정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

다음 실험의 전반적인 목표는 조정 가능한 저항 펄스 감지를 사용하여 세포 외 소포를 정량화하고 크기를 조정하는 것입니다. 표준 접근법은 정제된 세포외 소포체에서 얻은 현재 봉쇄 측정값을 폴리스티렌 비드 표준물질에서 얻은 측정값과 비교하는 것입니다. 세포외 소포체를 특성화하는 두 번째 방법은 폴리스티렌 비드로 샘플을 스파이크하는 것인데, 이는 정제되지 않은 세포외 소포체와 같은 복잡한 샘플로 작업할 때 사용됩니다.

세포 배양 배지에서 결과 데이터는 정제 또는 정제되지 않은 여부에 관계없이 세포외 소포의 크기와 수를 특성화합니다. 라텍스 비드에 결합된 세포외 소포체의 웨스턴 블로팅 또는 유세포 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 물리적 격리 또는 라벨링이 필요 없이 생물학적 유체에서 직접 입자를 특성화한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 세포외 소포체가 크기가 이질적이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

더 작은 소포를 검출하려고 할 때, 더 큰 소포는 nanopore를 막을지도 모릅니다. 실행 가능한 조건으로 빠르게 돌아갈 수 있도록 프로토콜에 몇 가지 실용적인 팁과 요령을 추가했습니다. 우리는 세포외 소포체의 생성을 줄이기 위해 노력했으며 세포 배양에서 소포의 농도를 정량화하는 방법이 필요했습니다. 에스넷.

나노 입자를 특성화하는 방법을 찾던 중 TRPS를 발견하고 SLES 및 세포 배양의 특성화에 더 적합하도록 프로토콜을 수정했습니다. S 상등액 및 기타 생물학적 유체 먼저 TRPS 기기를 Eye on control suite 소프트웨어가 설치된 컴퓨터에 연결합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기 간섭을 최소화해야 합니다.

이제 나노포어 크기를 선택합니다. NP 100은 70 - 200 나노미터 소포에 가장 적합한 반면, NP 150은 85 - 300 나노미터 크기의 소포에 사용할 수 있습니다. NP 200은 100-400나노미터 소포를 측정하는 데 더 적합합니다.

그런 다음 NP 100 및 NP 150에 대한 보완 폴리스티렌 보정 입자를 선택하고 NP 200에 대한 CPC 100 보정 입자를 선택합니다. CPC 200 보정 입자를 사용합니다. 30초 동안 보정 입자를 소용돌이칩니다.

여전히 응집되어 있으면 초음파 처리를 사용한 다음 PBS의 보정 입자를 목표 농도로 희석합니다. 나노포어 크기에 따라 최종 부피는 40마이크로리터 이상이어야 합니다. 이제 78 마이크로 리터의 PBS를 적용하여 기기의 하부 유체 셀을 적시고 즉시 제거하십시오.

이것은 나노포어 아래에 거품이 형성될 위험을 줄입니다. 다음으로, Nanopore를 기기의 for arm에 놓습니다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 두 반대쪽 팔 사이의 거리를 측정합니다.

이 값을 stretch라는 필드 아래의 소프트웨어에 입력하고 입력한 후 반대쪽 팔 사이의 거리를 제어하는 사이드 휠을 사용하여 calibrate stretch를 클릭합니다. 나노포어를 47mm로 늘립니다. 크기가 늘어나면 78마이크로리터의 PBS를 하부 유체 셀에 다시 적용합니다.

상부 유체 셀을 나노포어에 배치하고 차폐 케이지를 부착하여 보정 프로세스를 시작합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 희석된 보정 입자를 상부 유체 셀에 추가합니다. 이제 최소 0.8킬로파스칼의 양압을 적용합니다.

가변 압력 모듈 또는 VPM을 사용하여 양의 전압을 선택하고 켜기를 클릭합니다. 그런 다음 봉쇄를 분석하면서 스트레칭을 천천히 줄입니다. 보정 입자로 인해 발생하는 이벤트입니다.

스트레치가 감소함에 따라 차단 높이가 점차 증가하고 신호 대 잡음비가 향상됩니다. 전압을 높이면 차단 높이도 증가할 수 있지만 더 많은 RMS 노이즈가 발생할 수도 있습니다. 관측된 봉쇄가 신호 추적 패널에서 언급된 대로 배경 수준을 적절하게 초과할 때 스트레치 감소를 중지합니다.

둘째, 입자 속도를 관찰합니다. 그러나 이것은 덜 엄격한 컷오프가 있습니다. 입자 속도는 이상적으로는 분당 100 이상이어야 합니다.

그러나 입자 속도가 분당 2000보다 크면 샘플을 희석하고 기기를 재보정하십시오. 이 속도가 너무 높으면 이 데모에서 측정이 부정확해질 수 있습니다. 뇌종양 세포주에서 이전에 정제된 세포외 소포체가 특성화됩니다.

먼저 보정 입자를 상부 유체 셀 프레스에 로드합니다. 전원을 켠 다음 VPM을 사용하여 압력을 가하고 여기에 최소 500개의 데이터 입자를 기록합니다. 0.8킬로파스칼의 압력이 적용됩니다.

선택적으로, 이를 위해 다중 압력 측정을 수행하고, 적용된 압력을 증가시키고, 두 번째 교정 파일을 기록할 수도 있습니다. 압력 증가는 이제 최소 0.2킬로파스칼이어야 하며, 상단 셀에서 샘플을 제거하고 세척당 100마이크로리터의 PBS로 셀을 세 번 세척합니다. 세척 후 보푸라기가 없는 종이로 상부 유체 셀을 닦아냅니다.

다음에 실험 샘플을 추가합니다. 기준선 전류는 교정 입자를 측정할 때 관찰된 전류의 3% 이내여야 합니다. 그렇지 않은 경우 차폐 캡을 두드리거나 비틀거나 플런저를 적용하거나 나노포어를 완전히 제거하고 물로 씻어냅니다.

관찰된 전류가 양호하면 보정 입자에 적용된 것과 정확히 동일한 압력을 가합니다. 그런 다음 최소 500개의 입자를 기록하고 데이터 파일을 저장합니다. 입자 감지가 갑자기 중단되거나 기준선 전류가 떨어지거나 RMS 노이즈가 갑자기 증가하면 기록을 일시 중지하고 나노포어의 막힘을 해제해 보십시오.

이전과 마찬가지로 샘플을 위아래로 피펫팅합니다. 차폐 캡을 두드리거나 비틀거나, 플런저를 적용하거나, 나노포어를 완전히 제거하고 DI 워터로 씻어냅니다. 또 다른 전략은 나노포어 스트레치를 최대 47mm까지 늘리고 약 5분 동안 VPM의 압력을 최대화하는 것입니다.

이것은 또한 UNC가 소프트웨어에서 NPO를 분리할 수 있습니다. 데이터 분석 탭으로 이동하여 처리되지 않은 파일 옵션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 파일 처리 옵션을 선택하여 데이터 처리를 시작합니다. 그런 다음 샘플과 보정 파일을 결합하려면 샘플 옆에 있는 확인란을 클릭합니다.

calibrated 열에서 해당 파일을 선택하고 확인합니다. 선택. 이 소프트웨어는 크기, 분포, 기준선 지속 시간, 전체 너비, 절반 최대값 및 농도 분석과 같은 다양한 샘플 특성을 표시합니다.

다음 접근법은 준비 시 표준 방법을 사용하여 과도한 막힘을 유발하는 생물학적 유체와 같은 샘플에 사용되며 최소 50마이크로리터의 세포 배양을 원심분리합니다. 300 Gs.Also에서 7 분 동안 세포 외 소포를 포함하는 상등액은 샘플과 대조군 모두에 대해 동일한 방식으로 매체 단독 제어를 준비합니다. 20마이크로리터의 상등액을 새 튜브로 옮기고 20마이크로리터의 PBS와 10마이크로리터의 희석된 335나노미터 폴리스티렌 비드 스톡을 밀리리터당 1,000만 비드로 추가합니다.

이제 NP 200 Nanopore를 사용하여 이전과 같이 기기를 설정하고 매체에서 비드의 제어 샘플을 측정합니다. 첫째, 정확성을 위해 작은 비 비드 입자의 백그라운드 검출을 비드 검출의 10% 미만으로 최소화해야 합니다. 이제 복제를 기록하기 전에 각 샘플을 한 번 측정합니다.

이것은 샘플에 변동하는 나노기공 조건을 분배합니다. 각 샘플은 교정 비드 전용 샘플을 다시 측정하여 모든 마무리에서 세 번 측정해야 합니다. 나중에. 데이터를 분석하는 동안 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 농도를 계산합니다.

계산 예제가 작성된 프로토콜에 포함되어 있습니다. U 87 M-G-E-G-F-R-V 3 세포 배양물에서 초원심분리에 의해 상등액을 정제한 후 115 나노미터 검량 비드를 사용하여 설명된 프로토콜을 사용하여 측정했습니다. 세포외 소포체(extracellular vesicles)에 대한 크기 분포를 얻었다.

세포외 소포는 또한 교모세포종 세포 배양 상등액에서 직접 정량화되었으며, 표준물질로 샘플을 스파이크하는 대체 접근법을 사용했습니다. 두 개의 나노 입자 집단이 관찰되었습니다. 더 작은 세포외 소포와 더 큰 알려진 표준물질, 알려진 표준에 기초한 두 집단의 크기 추정은 소포 집단을 140나노미터 이상으로 식별했습니다.

더 작은 세포외 소포는 더 작은 nanopore 오프닝을 사용하여 검출되었을지도 모릅니다, 그러나 한 번 지배되면 더 막히는 것이 있었을 것입니다. 이 기술은 분석된 샘플의 수에 따라 1시간에서 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 샘플에서 프로토콜에 대한 중격 조정이 필요할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

예를 들면, 더 큰 소포로 이루어져 있는 표본은 상대적으로 큰 뻗기에 더 큰 nanopores의 사용법을 요구할지도 모르고, 또한 측정은 nanopore를 clock할 수 있는 세포질 파편을 제거하기 위하여 표본의 우리의 원심분리를 거르기에 의해 촉진될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 TRPS를 사용하여 세포외 소포체를 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 세포외 소포체 샘플에 따라 표준 프로토콜을 적용하거나 조정된 스파이크 분석법을 사용할 수 있습니다.