩 제어를 제공합니다. V3 프로토콜은 총 단백질 적재 제어를 사용하여 각 샘플에서 측정된 관심 있는 단백질의 수준을 정규화합니다. 특정 실험 조건하에서 시료 중 포화 면역 검출 및 일관되지 않은 가사 단백질 발현 수준 : 그것은 적재 제어로 하우스 키핑 단백질을 사용하는 두 가지 함정을 피합니다. 가사에 대한 항체로 단계를 제거하고 재로 킹하는 것은 더 이상 필요하지 않습니다. 얼룩이 없는 기술을 사용하여 총 단백질 측정을 위해 쿠마시 또는 시프로 루비와 같은 얼룩으로 얼룩을 더럽히고 얼룩을 내태 필요가 없습니다. Blot 이미지를 획득하는 데 몇 초, 이미지 랩 소프트웨어를 사용하여 총 단백질 정규화를 수행하는 데 약 5분이 걸립니다.
둘째, V3 워크플로우를 통해 과학자들은 절차를 보다 투명하게 만들고 품질 관리를 위한 여러 검사점을 도입하기 때문에 서부 절차를 더 잘 제어할 수 있습니다. 얼룩없는 기술의 도움으로 연구자들은 젤과 얼룩 모두에 단백질 샘플을 시각화 할 수 있습니다. 과학자들은 단백질 샘플 무결성(저하 여부), 분리 품질(침전 여부), 전달 효율 및 전달 품질(심지어 이전 여부)을 평가할 수 있습니다. 이러한 검사점은 연구에서 프로세스의 큰 결함을 볼 때 실험을 종료하고 가난한 샘플및 얼룩에 시간을 낭비하지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 또한 과학자들이 멤브레인 스트리핑 후 상당한 양의 단백질 손실이 있는지 여부와 블롯이 다른 표적 4를재검하는 데 적합한지 여부를 평가하는 데 도움이됩니다.
다음은 V3 서부 워크플로우를 사용하여 좋은 경험과 품질 데이터를 보장하기 위한 몇 가지 팁입니다.
<ol><li>젤을 실행 한 직후에 젤을 이미지합니다. 얼룩 화합물을 씻어 버릴 수 있으므로 절차에서 첫 번째 이미징 전에 어떤 버퍼에 젤을 담그지 마십시오.</li>
	<li>동일한 이미징 영역을 사용하여 프로토콜의 모든 이미지를 수집합니다. 이를 통해 소프트웨어는 총 단백질 정규화와 같은 데이터 분석을 위해 이미지를 오버레이할 수 있습니다.</li>
	<li>전세 및 전달 후 젤을 이미징할 때 노출 시간을 일관되게 유지합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 전송 효율성을 정량적으로 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>블롯 이미지를 획득할 때 몇 방울의 물이나 TBST로 멤브레인을 적시킵니다. 이것은 표적 단백질 검출을 위한 가능한 더러운 배경 문제를 피할 것입니다.</li>
	<li>형광성 서부 블로팅을 멀티배싱하기 위해 낮은 형광 PVDF 멤브레인을 사용하십시오.</li>
</ol>UV 활성화 후 얼룩이 없는 분자가 돌이킬 수 없는 잔류물을 트립토판 잔류물으로 구속한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 돌이킬 수 없는 변형은 에피토프가 트립토판을 함유하는 경우 단일 클론 항체를 사용할 때 항원 인식에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다. 다각성 항체는 항원에 다중 전형체를 인식하기 때문에 영향을 받을 가능성이 낮습니다. 불바운드 얼룩없는 분자는 쉽게 젤과 막에서 세척되므로 항체 항원 상호 작용을 방해하지 않습니다.
결론적으로, V3 웨스턴 워크플로우를 통해 서부 블롯 프로세스를 더 빠르고 투명하며 정량적이며 신뢰할 수 있게 합니다. 연구원은 지금 쉽게 그들의 데이터를 더 신뢰할 수 있도록 서쪽 blot 실험에 총 단백질 로딩 제어를 적용할 수 있습니다. V3 얼룩없는 워크플로우는 여러 실험실에서 채택되었으며, 저널은 서부 얼룩22,17,7,8,23,18,15에서로딩 제어로 얼룩없는 데이터를 받아 들인다는 것을 입증했습니다.

서양 얼룩은 매우 유용한 기술9,그러나, 서부 블로팅에 두 가지 주요 문제가있다: 길고 노동 집약적 인 프로세스와 데이터의 품질. 기존 프로토콜에는 약 2일이 필요합니다. 그것은 견본 준비, 젤 주조, 단백질 전기포고 및 전송, 항체 잠복기, 화상 진찰 및 아주 수시로 제거, 보충 및 마지막으로 데이터 분석에 선행된 막 차단을 포함하여 많은 단계를 관련시킵니다. 이 프로세스 전반에 걸쳐 공정 제어를 위한 안정적이고 유연한 도구는 없습니다. 따라서 각 단계에서 오류를 도입할 수 있으며 이러한 오류는 데이터 아티팩트를 생성할 수 있습니다. 따라서 부하 제어는 오류를 식별하고 수정하기 위해 서부 블로팅에서 필수적입니다. 로딩 제어는 일반적으로 각 샘플에서 기준 단백질의 단백질 수준을 확인하여 동등하게 제시되는지 확인함으로써 수행됩니다. 사람들은 종종 β 액틴, β-tubulin, GAPDH와 같은 하우스 키핑 단백질을 로딩 컨트롤로 사용합니다.
웨스턴 블롯 데이터의 품질은 신뢰할 수 있는 로딩 제어에 따라 달라집니다. 그러나 적재 제어를 위해 하우스키핑 단백질을 사용할 때 두 가지 정당한 우려가 있습니다: 1) 하우스키핑 단백질 밴드의 항체 기반 면역 검출은 종종 포화되어 있으며, 따라서샘플(30)의하중 차이를 구별할 수 없다. 2) 가사 단백질 발현 수준은 특정 실험 조건 하에서 샘플에서 다를 수 있으며, 예를 들어 siRNA 치료, 세포 사멸, 세포 분화 등11,28,3,6,10,21. 이러한 우려로 인해 과학 저널은 이제 "정량적 비교, 적절한 시약, 선형 신호 범위를 가진 제어 및 이미징 방법을 사용해야 한다"(Nature guideline)를 요구하고 있습니다. 마찬가지로, 임상 조사의 저널에서 편집자는 더 신뢰할 수있는 로딩 컨트롤을 요구하고있다24. 이러한 이유로, 가사 단백질은 로딩 제어로 사용하기 위해 검증될 필요가 있다. 첫째,면역검출법(14,29)의선형 다이나믹 범위에서 측정되는지 확인해야 한다. 둘째, 모든 샘플26,31,25,19,20에서일관되게 표현되는지 확인해야 한다.
신뢰할 수 있는 적재 제어에 대한 대체 솔루션은 블롯의 총 단백질 측정을 사용하는 것입니다. 일부 연구자들은 쿠마시, 플라밍고 핑크, 시프로 루비, 아미도 블랙, 폰소 S, 얼룩없는 기술과 같은 총 단백질 얼룩으로 얼룩을 얼룩지게하여 각 차선의 총 단백질 신호를 로딩 제어16,20,13,27,1,4,12로측정했습니다. 총 단백질 적재 제어는 가사 단백질과 관련된 함정을 피합니다. 첫째, 각 샘플에 대해 적재된 단백질의 양을 진정한 반영한다. 둘째, 토탈 단백질 얼룩은 서풍 블롯 분석(복합 세포 용액의 10-50 μg 단백질)을 위한 공통 적재 범위에서 우수한 선형 동적 범위를 나타내며,샘플(12)의하중 차이를 정확하게 분화한다.
얼룩없는 기술은 아크릴아미드 젤 용액에 독특한 화합물이 혼합되어 캐스팅 된 젤에 균등하게 분포되는 새로운 토탈 단백질 염색 방법입니다. 전기포고가 완료된 후, 젤은 최소 1분 동안 UV 광에 노출되어 얼룩 화합물이 단백질의 트립토판 잔류물과 반응합니다. 단백질은 UV 빛 하에서 흥분되어 ChemiDoc MP 시스템과 같은 얼룩이없는 사용 된 이미저에서 시각화하고 정량화 할 수있는 강력한 형광 신호를 제공합니다. 그러나 얼룩이 없는 화합물 자체는 자외선을 흡수하지 않아 젤 이미지의 배경이 낮습니다. 트립토판 잔류물의 변형은 돌이킬 수 없으며 단백질은 젤뿐만 아니라 단백질 전달 후 언제든지 얼룩에 시각화 될 수 있습니다.
얼룩없는 기술은 V3 웨스턴 워크플로우(그림 1)에적용되어 전통적인 워크플로우, 특히 가사 단백질을 로딩 컨트롤로 사용하는 것에 대한 우려를 해결합니다. 이 워크플로우를 사용하여, 1) 약 20-30 분에서 젤을 실행, 2) 젤 실행 후 5 분 에서 샘플 무결성 및 단백질 분리 품질을 검사; 3) 3-10 분에서 단백질을 전송; 4) 정량적으로 전송 효율을 확인; 그리고 5) 가장 중요한 것은, 총 단백질 로딩 제어를 사용하여 관심 있는 단백질의 수준에 있는 변경을 검증합니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>4-20% Criterion TGX 스테인-프리 캐스트 젤</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>실험에서 특정 요구 사항을 충족하는 젤 크기와 비율을 선택하십시오.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF 전송 팩</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4157</td><td>PVDF 또는 니트로셀룰로오스를 선택하고 멤브레인 크기를 젤에 맞추십시오. 크기</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 시스템 </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 v3 얼룩 없는 워크플로우

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

서부 얼룩은 매우 유용하고 널리 채택 된 실험실 기술이지만 실행은 어렵습니다. 실험가가 여러 단계의 마지막까지 성공적으로 수행되었는지 알지 못하기 때문에 워크플로는 종종 "블랙 박스"로 특징지어지기도 합니다. 또한 서부 블로팅 공정 전반에 걸쳐 효과적인 품질 관리 도구가 부족하여 서부 얼룩 데이터의 품질이 어려움을 겪을 수 있습니다. 여기서는 기존의 서부 블롯 프로토콜과 관련된 주요 문제를 해결하기 위해 얼룩이 없는 기술을 적용하는 V3 서부 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우를 통해 연구원은 약 20-30분 안에 젤을 실행할 수 있습니다. 2) 젤 실행 후 5 분 이내에 샘플 분리 품질을 시각화하는; 3) 3-10 분에서 단백질을 전송; 4) 정량적으로 전송 효율을 확인하기 위해; 그리고 가장 중요한 것은 5) 총 단백질 로딩 제어를 사용하여 관심 있는 단백질의 수준에 있는 변경을 검증하기 위하여. 이 새로운 접근법은 β 액틴, β 튜룰린, GAPDH 등과 같은 하우스키핑 단백질에 대한 블롯을 제거하고 재보행할 필요성을 제거합니다.

1. 샘플 무결성, 단백질 분리 품질 평가 및 얼룩이없는 젤 이미지로 효율성을 전달합니다.
HeLa 세포로부터의 단백질 추출물은 18웰 기준 AnyKD TGX 얼룩이 없는 젤로 20분 동안 300 V에서 분리되었다. 단백질 샘플은 4개의 다른 양에서 3x를 적재하였다 (차선 1-3, 40 μg; 차선 4-6, 30 μg; 차선 7-9, 20 μg; 차선 10-12, 10 μg). 겔은 1분 동안 UV 광 하에서 활성화되었다. 단백질 샘플무결성(예를 들어 저하) 및 분리 품질(예를들어 단백질 강수량)은 이 젤 이미지로 시각적으로 평가될 수 있다. 단백질은 그 때 Trans-Blot 터보를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막으로 7 분 동안 전송되었습니다. 도 2B는 전달 후 젤의 얼룩없는 이미지를 나타낸다. 두 이미지는 동일한 노출 시간(6.8초)으로 획득되었습니다. 레인 3 및 12차선은 전송 효율을 측정하기 위해 선택되었다. 이미지 랩 소프트웨어의 볼륨 도구를 사용하여 두 젤 이미지모두에서 3차선과 12차선을 덮도록 직사각형 상자(파란색)가 그려졌습니다. 이 상자의 볼륨 값을 기준으로 계산하면 두 차선의 전송 효율이 80%(그림 2C)임을나타냅니다. 본 실험에서, AnyKD TGX 겔은 중소형 표적 단백질을 연구하기 위해 선택되었으며 대형 단백질의 전달에 최적화되지 않았다. 전송 효율을 최적화하려면 낮은 백분율젤(예: 4-20%)의 사용이 필요합니다. 및/또는 큰 단백질의 전달을 용이하게 하기 위해 전달 시간의 조정. 2. 스테인 프리 토탈 단백질 로딩 제어는 관심 있는 단백질의 수준에 있는 작은 변경을 정량화하기 위하여 서쪽 블로팅에 있는 가사 적재 통제에 믿을 수 있는 대안입니다.
MCM-7은 DNA 라이센싱 복제 인자이며, 조사 치료 후 림프구성 세포주(LCL)에서 20-50% 감소하는 수준이다. 본 실험에서, 4개의 대조군 및 조사 처리 림프성형세포주(LCL) 배양물의 리자테(30 μg 각)는 12웰 기준 AnyKD TGX 얼룩 없는 젤로 분리되었다. 젤은 UV 빛 아래에서 1분 동안 활성화되었고 트랜스 블롯 터보에 의해 면역 블로팅을 위한 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 하우스키핑 단백질 GAPDH(녹색)는 토끼 항체(셀 시그닝 테크놀로지, 미국, 1:2,500)와 Dylight 549 공주 염소 항토끼 항체(록랜드, 미국, 1:20,000)로 조사되었다. 관심 있는 MCM-7(red)의 단백질은 마우스 항체(Abcam, 미국, 1:1,000)와 Dylight 649 공주 염소 항마우스 항체(Rockland, 1:10,000)를 사용하여 조사하였다.
도 3A는 총 단백질(파란색), MCM-7(빨간색) 및 GAPDH(녹색)의 멀티플렉스 형광 이미지를 4개의 대조군 및 조사 처리LCL 샘플에서 검출하였다. 도 3B는 각 샘플(30 μg)에서 총 단백질 패턴을 나타내는 동일한 블롯의 얼룩없는 이미지이다. 이미지 랩 소프트웨어는 각 차선의 MCM-7, GAPDH 및 총 단백질 볼륨을 측정하기 위해 샘플 레인(blue box)을 선택했습니다. MCM-7 수준은 얼룩이 없는 총 단백질 측정또는 GAPDH에 대해 정규화되었다. 정규화된 MCM-7 단백질 수준은 통계적으로 분석되었고 평균 MCM-7 단백질 밴드 부피 및 표준 편차(n=4)는차트(도 3C)에제시되었다. 두 정규화 방법 모두 소폭 감소(약 25%)를 나타냈다. 조사 치료 후 MCM-7 단백질 수준에서. 총 단백질 정규화를 가진 데이터는 적재 제어로서 GAPDH를 가진 것보다 더 작은 표준 편차를 나타냈다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> 그림 1. V3 웨스턴 워크플로우. V3 워크플로우는 왼쪽 열에 4단계로 표시됩니다. 워크플로에 사용되는 주요 계측기 및 시약은 각 단계에서 표시됩니다. 각 단계에 대한 예상 시간도 포함됩니다. 오른쪽 열은 V3 워크플로에서 최소 4개의 이미지를 생성할 수 있음을 보여 주습니다. 각 데이터의 사용에 대해 설명합니다. 전세겔, 후전젤 및블로트(A, B, C)의얼룩없는 이미지는 전통적인 서양 블로팅 기술로 쉽게 생성될 수 없다; 이러한 이미지와 데이터는 서부 블롯 워크플로우의 과학자의 제어 및 재현성을 향상시키기 위해 절차를 따라 중요한 정보와 체크포인트를 제공합니다. 표적 단백질 신호는 HRP-접합이 이차 항체가 검출 또는 형광 블롯이미지(E)에적용된 경우 동일한 블롯에서 하나 이상의 표적 단백질을 동시에 검출하기 위해 수행된 경우 화학발광 블롯이미지(D)에포획될 수 있다. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> 그림 2. V3 서부 워크플로우에서 사전 전송 및 후전 젤의 얼룩없는 이미지는 샘플 무결성, 분리 품질 및 전송 효율성을 평가합니다. (A)전세 젤 얼룩없는 이미지. (B)전송 후 젤 얼룩없는 이미지. (C)단백질 전달 효율 측정.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> 그림 3. 얼룩이 없는 총 단백질 측정을 GAPDH 면역 검출과 비교하여 로딩 컨트롤로 사용하여 관심 있는 단백질 수준을 정상화합니다. (A)형광 서부 블롯 이미지. (B)얼룩없는 얼룩 이미지. (C)정규화 된 MCM-7 단백질 수준. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

V3 워크플로우는 얼룩이 없는 젤을 사용한 웨스턴 블롯 시술입니다. 얼룩없는 기술은 연구원이 단백질 분리 품질을 시각화하고, 전달 효율을 검증하며, 가장 중요한 것은 신뢰할 수있는 적단백질 정량화를 사용하여 관심있는 단백질의 변화를 검증 할 수 있게합니다.

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

BioRad V three 워크플로우는 연구자에게 Western blotting 과정에서 더 신뢰할 수 있는 정량 분석과 확신을 제공합니다. 이는 먼저 TGX stain free 젤을 사용하여 단백질 샘플을 분리하고 시각화함으로써 달성됩니다. 분리 후 단백질은 blot turbo rapid transfer 시스템을 사용하여 막으로 전사되며, 이 시스템을 통해 전사 품질과 효율성을 검증할 수 있습니다.전사가 확인되면, 멤브레인을 블로킹하고 표적 단백질에 대한 1차 및 2차 항체로 프로빙합니다. 마지막으로, 로딩 컨트롤로서 스테인 프리 총 단백질 측정값을 사용하여 표적 단백질 수준을 정규화합니다. V three 워크플로우는 웨스턴 블로팅 과정에 편의성과 투명성을 제공하여, 연구자가 분리부터 전사, 정량화에 이르는 모든 단계에서 신뢰도를 가질 수 있게 합니다.전통적인 웨스턴 블로팅과 비교하여 V three Western 워크플로우의 주요 장점은 스테인 프리(stain free) 기술이 타겟 단백질 신호를 정규화하기 위한 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 총 단백질 로딩 컨트롤을 제공한다는 점입니다. 이 방법은 하우스키핑 단백질 신호의 과포화 및 다양한 실험 조건 하에서 하우스키핑 단백질의 상이한 발현 수준과 관련된, 웨스턴 블로팅 기술의 로딩 컨트롤 방법론의 신뢰성에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 연구 결과, 스테인 프리 겔에서 활성화된 단백질은 추가적인 염색 없이도 블롯에서 시각화될 수 있음을 발견했으며, 이를 통해 기존의 총 단백질 염색뿐만 아니라 하우스키핑 단백질 로딩 컨트롤의 대안으로 사용할 수 있게 되었습니다.다음 몇 분 동안 다중 형광을 이용한 전체 V three 워크플로를 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 단백질 샘플을 준비한 후 동일한 절차를 화학발광에도 사용할 수 있습니다. Criterion TGX stain-free any KD precast gel을 사용하여 카세트 바닥에서 콤과 테이프를 제거하십시오.카세트를 겔 장치에 장착하고 두 저장조에 전개 버퍼를 채웁니다. 단백질 표준물질과 시료를 로딩합니다. 그 후 300 V에서 20분 동안 겔을 전개합니다.전기영동이 완료되면, Criterion Cell 덮개에 있는 겔 카세트 개방 도구를 사용하여 카세트를 엽니다. 그다지 Chemi Dock MP 이미저의 UV 트랜스일루미네이터에 수 밀리리터의 물을 도포합니다. 카세트에서 겔을 조심스럽게 들어 올려 UV 트랜스일루미네이터 위에 놓습니다. Image Lab 소프트웨어를 실행하고, 기본 1분 겔 활성화 시간을 사용하여 스테인 프리(stain free) 겔을 위한 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정하며, 적절한 겔 유형과 강한 밴드에 대한 기본 자동 최적화 옵션을 선택합니다.그런 다음 프로토콜 실행(run protocol)을 클릭합니다. 이미지 캡처가 완료되면 분리 상태와 샘플 품질을 시각적으로 확인하십시오. 그 후 즉시 전사(transfer) 단계로 진행합니다.단백질 전이를 수행하려면, trans block turbo MIDI PVDF transfer pack을 개봉하십시오. 카세트 베이스 중앙에 하단 스택을 배치합니다. 이미저에서 겔을 꺼내십시오.멤브레인 위에 겔을 맞춥니다. 블롯 롤러를 조심스럽게 사용하여 겔과 멤브레인 사이의 기포를 제거합니다. 그 다음, 겔 위에 상단 스택을 맞춥니다.기포를 모두 제거한 후, 카세트 덮개를 베이스 위에 놓습니다. 덮개를 꾹 누른 상태에서 다이얼을 시계 방향으로 돌려 잠그고, 카세트를 두 개의 블로터 베이 중 하나에 삽입합니다. 홈 화면에서 터보 프로토콜을 선택하십시오.2개의 미니 겔 또는 1개의 미니 겔을 선택하고, 해당 베이의 실행 버튼을 누르십시오. 전이는 7분 후에 완료됩니다. 베이에서 카세트를 꺼내십시오.카세트를 열고 블로팅 샌드위치를 분해합니다. 전사 후 겔을 Chemi dock MP 이미저의 UV 트랜스루미네이터 위에 놓고, 멤브레인은 즉시 탈이온수에 넣습니다. 활성화 시간 없이 스테인 프리 겔을 위한 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정합니다.적절한 겔 유형을 선택하고 노출 시간을 전이 전 겔의 설정값과 동일하게 수동으로 설정한 후 프로토콜 실행을 클릭하십시오. 이미지 캡처가 완료되면, 전이 전 겔과 전이 후 겔의 샘플 밴드 강도를 비교하여 전이 효율을 확인하십시오.더 이상 필요하지 않은 겔을 샘플 트레이에서 제거하여 폐기하십시오. 확인을 위해 블롯으로 옮깁니다. 멤브레인을 샘플 트레이에 놓고 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정하십시오.스테인 프리 블롯(stain free blot)의 경우, 적절한 겔 유형을 선택하고 강한 밴드에 대한 기본 자동 최적화를 선택하십시오. 그런 다음 프로토콜 실행을 클릭하십시오.이미지 캡처가 완료되면 멤브레인으로의 전이 여부를 확인하십시오. UV 투과 조명기에서 블롯 멤브레인을 꺼내 웨스턴 블로팅용 블로킹 버퍼에 넣습니다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 다음 날 4°C에서 마우스 및 토끼 1차 항체와 함께 밤새 배양하십시오.항체 용액을 쏟아내고 50 milliliters의 TBST를 사용하여 5분 동안 블롯을 세척합니다. 형광 결합 anti muse 및 anti rabbit 2차 항체와 함께 블롯을 상온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그 후 TBST를 사용하여 블롯을 5분씩 5회 세척합니다.블롯을 이미징하려면, Image Lab 소프트웨어의 Chemi doc MP 이미저 UV 트랜스 일루미네이터 위에 블롯을 놓으십시오. 새로운 다채널 프로토콜을 설정합니다. 블롯 애플리케이션에서 dite six 50을 선택하여 채널 1을 구성하고, 강한 밴드에 대해 기본 자동 최적화 설정을 사용하십시오.이 단계들을 반복하여 채널 2와 3을 각각 DITE 5 49 및 stain free blot으로 설정하십시오. 적절한 젤 유형을 선택하고 run protocol을 클릭하십시오. 레인을 정의하려면 stain free blot 이미지의 레인과 밴드를 선택하십시오.그 다음, 정확한 정량을 위해 자동 레인 파인더(automatic lane finder)를 사용합니다. 롤링 디스크 크기를 70으로 조정하여 각 샘플 레인의 배경 프로필이 유사한지 확인하십시오. 모든 레인 프로필을 스캔하여 배경의 균일성을 확인하고, dite six 50 및 5 49 채널 모두에서 밴드를 정의하십시오.밴드 탐색 도구를 사용하여 기본 감도 설정으로 밴드를 검출하십시오. 정규화 채널을 지정하려면 분석 툴박스로 돌아가십시오. 정규화를 클릭하고 stain free blot을 선택한 후, total lane protein이 선택되었는지 확인하십시오.분자량 표준 밴드 레인을 지정하려면 분석 툴박스로 돌아가 MW 분석 도구를 클릭하고 해당 레인 아래의 체크박스를 선택하십시오. 마지막으로, 정규화된 단백질 밴드 강도를 확인하려면 툴바의 분석 표를 클릭하십시오. 소프트웨어가 볼륨 강도, 정규화 계수 및 정규화된 볼륨이 포함된 표를 자동으로 생성합니다.데이터 분석 및 보고에는 정규화된 부피를 사용해야 합니다. 표는 내보낼 수 있습니다. 추가 분석을 위해, 전체 V three Western blotting 워크플로우를 시연하였습니다.이제 실제 실험의 대표적인 결과를 보여드리겠습니다. 대조군 및 방사선 조사된 림프모구 세포 배양물의 용해물을 V three Western blot 워크플로우를 사용하여 분석하였습니다. Stain-free 총 단백질 신호는 파란색으로 표시됩니다.표적 단백질인 M CM seven은 빨간색으로, 검증된 하우스키핑 단백질 로딩 컨트롤인 GA DH는 녹색으로 표시되어 있습니다. GA DH는 본 영상에 설명된 실험 조건을 사용하여 선형성을 평가함으로써 적절한 로딩 컨트롤임이 검증되었습니다. 블롯의 각 레인에 대한 스테인 프리(stain free) 총 단백질 신호는 image lab 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다.MCM seven 신호 강도는 총 단백질과 GA DH 신호를 모두 사용하여 정규화되었습니다. 두 가지 방법으로 정규화한 MCM seven 단백질 밴드 부피를 분석한 결과, 정확한 정규화 전에는 대조군 샘플에 비해 조사된 샘플에서 발현 수준이 25% 감소한 것으로 나타났습니다. 하우스키핑 단백질은 검증 없이는 샘플 간의 선형 범위와 일관된 발현 수준을 확인하는 검증 과정이 필요합니다.하우스키핑 단백질 로딩 컨트롤은 정확한 정규화를 보장하지 않습니다. 반면, 총 단백질 정규화는 검증이 필요하지 않습니다. 따라서 V three 워크플로우를 통해 얻은 stain free 총 단백질 신호는 이 절차를 수행할 때 실용적이고 편리하며 더 신뢰할 수 있는 로딩 컨트롤을 제공합니다.Stain-free 기술은 가용한 트립토판 잔기의 UV 유도 공유 결합 수정을 통해 단백질 샘플의 형광 시각화를 가능하게 한다는 점을 기억하십시오. 이러한 수정이 면역 검출이나 질량 분석법과 같은 후속 응용 단계에 상당한 영향을 미치는 경우는 매우 드뭅니다. 이 영상을 시청하고 나면 V3 Western 워크플로우와 stain-free 총 단백질 정규화를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.본 연구에서는 다중 형광 웨스턴 블롯팅을 위한 워크플로우를 시연하였으나, 스테인 프리(stain free) 기술은 발광 웨스턴 블롯의 총 단백질 정규화에도 사용될 수 있습니다.

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

전기 방법으로 분리에 따라, 젤의 단백질은 몇 얼룩 방법에 의해 감지하실 수 있습니다. 쿠매시 블루, 실버 스테 이닝, SYPRO 오렌지, SYPRO 루비와 단백질 얼룩이 비디오 시연하고 있습니다.

젤의 단백질 염색법

모래 바닥 웨스턴 조직 homogenate 또는 추출 주어진 샘플에서 특정 단백질을 감지하는 데 사용되는 분석 기술입니다.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

이 비디오는 면역침전된 용해물의 화학발광 기반 서부 블로팅에 대해 설명합니다. 이 기술은 단백질 처리 및 활성화를 결정하는 데 도움이 됩니다. 감지된 화학발광 신호는 활성화 중 단백질 처리 수준에 비례합니다.

단백질 가공을 위한 화학발광 웨스턴 블롯 분석

이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 - 트리스 겔 시스템을 이용한다.

타운 웨스턴 가장 빠른 : 클래식 웨스턴 블롯 분석에 현대 트위스트

형광을 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)의 발전으로 단백질 발현의 미묘한 변화를 감지할 수 있게 되어 정량 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다양한 종과 조직 유형에 걸쳐 다양한 단백질을 검출하기 위한 강력한 방법론에 대해 설명합니다. 일반적인 기술 문제를 극복하기 위한 전략도 제공됩니다.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

초고속 서양 블로팅 기술은 면역 반응 강화 제와 함께 순환 배수 및 보충 (CDR) 기술을 통해 결합하는 항원 항체의 운동성을 개선하여 개발됩니다.

면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

작업을 산책 래더 안울렸으면는 숙련된 산책을 평가하고 forelimb과 hindlimb, 배치 스테핑 및 간 사지 공동 성직을 모두 측정할 수있는 새로운 테스트입니다.

작업 워킹 레더 렁 : 채점 시스템과 실용적인 프로그램입니다.

학습하세요 V3 워크플로우를 이용한 웨스턴 블로팅에서 얼룩 없는 젤을 활용한 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 정량화 방법을. 이 기술은 전송 효율 검증과 정확한 로딩 제어를 제공합니다.

서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

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