정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

다음 실험의 전반적인 목표는 조절 가능한 저항성 펄스 센싱(tunable resistive pulse sensing)을 사용하여 세포외 소포의 양을 정량화하고 크기 프로파일을 분석하는 것입니다. 표준적인 방법은 정제된 세포외 소포에서 측정된 전류 차단 값과 폴리스티렌 비드 표준물질에서 측정된 값을 비교하는 것입니다. 세포외 소포를 특성화하는 또 다른 방법은 샘플에 폴리스티렌 비드를 첨가하는 것이며, 이는 정제되지 않은 세포외 소포와 같은 복잡한 샘플을 다룰 때 사용됩니다.

세포 배양 배지에서 도출된 데이터는 세포외 소포의 정제 여부와 관계없이 그 크기와 수를 특성화합니다. 웨스턴 블로팅이나 라텍스 비드에 결합된 세포외 소포의 유세포 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 물리적인 분리나 표지가 필요 없이 생물학적 액체 내의 입자를 직접 특성화한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 세포외 소포의 크기가 불균일하기 때문에 분석에 어려움을 겪을 수 있습니다.

더 작은 소포를 검출하려고 할 때, 더 큰 소포가 나노포어를 막을 수 있습니다. 작업 가능한 상태로 빠르게 복구하기 위한 몇 가지 실질적인 팁과 요령을 프로토콜에 추가하였습니다. 당사는 세포외 소포의 생성을 줄이려고 시도하였으며, 세포 배양액 내 소포의 농도를 정량화하는 방법이 필요했습니다.Snet.

나노 입자를 특성 분석하는 방법을 찾는 과정에서 TRPS를 접하게 되었으며, 이를 sles 및 세포 배양 상층액 및 기타 생체 유체 분석에 더 적합하도록 프로토콜을 수정하였습니다. 우선 TRPS 장비를 eyes on control suite 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 연결하십시오. 텍스트 프로토콜에서 설명한 대로 전기적 간섭을 최소화해야 합니다.

이제 나노포어(Nanopore) 크기를 선택하십시오. 70~200 nm 크기의 소포체에는 NP 100이 가장 적합하며, 85~300 nm 크기의 소포체에는 NP 150을 사용할 수 있습니다. 100~400 nm 크기의 소포체를 측정하는 데에는 NP 200이 더 적합합니다.

그런 다음 NP 100 및 NP 150에 맞는 보완적인 폴리스티렌 교정 입자를 선택하고, NP 200의 경우에는 CPC 100 교정 입자를 선택하십시오. CPC 200 교정 입자를 사용하십시오. 교정 입자를 30초 동안 볼텍싱하십시오.

입자들이 여전히 응집되어 있다면, 초음파 처리를 한 후 캘리브레이션 입자를 PBS로 희석하여 목표 농도로 맞추십시오. 나노포어 크기에 따라 최종 부피는 최소 40 µL여야 합니다. 이제 78 µL의 PBS를 주입한 후 즉시 제거하여 기기의 하단 유체 셀을 적시십시오.

이렇게 하면 나노포어 아래에 기포가 형성될 위험이 줄어듭니다. 다음으로, 나노포어를 기기의 포크 암(fork arms) 사이에 배치하십시오. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 서로 마주 보는 두 암 사이의 거리를 측정하십시오.

이 값을 소프트웨어의 stretch 필드에 입력하고, 입력이 완료되면 대향 암 사이의 거리를 조절하는 사이드 휠을 사용하여 calibrate stretch를 클릭하십시오. 나노포어를 47 millimeters까지 늘립니다. 크기에 맞게 늘어난 것이 확인되면, 하단 유체 셀에 78 microliters의 PBS를 다시 도포하십시오.

나노포어 위에 상부 유체 셀을 배치하고 쉴딩 케이지를 부착하여 교정 과정을 시작합니다. 그다음, 희석된 교정 입자 40 µL를 상부 유체 셀에 첨가합니다. 이제 최소 0.8 kPa의 양압을 가합니다.

가변 압력 모듈(VPM)을 사용하여 양의 전압을 선택하고 켜기(turn on)를 클릭하십시오. 그런 다음 차단을 분석하면서 신장(stretch)을 천천히 줄이십시오. 보정 입자에 의해 발생한 이벤트들입니다.

스트레치가 감소함에 따라 블로케이드 높이가 점진적으로 증가하며, 이에 따라 신호 대 잡음비가 개선됩니다. 전압을 높이면 블로케이드 높이가 증가할 수 있지만, RMS 노이즈 또한 더 많이 발생할 수 있습니다. 신호 트레이스 패널에서 확인한 바탕값 수준을 관찰된 블로케이드가 적절히 상회할 때 스트레치 감소를 중단하십시오.

둘째로, 입자 생성률을 관찰하십시오. 다만, 이 기준은 컷오프가 덜 엄격합니다. 입자 생성률은 이상적으로 분당 최소 100개 이상이어야 합니다.

하지만 입자 수가 분당 2000개보다 많을 경우, 시료를 희석하고 기기를 다시 교정하십시오. 이 정도로 높은 수치는 본 시연에서 부정확한 측정 결과로 이어질 수 있습니다. 이전에 정제된 뇌종양 세포주 유래 엑소좀의 특성을 분석합니다.

먼저 보정 입자를 상단 유체 셀 프레스에 로딩합니다. VPM을 켜고 압력을 가한 뒤, 여기서 최소 500개 입자의 데이터를 기록합니다. 이때 0.8 kilopascal의 압력을 가합니다.

선택적으로, 이를 위해 다중 압력 측정을 수행할 수도 있으며, 인가 압력을 높여 두 번째 캘리브레이션 파일을 기록합니다. 이때 압력 증분은 최소 0.2 kilopascals여야 합니다. 이제 상단 셀에서 샘플을 제거하고, 회당 100 microliters의 PBS로 셀을 세 번 세척하십시오. 세척 후에는 보풀 없는 종이로 상단 유체 셀을 닦아냅니다.

다음으로 실험 샘플을 추가합니다. 기저 전류는 캘리브레이션 입자를 측정했을 때 관찰된 전류의 3% 이내여야 합니다. 그렇지 않은 경우, 쉴딩 캡을 가볍게 치거나 돌리고, 플런저를 누르거나 나노포어를 완전히 제거한 후 di water로 세척하십시오.

관찰된 전류가 양호하다면, 보정 입자에 적용했던 것과 동일한 압력을 적용하십시오. 그 다음, 최소 500개의 입자를 기록하고 데이터 파일을 저장하십시오. 입자 검출이 갑자기 중단되거나, 기선 전류가 하락하거나, RMS 노이즈가 갑자기 증가하는 경우에는 기록을 일시 중지하고 나노포어의 막힘을 해소하십시오.

이전과 마찬가지로, 샘플을 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 쉴딩 캡을 가볍게 두드리거나 비틀고, 플런저를 누르거나 나노포어를 완전히 제거한 후 DI water로 세척합니다. 또 다른 전략은 나노포어 신장 길이를 최대 47 millimeters까지 늘리고, VPM의 압력을 약 5분 동안 최대화하는 것입니다.

소프트웨어에서 NPO를 해제할 수도 있습니다. 데이터 분석(analyze data) 탭으로 이동하여 처리되지 않은 파일(unprocessed files) 옵션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 파일 처리(process files) 옵션을 선택하여 데이터 처리를 시작하십시오. 그 다음, 샘플 파일과 교정 파일을 결합하려면 샘플 옆의 체크박스를 클릭하십시오.

보정된 컬럼에서 해당 파일을 선택하고 확인을 누릅니다. 소프트웨어는 크기, 분포, 베이스라인 지속 시간, 반치폭(full width at half maximum) 및 농도 분석과 같은 다양한 샘플 특성을 표시합니다.

표준 준비 방법 사용 시 과도한 막힘이 발생하는 생체 시료 등의 경우에는 다음과 같은 접근 방식을 사용합니다. 세포 배양 상층액 내의 엑소좀을 분리하기 위해, 300 Gs에서 7분 동안 최소 50 µL의 세포 배양 상층액을 원심분리합니다. 시료와 동일한 방식으로 배지만 사용한 대조군도 준비합니다. 상층액 20 µL를 새 튜브로 옮기고, PBS 20 µL와 10 million beads/mL로 희석된 335 nm 폴리스티렌 비드 스톡 10 µL를 추가합니다.

이제 이전과 동일하게 NP 200 Nanopore를 사용하여 기기를 설정하고, 배지만 포함된 비드 대조군 샘플을 측정하십시오. 우선, 정확도를 위해 작은 비-비드 입자의 배경 검출률이 비드 검출률의 10% 미만이 되도록 최소화해야 합니다. 이제 반복 측정을 기록하기 전에 각 샘플을 한 번씩 측정하십시오.

이렇게 하면 변동하는 나노포어 상태가 샘플들에 골고루 분산됩니다. 캘리브레이션 비드만 포함된 샘플을 다시 측정함으로써 최종적으로 각 샘플을 총 3회 측정해야 합니다. 이후 데이터 분석 단계에서 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 농도 계산을 수행하십시오.

계산 예시는 서면 프로토콜에 포함되어 있습니다. 초원심분리법을 통해 U 87 M-G-E-G-F-R-V three 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 정제한 후, 115 nanometer 교정 비드를 사용하여 설명된 프로토콜에 따라 측정하였습니다. 이를 통해 세포외 소포의 크기 분포를 얻었습니다.

또한 샘플에 표준 물질을 첨가하는 대체 방법을 사용하여 교모세포종 세포 배양 상청액에서 세포외 소포를 직접 정량하였습니다. 두 가지 나노입자 집단이 관찰되었습니다. 더 작은 세포외 소포와 더 큰 기지의 표준 물질을 통해, 기지의 표준 물질을 기반으로 두 집단의 크기를 추정한 결과 소포 집단의 크기가 140 nanometers보다 큰 것으로 확인되었습니다.

더 작은 나노포어 개구부를 사용하여 더 작은 세포외 소포를 검출할 수 있었겠지만, 그럴 경우 막힘 현상이 더 많이 발생했을 것입니다. 숙달된 후 이 기술은 분석하는 샘플 수에 따라 1시간에서 4시간 정도 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플에 따라 프로토콜의 격막 조정이 필요할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 더 큰 소포로 구성된 샘플의 경우 상대적으로 큰 신장률에서 더 큰 나노포어를 사용해야 할 수도 있으며, 나노포어를 막을 수 있는 세포 파편을 제거하기 위해 샘플을 여과하거나 원심분리함으로써 측정을 용이하게 할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 TRPS를 사용하여 세포외 소포의 특성을 분석하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 보유한 세포외 소포 샘플에 따라 표준 프로토콜을 적용하거나 조정된 스파이크-인(spike in) 방법을 사용할 수 있습니다.