를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

이 절차의 전반적인 목표는 연대기적 수명을 일련의 간단한 DNA 손상 및 돌연변이 분석과 결합하여 효모의 연령에 따른 게놈 불안정성을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 이틀에 한 번씩 연대순 노화 배양을 샘플링하고 집락 형성 단위 또는 CFU 형성에 의한 생존 가능성을 확인함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 노화 배양을 샘플링하고 돌연변이 특이적 선택 배지에서 세포를 도금하여 DNA 돌연변이를 검사하는 것입니다.

궁극적으로, 돌연변이 분석 결과를 생존력에 대한 정규화를 통해 효모 연대기적 노화 중 DNA 돌연변이의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 노화와 게놈 불안정성을 연결하는 메커니즘과 같은 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.효모 연대순 수명 또는 CLS를 분석하기 위해 먼저 단일 효모 군체를 1ml의 합성 완전 포도당 또는 SDC 배지에 접종하고 다음 날 섭씨 30도에서 흔들면서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양을 10ml의 신선한 SDC 배지로 희석하여 0.05-0.1의 OD 600으로 3일 동안 섭씨 30도에서 흔들면서 배양합니다.

3일째에 세포가 고정상에 있을 때 각 Eloqua를 오토클레이브 물에 10, 000회 희석한 다음 플라스크에서 10마이크로리터 분취액 2개를 제거하고 희석된 각 배양액을 A-Y-E-P-D 플레이트에 10마이크로리터로 도금합니다. 군체가 생길 때까지 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다. 3일째 문화에서 발생하는 군체 또는 군체 형성 단위의 수는 100% 생존으로 간주됩니다.

도금을 위해 이후 며칠 동안 노화 배양에서 부분 표본을 계속 제거합니다. CFU 분석에서 약 20 - 100개의 콜로니를 보장하기 위해 그에 따라 희석 계수를 조정합니다. 샘플링은 배양액의 생존율이 1% 미만으로 감소하면 중단되며, 일반적으로 11일에서 13일 사이에 플레이트에서 노화된 세포에서 세포 생존율을 연구할 수도 있습니다.

이 분석을 시작하기 위해 단일 콜로니를 1ml의 합성 완전 포도당 배지에 접종하고 섭씨 30도에서 흔들면서 밤새 배양합니다. 배양액이 밀리리터당 약 10 내지 8번째 세포로 성장하면 오토클레이브 물로 배양액을 10마이크로리터당 100 - 200개 세포, 10마이크로리터당 1000개 세포로 희석합니다. 각 균주에 대해 도금 밀도에 따라 라벨링된 8-20개의 트리토판 드롭아웃 SDC 플레이트 세트를 준비합니다.

숙성하는 동안 생존율이 감소할 것으로 예상하여 10-100개의 콜로니를 계산할 수 있도록 각 플레이트에 10-30마이크로리터의 희석된 배양액 2개를 주입합니다. 도금 당일 수명 분석 기간 동안 섭씨 30도로 설정된 플레이트를 배양하고 이후 이틀에 한 번씩 플레이트 하나를 제거하고 0.5ml의 트리토판을 적가하여 생존 가능한 세포가 자랄 수 있도록 합니다. 플레이트를 섭씨 30도에서 추가로 48-72시간 동안 배양합니다.

48시간에서 72시간 후. 연대기적 노화 동안 4개의 DNA 손상 및 돌연변이 빈도를 분석하기 위해 트립토판 에디션 당일의 생존 가능성에 대해 CFU를 계산합니다. 특별한 기능을 가진 여러 가지 이상한 것이 효모 CLS 분석을 위한 야생형 균주와 병행하여 성장합니다.

자발적 돌연변이 빈도는 연대순으로 노화된 배양에서 칸나 반닝 저항성의 빈도를 측정하여 평가할 수 있습니다. 혈장 아르기닌 퍼미아제를 암호화하는 캔 1 유전자의 돌연변이는 아르기닌 유사체 L Canavan Canavan 저항성 세포가 아르기닌 드롭아웃에서 성장할 것입니다. 하나의 코팅 시퀀스를 통해 효모 연대순 노화 여행 중 염기 치환 속도를 추정할 수 있습니다.

양성 복귀 세포는 트립토판 드롭아웃 플레이트에서 자랍니다. lyse 부정적인 긴장 EH 1 50은 리신을 위한 ox 위축을 초래하는 열리는 독서 구조에 있는 플러스 4 교대를 품고 있고, 이것은 작은 삽입 또는 삭제 돌연변이에 의해 반전될 수 있다. 리신(lysine) 드롭아웃 플레이트(dropout plate)에서 환향체(revertant)를 선택하여 총 염색체 재배열 또는 gcr을 검출합니다.

돌연변이 균주가 사용되며, HX T 13은 7.5 킬로메어에 텔로머를 위치시켜 5 번 염색체에 하나가 U 3 개의 카세트 돌연변이에 의해 파괴되며, 1 개와 U 3 개의 유전자는 각각 L Canavan 및 5 개의 플루오로 오로산에 내성을 가진 세포를 만듭니다. 두 유전자에서 발생하는 점 돌연변이의 빈도가 낮기 때문에 El Canavan과 five fluoro orotic acid에 대한 내성 빈도를 분석하면 상동 및 상동 재조합 수준을 모니터링하기 위한 gcr 추정을 제공합니다. 연대기적 노화 동안 100% 상동 역 반복 또는 91% 상동성을 가진 돌연변이가 생성됩니다.

IRS 사이 그의 3개의 궤자리 재조합에 IRS는 기능적인 그의 3개의 단백질의 표정을 허용한다. 따라서 재조합이 일어난 세포는 갈락토오스가 보충된 히스티딘 드롭아웃 플레이트에서 성장합니다. 3일차에는 세포가 고정상에 있고 각 노화 배양에서 적절한 양의 세포가 제거될 때 세포가 제거됩니다.

모든 분석에 동일한 절차가 사용되기 때문에 하나의 샘플만 처리됩니다. 이 비디오에서는 탁상용 원심분리기에서 회전하여 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 제거하고 1ml의 오토클레이브 물 펠릿에 세포를 재현탁합니다.

다시, 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 100마이크로리터의 물판 세포에 재현탁하여 원하는 되돌리기를 선택합니다. 섭씨 30도에서 플레이트를 배양하면 3-4일 동안 CFU를 계수한 후 돌연변이 빈도가 생존 가능한 세포의 수로 정규화됩니다. 이 그래프는 야생형 세포의 연대기적 생존을 S, CH 9개의 델타, TOR 1개의 델타 및 RA의 2개의 델타 돌연변이와 비교할 때 일반적인 연대기적 수명 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다.

액체 배양에서 TOR 1 s, CH 9 또는 RA 2가 없는 돌연변이는 연대기적 수명이 연장된 것을 보여줍니다. 또한, s CH 9 및 RAs 2의 결핍은 다양한 탄소원이 존재하는 경우 수명 촉진 연대기적 생존에 부가적인 효과를 보여줍니다. NC 2 생존도 분석을 사용한 것이 다음 그래프에 나와 있습니다.

첫째 날, SDC 야생형 배양물을 희석하여 탄소원 없이 SC 트립 드롭아웃 플레이트에 도금했습니다. 포도당 에탄올 또는 글리세롤 오레이트 플레이트가 보충된 SC Tripp 드롭아웃 플레이트를 2일마다 섭씨 30도에서 배양했습니다. 각 세트에서 하나의 플레이트를 추출하고 성장과 군체 형성을 허용하기 위해 적절한 영양소를 첨가했습니다.

연령에 따른 돌연변이 빈도는 균주, 배경, 유전자 조작, 문화, 조건 및 연령에 따라 크게 다릅니다. 이 표는 야생형 변형률에서 얻은 일반적인 결과를 보여줍니다. 트랜스 병변 합성의 대표적인 결과가 다음 이미지에 나와 있습니다.

연령에 따른 돌연변이 빈도 증가는 핵 추출물 및 다양한 DNA 주형을 사용한 잘못된 DNA 복구의 변화를 포함할 수 있습니다. 연대순으로 노화된 세포에서 번역 합성 또는 TLS를 평가할 수 있습니다. 3일 된 고정상, 야생형 및 SCH 9 델타 돌연변이 세포의 핵 추출물을 분석했습니다.

템플릿이 손상되지 않은 TLS 제품은 실선으로 표시되고 템플릿이 손상된 TLS 제품은 점선으로 표시됩니다. 수명이 긴 s CH nine 델타 돌연변이 없는 프라이머의 핵 추출물에서 관찰된 트랜스 병변 합성은 없었으며, 열린 화살표로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 효모에서 연대기적 수명과 DNA 돌연변이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.