3.4: 효모 유지

Saccharomyces cerevisiae에서 세포주기 조절, 텔로머라제 활성 및 자가포식에 대한 중요한 발견은 이 효모 종이 연구를 위한 귀중한 모델 유기체임을 입증했습니다. 효모는 성장하기 쉽고 효모 플라스미드 및 균주는 상업적으로 이용 가능합니다. 효모 배양에 대한 요구 사항이 상대적으로 저렴함에도 불구하고 이 유기체의 유지 관리는 성공적인 실험을 위해 매우 중요합니다. 이 동영상은 실험실에서 효모 세포 배양을 성장시키고 S. cerevisiae 균주를 유지하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

생물학에서 성장 곡선은 일정 기간 동안의 세포 개체군의 변화를 나타냅니다. 효모에서 성장 곡선은 y축에서 600nm에서 세포 배양의 광학 밀도 또는 "OD"를 플로팅하고 x축에서 시간을 표시하여 생성됩니다. 광학 밀도 또는 "흡광도"는 효모 세포 현탁액으로 유입되는 빛의 강도와 이를 통과하는 강도의 대수 비율입니다. 빛의 특정 파장에서의 OD는 분광 광도계를 사용하여 측정됩니다.

효모로 작업할 때 효모 균주의 성장 곡선은 서로 다른 시간 간격으로 OD 측정을 수행하여 생성되어야 합니다. 효모 성장 곡선은 세 가지 주요 단계로 나뉩니다: 지연기, 대수기, 고정상기. 지체 단계에서는 세포가 환경에 적응하고 크기가 커지지만 분열하지는 않습니다. 로그 단계에서는 세포가 활발하게 분열하여 세포가 두 배로 증가합니다. 사용 가능한 영양소가 고갈되면 효모 세포는 세포 분열이 느려지고 세포 개체군이 일정하게 유지되는 정지 상태로 들어갑니다.

성장 곡선을 사용하여 스트레인의 배가 시간은 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다: OD1 및 OD2는 광학 밀도 측정을 나타내고 T1 및 T2는 측정 사이의 시간을 나타냅니다. 배가 시간은 세포 집단이 세포 수를 두 배로 늘리는 데 필요한 시간으로 정의됩니다. 예를 들어 여기에 표시된 대로 두 로그 위상 OD 값 사이(예: 값 0.2와 0.5 사이)를 계산합니다. 야생형 효모는 약 90분의 배가 시간 값을 제공해야 합니다.

더블링 시간을 알면 하루 종일 그에 따라 실험을 계획할 수 있으므로 유익합니다.

이제 효모 성장 곡선의 기본 사항을 다루었으므로 실험실로 이동하여 효모 세포를 성장시키기 위한 준비를 직접 해 보겠습니다. 풍부한 성장 매체의 주요 구성 요소? 일명 효모 식품 - 효모 추출물, 펩톤 및 설탕 공급원. 효모 추출물은 세포벽을 제외한 효모 세포 내용물을 함유하고 있으며 성장에 필요한 아미노산, 비타민, 탄수화물 및 기타 영양소를 제공합니다. 펩톤은 동물성 육류 또는 우유에서 추출되며 효모 배지에서 아미노산의 주요 공급원입니다. 일반적으로 포도당과 같은 당 공급원은 성장하는 세포에 에너지를 제공하기 때문에 추가됩니다.

효모 추출물과 펩톤을 물에 용해시킨 후 오토클레이브를 사용하여 혼합물을 살균합니다. 효모 매체 플레이트를 만들려면 액체 매체에 한천을 추가하고 혼합물을 플레이트에 부어 실온에서 응고되도록합니다. 이 플레이트는 효모 군체를 성장시키기 위해 균주를 줄무늬로 만들 때 사용할 수 있습니다.

이제 우리는 모든 미디어를 준비했으니, 어떻게 이 동물들의 문화를 처음부터 성장시킬 수 있을까요? 무엇보다도 모든 기기, 용액 및 매체가 멸균 상태인지 확인하십시오.

다음으로, 효모 세포를 줄무늬로 만들 플레이트를 구합니다. 아니, 그런 종류의 줄무늬가 아닙니다! 줄무늬는 여기에서 볼 수 있듯이 멸균 기구를 사용하여 액체 효모 배양물을 한천 플레이트에 퍼뜨리는 과정입니다. "줄무늬"의 주위에 효모 세포의 순수한 유전 인구를 얻기 위하여 따를 수 있는 단 하나 효모 세포에서 파생되는 개인적인 식민지가 형성될 것이다. 플레이트에 줄무늬가 생기면 플레이트를 뒤집어 30 ? C 인큐베이터는 2-3일 동안 사용됩니다. 이것은 효모 성장을 위한 최적의 온도입니다.

군체가 형성되면 소량의 성장 배지에 효모 세포를 접종합니다. 여기서 Inoculate는 단일 군체를 선택하고 간단히 혼합하여 미디어에 소개하는 것을 의미합니다. 30 년에 문화를 배양하십시오. C 셰이커 또는 회전기 48 시간.

세포의 더 큰 배양을 성장시키려면 먼저 분광 광도계를 사용하여 2일 된 효모 배양의 OD600을 확인하십시오. 시작 OD가 약 0.1-0.2가 되도록 적절한 희석을 만듭니다. 세포를 희석한 후 플라스크를 30 ? C 셰이커를 만들고 세포를 원하는 OD까지 성장시킵니다.

S. cerevisiae를 키우는 방법을 배운 후 다음으로 중요한 교훈은 나중에 사용하기 위해 보관하는 방법입니다. 플레이트에서 자란 효모는 4 ? C 최대 3개월. 그러나 신선한 배양액을 성장시키려면 접종하기 전에 먼저 새 플레이트에 세포를 다시 줄무늬를 만들어야 합니다.

효모 균주의 재고를 장기간 저장하려면 글리세롤을 함유한 냉동 생물에 세포를 분취하십시오. 그런 다음 셀을 -80 ? C, 최대 몇 년까지 남아 있을 수 있습니다.

이제 효모 세포를 성장시키는 데 전문가이셨으니 과학 연구에 이러한 필수 기술을 적용할 수 있는 방법을 살펴보겠습니다. 고정상(stationary phase)의 세포는 노화 중 게놈 DNA 불안정성을 조절하는 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오 클립은 3일 된 배양에서 세포를 채취한 것을 보여줍니다. 그들은 정상적인 효모 세포가 성장하는 것을 방지하는 선택적 매체에 도금됩니다. 돌연변이를 획득한 세포만이 이 판에 군체를 형성할 수 있습니다. 플레이트의 콜로니 수는 배양물의 게놈 불안정성 수준에 비례합니다.

노화를 연구하는 또 다른 예는 효모 세포의 연대기적 수명을 분석하는 것입니다. 연대기적 노화는 일정 기간 동안 세포 생존력의 손실을 나타내며 여기에 표시된 것처럼 액체 배양을 성장시켜 연구할 수 있습니다. 이 비디오에서 과학자는 세포 생존력을 결정하는 데 도움이 되는 성장 곡선을 생성하기 위해 사양에 다양한 배양물을 로드하고 있습니다.

로그 단계의 야생형 효모 세포는 건강하고 정상적인 세포를 나타내며 리보솜과 같은 진핵 세포 소기관을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오에서는 로그 단계에서 수집된 세포의 세포 용해물이 슈크로스 그래디언트로 로딩되는 것을 볼 수 있습니다. 다음으로, 세포를 회전시켜 리보솜을 침전시키고 흡광도 모니터를 사용하여 리보솜 프로파일을 생성합니다.

당신은 방금 Saccharomyces cerevisiae의 축산 및 유지 관리에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 동영상에서는 효모 성장 곡선을 검토하고, 세포 배양을 성장시키는 방법을 시연하고, 효모 균주를 유지하는 방법을 보여주었습니다. 시청 해 주셔서 감사 드리며, 새싹에게이 비디오를 추천하는 것을 잊지 마십시오.