서부 블로팅에서 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 토탈 단백질 로딩 제어를 위한 V3 얼룩 없는 워크플로우

BioRad V three Workflow는 연구자에게 웨스턴 블로팅 공정에 대한 보다 신뢰할 수 있는 정량 분석과 확신을 제공합니다. 이는 먼저 TGX stain free gel을 사용하여 단백질 샘플을 분리하고 시각화함으로써 수행됩니다. 분리 후 단백질은 블롯 터보 신속 전달 시스템을 사용하여 멤브레인으로 전달되며, 이를 통해 전달 품질과 효율성을 검증할 수 있습니다.

전달을 확인한 후, 멤브레인을 차단하고 표적 단백질에 대한 1차 및 2차 항체로 프로브합니다. 마지막으로, 표적 단백질 수준은 stain free total protein 측정을 loading control로 사용하여 정규화됩니다. V three 워크플로우는 웨스턴 블로팅 공정에 편의성과 투명성을 제공하여 연구자에게 분리에서 전달 및 정량화에 이르는 모든 단계에서 확신을 줍니다.

전통적인 웨스턴 블로팅에 비해 V three Western 워크플로우의 주요 장점은 염색 방지 기술이 타겟 단백질 신호를 정규화하기 위한 실용적이고 편리하며 신뢰할 수 있는 총 단백질 로딩 제어를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 하우스키핑 단백질 신호의 과포화 및 다양한 실험 조건에서 하우스키핑 단백질의 차등 발현 수준을 포함하는 웨스턴 블로팅 기법에 대한 로딩 제어 방법론의 신뢰성과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 stain free gel에서 활성화된 단백질을 추가 염색 없이 blos에서도 시각화할 수 있음을 발견하여 기존의 총 단백질 염색의 대안으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단백질 로딩 제어를 관리할

앞으로 몇 분 안에 멀티플렉스 형광을 사용한 완전한 V 3 워크플로우를 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 단백질 샘플을 준비한 후 화학발광에도 동일한 절차를 사용할 수 있습니다. KD 프리캐스트 젤을 stainerion TGX stain free 기준으로 사용하여 카세트 바닥에서 빗과 테이프를 제거합니다.

카세트를 젤 장치에 놓고 두 저장소를 모두 흐르는 버퍼로 채웁니다. 단백질 표준물질과 샘플을 로드합니다. 그런 다음 300볼트에서 20분 동안 젤을 실행합니다.

전기영동이 완료된 후 Criterion Cell 뚜껑의 젤 카세트 개봉 도구를 사용하여 카세트를 엽니다. 그런 다음 Chemi Dock MP 이미저의 UV 투광기에 몇 밀리리터의 물을 바릅니다. 카세트에서 젤을 조심스럽게 들어 올려 UV Trans Illuminator Launch Image Lab 소프트웨어에 놓고 기본 1분 젤 활성화 시간을 사용하여 얼룩 없는 젤에 대한 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정하고 적절한 젤 유형과 강렬한 밴드에 대한 기본 자동 최적화를 선택합니다.

그런 다음 프로토콜 실행을 클릭합니다. 이미지 캡처가 완료되면 분리 및 샘플 품질을 시각화합니다. 그런 다음 즉시 전송 단계로 진행하십시오.

단백질 전달을 수행하려면 트랜스 블록 터보 MIDI PVDF 전달 팩을 엽니다. 하단 스택을 카세트 베이스 중앙에 놓습니다. 이미저에서 젤을 제거합니다.

멤브레인 위에 젤을 정렬합니다. 블롯 롤러를 부드럽게 사용하여 젤과 멤브레인 사이의 기포를 제거합니다. 다음으로, 젤 위에 상단 스택을 정렬합니다.

기포를 제거한 후 카세트 덮개를 바닥에 놓습니다. 뚜껑을 단단히 누르고 다이얼을 시계 방향으로 돌려 잠그고 카세트를 두 개의 블로터 베이 중 하나에 삽입합니다. 홈 화면에서 터보 프로토콜을 선택합니다.

두 개의 미니 젤 또는 하나의 미니 젤을 선택하고 해당 베이의 실행 버튼을 누릅니다. 전송은 7분 안에 완료됩니다. 베이에서 카세트를 제거합니다.

카세트의 잠금을 해제하고 블로팅 샌드위치를 분해합니다. Chemi dock MP 이미저의 UV 투광기에 포스트 트랜스퍼 젤을 놓고 즉시 멤브레인을 탈이온수에 넣습니다. 활성화 시간이 없는 염색 무함유 겔을 위한 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정합니다.

적절한 겔 유형을 선택하고 노출 시간을 이식 전 겔의 노출 시간으로 수동으로 설정하고 run protocol을 클릭합니다. 이미지 캡처가 완료되면. 전이 겔과 사후 전이 겔 사이의 시료 띠 강도를 비교하여 전달 효율을 확인합니다.

더 이상 필요하지 않으므로 샘플 트레이에서 젤을 제거하고 폐기합니다. 확인하려면 블롯으로 옮기십시오. 멤브레인을 샘플 트레이에 놓고 새로운 단일 채널 프로토콜을 설정합니다.

얼룩 없는 얼룩을 위해. 적절한 젤 유형을 선택하고 강렬한 밴드에 대한 기본 자동 최적화를 선택합니다. 그런 다음 프로토콜 실행을 클릭합니다.

이미지 캡처가 완료되면 멤브레인으로의 전송을 확인합니다. UV 트랜스 일루미네이터에서 블롯 멤브레인을 제거하고 웨스턴 블로팅을 위해 차단 버퍼에 넣습니다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양한 후 다음 날 섭씨 4도에서 밤새 마우스 및 토끼 1차 항체와 함께 배양합니다.

항체 용액을 붓고 TBST 50ml를 사용하여 5분 동안 얼룩을 씻습니다. 형광 접합체, 항뮤즈 및 항토끼 2차 항체로 블롯을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 TBST를 사용하여 각각 5분씩 5회씩 블롯을 세척합니다.

블롯을 이미지화하려면 이미지 랩 소프트웨어에서 Chemi doc MP 이미저의 UV 트랜스 일루미네이터에 블롯을 배치합니다. 새 다중 채널 프로토콜을 설정합니다. dite six 50 under blot 응용 프로그램을 선택하여 채널 1을 구성하고 강렬한 대역에 대해 기본 자동 최적화를 사용합니다.

이 단계를 반복하여 DITE 5, 49 및 얼룩 방지 블롯에 대해 각각 채널 2와 3을 구성합니다. 적절한 겔 유형을 선택하고 run protocol을 클릭합니다. 레인을 정의하려면 스테인 프리 블롯 이미지 레인 및 밴드를 선택합니다.

그런 다음 정확한 정량 분석을 위한 자동 레인 파인더. 롤링 디스크 크기를 70으로 조정하여 각 샘플 레인의 배경 프로파일이 유사한지 확인합니다. 모든 레인 프로파일을 스캔하여 6개의 50 및 5개의 49 채널 모두에서 대역을 정의하여 배경 균일성을 확인합니다.

밴드 파인더 도구를 사용하여 기본 감도 설정을 사용하여 밴드를 감지합니다. 정규화 채널을 지정하려면 analysis toolbox로 돌아갑니다. normalization(정규화)을 클릭하고 stain free blot을 선택하여 total lane protein이 선택되었는지 확인합니다.

분자량 표준물질 lane을 analysis toolbox로 되돌리려면 MW analysis tools를 클릭하고 해당 lane 아래의 확인란을 선택합니다. 마지막으로, 정규화된 단백질 밴드 강도를 보려면 도구 모음에서 분석 테이블을 클릭합니다. 소프트웨어는 볼륨 강도, 정규화 계수 및 정규화된 볼륨을 포함하는 테이블을 자동으로 생성합니다.

정규화된 볼륨은 데이터 분석 및 보고에 사용해야 합니다. 테이블을 내보낼 수 있습니다. 추가 분석을 위해 완전한 V three 웨스턴 블로팅 워크플로우를 시연했습니다.

이제 실제 실험의 대표적인 결과를 보여드리겠습니다. 대조군 및 방사선 조사된 림프모세포 세포 배양의 용해물은 V three western blot workflow를 사용하여 분석되었습니다. 염색되지 않은 총 단백질 신호는 파란색으로 나타납니다.

표적 단백질 M CM 7은 빨간색으로 표시되고, 검증된 하우스키핑 단백질 로딩 제어 GA DH는 녹색으로 표시됩니다. GA DH는 이 비디오에 설명된 실험 조건을 사용하여 선형성을 평가하여 적절한 하중 제어로 검증되었습니다. 블롯의 각 레인에 대한 염색 없는 총 단백질 신호는 이미지 실험실 소프트웨어를 사용하여 측정되었습니다.

MCM 7개 신호 강도는 총 단백질 및 GA DH 신호를 모두 사용하여 정규화되었습니다. 두 가지 방법으로 정규화한 MCM의 7개 단백질 밴드 부피는 정확한 정규화 전에 대조군 샘플에 비해 방사선 조사된 샘플의 발현 수준이 25% 감소한 것으로 나타났습니다. 하우스키핑 단백질은 검증 없이 샘플 간의 선형 범위와 일관된 발현 수준을 확인하는 검증이 필요합니다.

하우스키핑 단백질 로딩 제어는 정확한 정상화를 보장하지 않습니다. 대조적으로, 전체 단백질 정규화에는 검증이 필요하지 않습니다. 따라서, V 3 작업 흐름에 의해 얻어진 얼룩 자유로운 총 단백질 신호는 이 절차를 시도하는 동안 실제 적이고, 편리하고, 믿을 수 있는 선적 통제를 제안합니다.

stain free 기술을 사용하면 사용 가능한 트립토판 잔류물의 UV 유도 공유 공유 변형을 통해 단백질 샘플의 형광 시각화를 수행할 수 있습니다. 드문 경우지만 이러한 변형이 면역 검출 또는 질량 분석법과 같은 다운스트림 응용 분야에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 V three Western 워크플로우 및 염색 없는 총 단백질 정규화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

다중 형광 웨스턴 블로팅에 대한 이 워크플로우를 시연했지만, 염색 방지 기술은 발광 웨스턴 블롯을 사용한 전체 단백질 정규화에도 사용할 수 있습니다.