전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

본 절차의 전반적인 목표는 C two 내 미토콘드리아 단백질의 구조와 조직을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 샘플을 포함하는 동결 수화 전자현미경 그리드를 제작합니다. 그다음, 전자 저온 현미경을 사용하여 샘플의 선량 제한 틸트 시리즈를 기록합니다.

그다음 틸트 시리즈를 처리하여 토모그래피 볼륨을 생성합니다. 마지막으로, 단백질 밀도를 평균화하여 단백질의 구조를 결정하고, 막을 분할하여 3D 구조를 드러냅니다. 단백질 평균값을 다시 Tom Grahams로 재배치함으로써, 막 내 단백질의 구조와 조직을 확인할 수 있습니다.

우리는 미토콘드리아가 분자 수준에서 어떻게 작동하는지 이해하기 위해 미토콘드리아의 전자 저온 토모그래피를 수행합니다. 얇은 플라스틱 절편의 전자 현미경 관찰과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 해상도가 더 높다는 것입니다. 시료가 어떠한 방식으로도 화학적으로 고정되지 않으므로, 단백질의 분자적 세부 구조가 보존됩니다.

전자 저온단층촬영(electron crytography) 기술을 숙달하는 데는 어느 정도 시간이 걸릴 수 있으나, 숙련된 사용자는 세션당 5~6개의 고품질 TOM 기반 시료를 확보할 수 있습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 최적의 얼음 두께를 가진 동결 수화 그리드를 제작하는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아를 분리 및 펠렛화한 후, 10 millimolar HEPA 버퍼에 포함된 250 millimolar T trioses를 사용하여 펠렛을 총 단백질 농도 약 5 mg/mL가 되도록 재부유시키십시오. 제조업체의 지침에 따라 진공 장치에서 전면 탄소 EM 그리드를 탄소 면이 위로 향하게 하여 글로우 방전을 처리하십시오. 액체 질소로 냉각된 알루미늄 용기의 내측에 에탄 가스를 분사하여 몇 mL의 에탄을 액화시키십시오.

핀셋을 사용하여 글로우 방전 처리된 DM 그리드를 집어 벤치믹서 위에 놓습니다. 접합 금 표지자(gold fiducial) 현탁액과 미토콘드리아 현탁액을 1:1 비율로 혼합한 후, 즉시 이 용액 3 µL를 그리드에 도포합니다. 다음으로, 필터 페이퍼 웨지가 장착된 수제 길로틴과 같은 유리화 장치에 핀셋을 넣고 그리드에서 과잉 액체를 흡수시킨 후, 트리거를 놓아 그리드를 액체 에탄에 즉시 급속 동결시킵니다. 그런 다음 그리드를 액체 에탄에서 액체 질소로 옮깁니다.

새 필터 페이퍼 웨지(filter paper wedge)의 끝부분을 액체 에탄(ethane)에 담가 그리드에서 과잉 에탄을 제거합니다. 액체가 타고 올라올 때 그리드를 필터 페이퍼를 따라 천천히 끌어올리되, 액체 전면(liquid front) 아래에 유지한 후 즉시 액체 질소로 옮겨 추후 사용을 위해 보관합니다. 그리드를 그리드 박스에 넣고 액체 질소가 채워진 보관 용기에 보관하여 토모그래피 틸트 시리즈(tomographic tilt series)를 기록합니다.

먼저 액체 질소 도너가 가득 찼는지 확인하고, 시료 스테이지와 그리드 전송 장치의 온도가 100 kelvin 미만인지 확인하십시오. 테스트 그리드의 이미지를 획득하고 쏜 링(Thorn rings)의 품질을 확인하여 전자 현미경의 정렬 상태가 양호한지 확인하십시오. Th rings는 원형이어야 하며 이미지의 가장자리까지 확장되어야 합니다. 다음으로, 동결 수화된 미토콘드리아가 포함된 그리드를 삽입하십시오.

그 다음 탐색 모드에서 적절한 얼음 두께와 시료 품질을 갖춘 영역을 찾습니다. 데이터 수집에 적합한지 판단하기 위해 유망한 영역의 탐색 이미지를 6초 동안 촬영합니다. 적합한 시료 영역을 찾은 후, 스테이지를 ±60도로 기울여 그리드 바(grid bars)나 유사한 외관의 인접한 얼음 충전 홀에 있는 얼음 결정에 의해 노출 또는 초점 영역이 가려지지 않는 최대 기울기 범위를 결정합니다. 이후 노출 모드로 전환하여 빔 강도 또는 이미지 획득 시간을 조정합니다.

따라서 각 기록된 이미지의 전자 선량은 CCD의 경우 픽셀당 30 ~ 50 electron이거나 초당 픽셀당 6 ~ 8 electron입니다. 직접 전자 검출기의 경우, 빈 홀(empty hole)에서 0°로 획득한 1초 이미지의 평균 전자 수(average electron count)를 60° 이미지의 전자 수로 나누어 선량 분포 비율 또는 I zero/I 60를 계산하십시오. 노출 모드에서 1초 이미지를 획득하고 Å⁻²당 전자 수를 기록하십시오.

선량 분포 비율을 고려하여, 적절한 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 특정 총 전자 선량에 대해 기록할 수 있는 총 이미지 수와 기울기 간격을 계산하십시오. 방금 결정한 파라미터를 사용하여 전형적인 토모그램(tomogram)을 설정하고 기록하십시오. 이 샘플들의 경우, ±20도에서 시작하여 고각 기울기에 도달하기 전에 0도를 거치도록 하십시오.

토모그램을 생성하고 분할하려면, 틸트 시리즈를 재구성 소프트웨어에 적합한 파일 형식으로 변환하십시오. Imod와 같은 토모그램 재구성 프로그램을 사용하여 금 피듀셜 마커의 위치를 표시함으로써 이미지를 정렬하십시오. 정렬이 완료되면 토모그램을 생성하십시오.

시각화를 위해 IM o와 함께 제공되는 비선형 등방성 확산 필터와 같은 이미지 필터를 사용하여 토모그램(tomogram)의 대비를 높입니다. 상용 프로그램을 사용하여 토모그램을 수동으로 분할합니다. 내막과 외막에 해당하는 복셀(voxel)을 각각 별도의 레이어로 지정하고, 지정이 완료되면 막을 시각화하기 위한 표면을 생성합니다.

emira의 EM 패키지 플러그인에 있는 클릭커 옵션을 사용하여 TP syntase 입자의 위치를 표시하고, 표시된 입자들을 입력값으로 하여 particle estimation과 같은 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하십시오. 전자 토모그래피 프로그램을 통해 해상도 추정치를 위한 agram 평균을 계산하십시오. 무료 시각화 프로그램을 사용하여 독립적으로 결정된 두 개의 sub tommo 평균 간의 foyer shell 상관관계를 계산하십시오.

먼저 Chimera를 사용하여 알려진 X선 구조를 sub Tomogram 평균에 수동으로 맞춘 다음, 이 그림에서 보는 것과 같이 fit 명령어를 사용하여 자동으로 맞춥니다. 미토콘드리아 전자 저온 단층 촬영 이미지에서 막을 수동으로 분할하면 미토콘드리아 내 크리스테(Christi)의 구조가 드러납니다. 특정 단백질이 결핍된 효모 녹아웃 균주에서 미토콘드리아를 이미징함으로써, 이러한 단백질이 크리스테 형태에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 TP 합성 서브유닛 E가 결핍된 효모 균주의 미토콘드리아이며, 이 서브유닛은 TP 합성 이량체의 형성에 필수적입니다. 야생형 미토콘드리아의 정상적인 Lala Christi와 달리, 이 소기관들은 Christi가 없거나 작은 풍선 모양의 막 함입 구조를 포함하는 다수의 내막 구조를 가지고 있습니다. 대비가 좋은 이미지에서는 노란색 화살표로 표시된 것과 같이 TP 합성 이량체를 쉽게 확인할 수 있습니다.

막을 분할함으로써, 노란색 구체로 표시된 ATP 합성효소의 위치를 Christi의 형태와 관련하여 시각화할 수 있습니다. 이 경우, ATP 합성효소는 Lo Meer Christi의 매우 굽은 가장자리를 따라 이량체 행을 형성합니다. Subtomogram averaging을 통해 단백질 구조를 4 nm 이하의 해상도로 결정할 수 있습니다. 알려진 X선 구조를 피팅함으로써, 그림에서 보는 바와 같이 천연 환경 내 단백질 복합체의 평균 원자 모델을 조립할 수 있습니다.

본 예시에서는 개별 복합체 간의 상대적 위치와 막 내 다른 단백질 복합체와의 관계를 효율적으로 정리하기 위해 평균 볼륨을 Tomo Graham에 다시 배치할 수 있습니다. 본 프로토콜은 전자 저온 단층 촬영(electron cryo tomography)을 이용하여 미토콘드리아 내막 내 단백질 복합체의 구조와 조직을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이 프로토콜은 다양한 세포 구획 내에 존재하는 다른 막 결합 단백질의 구조와 조직을 결정하는 데에도 활용될 수 있습니다.

시료 준비는 양질의 써모그램(thermograms)을 얻기 위한 핵심 단계입니다. 동결 수화된 그리드는 70에서 150 nanometer 두께의 완벽한 유리질 얼음 영역을 포함해야 합니다. 일반적으로 최적의 얼음 두께와 시료 품질을 갖춘 영역을 찾을 때까지 5~6개의 그리드를 스크리닝합니다.

그람 수집을 위해서는 전용 저온 스테이지, 에너지 필터 및 직접 전자 검출기 카메라가 장착된 300 kV 투과 전자 현미경이 가장 적합하지만, 측면 진입 저온 스테이지와 CCD 카메라가 장착된 200 kV 기기도 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 cryo-EM 그리드를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 틸트 시리즈를 수집하고, 토모그램을 재구성하며, 서브토모그램 평균을 계산하십시오.

이 과정은 세포 내 단백질 구성이 효율적인 ATP 합성과 같은 생물학적 기능을 수행하는 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 필요한 기본 기술들을 다룹니다. 액체 질소 및 액체 에탄을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 보안경과 장갑을 착용해야 함을 잊지 마십시오.