Name: 전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 배우세요 전자 저온 단층 촬영법을 활용한 미토콘드리아 단백질 구조 및 조직 분석 방법을. ATP 합성 효소 이량체의 3차원 구조를 시각화하여 세포 에너지 대사의 분자 수준 이해를 돕습니다.

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이 작품은 막스 플랑크 협회 (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, 그리고 WK), 도이치 Forschungsgemeinschaft (WK)와 박사 EMBO 장기 자금 지원 우수 프랑크푸르트 &quot;Macromolecular의 단지&quot;의 클러스터에 의해 지원되었다 원정대 (VAMG).

차등 원심 분리하여 세포 나 조직에서 미토콘드리아의 1 준비 이 섹션에서는 다양한 진핵 생물에서 그대로 미토콘드리아의 분리에 대한 일반적인 절차를 설명합니다. 버퍼 구성 요소 및 원심 분리 속도 정확한 각 조직에 최적화 될 필요가 / 종 공부했다. <ol><li> 등장 성 완충액으로 세포를 분해 (예를 들어, 250 mM의 수 크로스, 10 mM의 HEPES pH를 7.4), 유리 비드 밀을 사용하여 (진균 균사체) 28, 효소 칸막이 벽 (사카로 미세스 세 레비 시아) 29, 볼베어링 균질의 소화 (단일 -cell 진핵 세포 / 세포를 배양 / 선충) 30 또는 믹서 (동물 또는 식물 조직) 31. </li><li> 저속 원심 분리 (2,000 XG, 4 ° C, 10 분) 다음 모슬린을 통해 여과에 의해 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 9000 XG, 4 ° C (고속 원심 분리하여 상층 액과 펠릿 미토콘드리아를 수집, 10 분). </li><li> 필요한 경우, 미토콘드리아 부분 (32)의 추가 정제 등장 밀도 단계 그라데이션을 사용합니다. </li></ol> 전자 곳을 알아내는-단층 촬영 미토콘드리아의 2 준비 다음 섹션에서는 극저온 ET에 대한 동결 수화 샘플을 구하는 방법에 대해 설명합니다. 참고 :이 방법은 피부에 심한 화상을 입을 수 있습니다 매우 차가운 액체 질소 및 에탄의 사용을 포함한다. 안전 고글과 냉동 보호 장갑을 착용해야합니다. 또한 가연성 액체 에탄, 흄 후드에서 처리해야합니다. <ol><li> 250 mM의 트레 할로 오스, 약 5 ㎎ / ㎖의 총 단백질 농도에 pH가 7.4에서 10 mM의 HEPES 버퍼에 펠렛을 재현 탁 미토콘드리아. </li><li> 글로우 방전 구멍 투성이의 탄소 EM 그리드, 제조업체의 지침에 따라 진공 장치 탄소 사이드. </li><li> 액체 질소 냉각의 내측 상 에탄 가스의 스트림을 지향함으로써 에탄의 몇 밀리미터를 액화에드 알루미늄 컨테이너입니다. </li><li> 미토콘드리아 현탁액으로 한 즉시 핀셋에서 개최 글로우 방전 EM 그리드에 3 μl를 적용 단백질 공역 금 기점 정지 1을 섞는다. </li><li> 유리화 장치, 예를 들면, 집에서 만든 단두대에 핀셋을 놓습니다. 여과지의 웨지 (~ 5 초 또는 액체 정지 확산 될 때까지) 즉시 트리거를 해제하여 액체 에탄으로 격자를 뛰어 물기를시킨다. </li><li> 액체 질소로 액체 에탄에서 그리드를 전송합니다. 전송하는 동안 필터 종이 그리드에서 초과 에탄을 제거합니다. 액체 에탄에 여과지의 쐐기 형 부분의 선단부를 배치했다. 액체 에탄 상승으로 조심스럽게 여과지까지 그리드를 끌어하지만 액체 앞에 아래에 보관하십시오. 액체 에탄은 모세관 작용에 의해 격자로부터 제거되고 모든 에탄 액체가 제거 된 후, 액체 질소로 즉시 눈금을 전송한다. </li><li> , 그리드 스토리지 상자에 유리화 그리드를 배치차 적절한 나중에 사용하기 위해 액체 질소에서 보관하십시오. </li></ol> 단층 촬영 틸트 시리즈의 3 녹화 다음 섹션은 설정 및 사후 열 에너지 필터와 CCD 카메라가 장착 Polara 전자 현미경 미토콘드리아의 단층 틸트 시리즈를 수집하는 방법을 설명합니다. 비슷한 프로토콜은 CCD 또는 직접 전자 감지기 카메라가 장착 모든 전자 크라이 현미경에 사용됩니다. <ol><li> 현미경을 맞 춥니 다 <ol><li> 테스트를 삽입 시편 예를 들면, 흑연, 구멍 투성이의 탄소 필름에 골드 섬. </li><li> 현미경의 저용량 시스템에서 선택 검색 모드. </li><li> eucentric 높이로 샘플을 가져와. 시편 홀더를 틸팅 할 때 최소한의 XY 운동의 포인트이다. , 0 ° 기울기에 관심 지점을 중앙에 20 °로 무대를 기울 Z-높이를 변경하여 포인트를 다시 중심에. 0 °로 돌아가서 측면 오프셋 (offset)이 최소화 될 때까지 반복합니다. </li><li> 선택노출 모드. 단층 화상을 수집하기 위해 원하는 배율을 선택 (예를 들어, 픽셀 크기 견본 ≈ 0.6 nm의 검출기에 25,000X). </li><li> 작은 응축기 구경 (50-70mm)를 선택하고, 상기 빔은 촬상 소자보다 단지 넓은 60 (E)의 픽셀 판독 제공되도록 스폿 크기와 빔의 강도를 선택 - / 픽셀 (CCD) 또는 (14) 전자 - / 픽셀 / 초 (직접 전자 검출기, 계산 모드). </li><li> 센터 콘덴서 구경. </li><li> 가우스 초점 예를 들어, 최소한의 대비 점을 찾을 수 있습니다. 리셋 현미경 디 포커스 읽기와 올바른 피벗 포인트 및 제조업체의 지침에 따라 회전 중심. </li><li> 단층를 기록 원하는 디 포커스에 전화를 겁니다. 참고 : 로우 디 포커스 (2-4 μm의)는 명암의 비용으로 해상도를 증가하는 반면 높은 디 포커스 (8 μm의)는 명암을 증가 시키지만 해상도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 빈 구멍이 지남에 따라 제조사의 이득을 새로운 레퍼런스를 생성 및 에너지 필터를 정렬지침. </li><li> 검색과 노출 모드를 맞 춥니 다. 노광 모드에서, 관심있는 지점을 중심으로하고 검색 모드로 전환. 선택 1,500X의 배율 (감지기 시편의 0.033 μm의 / 픽셀) 및 (증가 대비) 100 μm 인 디 포커스. 이미지 시프트 코일을 사용하여 중앙에 관심을 다시 지점을 만듭니다. </li><li> / 픽셀 (CCD) 또는 ~ 8 E - - 빔 촬상 장치보다 단지 넓은 20 E ~의 화소 판독 제공되도록 탐색 모드에서, 스폿 크기와 빔의 강도를 조정 / 픽셀 / 초 (직접 전자 검출기, ) 모드를 계산합니다. </li></ol></li><li> 좋은 표본 지역 찾기 <ol><li> 액체 질소 온도에서의 전자 현미경에 냉동 수화 미토콘드리아와 그리드를 삽입 (EM 제조업체의 지침 참조). </li><li> 탐색 모드에서, 적절한 얼음 두께 및 품질의 시험편 개 그리드 검색. 단층 수집에 대한 적합성을 결정하기 위해 유망 지역의 6 초 검색 이미지를 가져 가라. 봇시간은 내부 및 외부 미토콘드리아 막이 배율로 볼 수 있어야합니다. </li></ol></li><li> 단층 촬영 틸트 시리즈의 기록 <ol><li> 좋은 표본 영역이 발견되면 60 °가 노출 장애물없이 사용할 수있는 최대 틸트 범위를 결정하거나 그리드 막대 또는 얼음 덩어리로 영역을 초점을 ±, 무대를 기울입니다. </li><li> /의 CCD 또는 6-8 전자에 대한 픽셀 - - 유사한 모양의 근처의 얼음이 가득한 홀에서 각각의 촬영 된 이미지는 30 ~ 50 전자의 전자 량을 가지고있는 빔 강도 또는 영상 획득 시간을 노출 모드로 변경 및 조정 / 픽셀 / 계산 모드, 직접 전자 감지기를에요. </li><li> 60 ° 이미지의 그와 0 °에서 획득 한 초 이미지의 평균 전자 수를 나누어 선량 분포 비율 (I 0 / I 60)를 계산합니다. 이 비율 (노출 시간 = 1 / C 경사각이 증가함에 따라 이미지 당 일정한 수의 전자를 유지하는 데 필요한 노출 시간의 증가를 설명운영 체제 (α) N 위치 (I 0 / I 60) = 2 n)을 포함 할 수있다. 비도 얼음 두께의 좋은 지표 역할을한다. 미토콘드리아의 좋은 단층 촬영은 일반적으로 I 0 / I 60 = 2.3-2.6로 기록됩니다. </li><li> 빈 구멍을 통해, 노출 모드에서 1 초 이미지를 획득하고이 당 전자의 수를 확인합니다. 고려 선량 분포 비 복용 특정 전체 전자 선량에 대해 기록 할 수있는 이미지의 총 수를 계산한다 (예를 들면, &lt;40 전자 - 구조 결정 용 / A 2 ~ 160 전자 - 모폴로지 대 / 2). </li><li> 전체 기울기 범위를 분할함으로써 단층 컬렉션에 대한 적절한 경사 구간을 결정한다 (예를 들어, ± 60 °, 120 °) 3.3.4에서 계산 된 이미지의 전체 개수에 의해. </li></ol></li><li> 설정하고 적절한 자동 데이터 수집 소프트웨어 3를 사용하여 위의 결정 매개 변수를 사용하여 단층을 기록3, 34. 틸트 시리즈는 일반적으로 ± 20 °에서 시작하여 증가하는 전자 투여에 의해 파괴되어 낮은 기울기 이미지의 정보 내용을 극대화하기 위해 높은 경사에 도달하기 전에 공 °를 통해 이동합니다. </li></ol> (4) 작성 및 단층 촬영 볼륨의 분할 이 섹션에서는 미토콘드리아의 단층 볼륨이 기울기 시리즈와 볼륨이 일반적으로보기에 존재하는 방법에서 생성되는 방법에 대해 설명합니다. <ol><li> 해당 디렉토리에 단층 일련의 경사를 저장합니다. 이미지 스택을 생성하고 MRC 스택에 .dm3, .dm4 또는이 .tif 파일을 변환 등 dm2mrc 또는 tif2mrc (IMOD 패키지)와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 적절한 파일 형식을 변환합니다. MRC 스택은 IMOD (35) 단층 재건이 필요합니다. 기타 패키지는 다른 형식이 필요합니다. </li><li> (이미지를 정렬하고 IMOD 자습서에 설명 된 단계를 수행하여 단층을 생성 <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> IMOD 배포 비선형 이방성 확산 필터를 이용하여 단층 화상의 콘트라스트를 향상시킨다. 이 필터는 멤브레인 및 ATP 합성 효소로 막 관련된 입자에 적합합니다. </li><li> 시각화를 들어, 수동으로 세그먼트 단층 촬영, 예를 들어 아미라를 상업적으로 이용 가능한 프로그램을 사용. 내부 또는 외부 막에 해당하는 복셀을 할당하고 표면을 생성합니다. AMIRA 36 EM 패키지 플러그인에 식자 옵션을 사용하여 ATP 신타 입자의 위치를 표시한다. </li></ol> 5 Subtomogram의 ATP 합성 효소 이량 체의 평균화 및 X-레이 구조의 피팅 다음 섹션에서는 ATP 합성 효소 이량 체의 subtomogram 평균을 얻을 수있는 방법에 대해 설명합니다. <ol><li> 이러한 &#39;부위와 같은 입력 및 적절한 소프트웨어 패키지로서 표시된 입자를 사용전자 단층 촬영 &#39;프로그램에 대한 icle 평가, subtomogram 평균을 계산합니다. </li><li> 해상도 추정치를 들어, 푸리에 쉘의 상관 관계 (37)에 의해이 독립적으로 결정 subtomogram 평균을 비교합니다. </li><li> 강체 의해 subtomogram 평균적으로 가능한 독 알려진 X-선 구조는 수동 또는 피팅 프로그램 키메라 38에서와 같이 자동 순차 도킹 루틴을 사용하는 경우. </li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 미토콘드리아의 subtomogram 평균화 ET-크라이을 위해 소개하고 있지만, 본질적으로 동일한 절차가 다른 세포 구획 또는 막에 적용될 수있다. 최적의 데이터를 얻으려면, 절차를 수행하는 동안 중요한 단계는 샘플 준비, 플 런지 냉동 처리 및 데이터 수집 전략이다. 성공을 위해 매우 중요합니다 샘플 품질, 좋은 이미지 대비를위한 가장 중요하다 적당한 얼음 두께를 보장하기 위해 최적화 된 동결 프로토콜에 따라 달라집니다. 최적의 데이터 수집 전략은 악기와 샘플에 따라 달라집니다. 최적화 할 파라미터는 이미지 당 전자 용량, 틸트 방식과 디 포커스를 포함한다. 좋은 샘플 좋은 단층 화상을 취득하는 모든 추가 처리 단계를 용이하고 양호한 최종 결과를 보장한다. 곳을 알아내는-ET subtomogram 평균 원자 모델 피팅과 결합 단백질 복합체 번째로 배열하는 방법의 세부 사항을 제공합니다EIR 원시 세포 환경을 제공합니다. 기술은 호흡 쇄 supercomplexes (1.7 MDA), ATP 신타 다이머 (2 × 500 kDa의), 또는 핵 세공 착체 (~ 120 MDA) 8, 9, 17와 같은 큰 세포막 단백질 복합체의 구조를 조사하고 동등하게 적합하다. 이량 행이 분리에 필요한 단계 인 세제 추출에 의해 방해되기 때문 열로 ATP 신타 다이머의 조직은, 예컨대 X-선 결정학, NMR 또는 단일 입자 극저온-EM 등의 고해상도 방법에 의해 관측 될 수 없다 및 세포막 단백질 복합체의 정제. cristae 능선을 따라 이량 체의 행 ATP 합성 효소의 배열은 모든 종에서 미토콘드리아의 보편적 인 구성 원리이다. 전자 수송 체인의 양성자 펌핑 착체, 특히 복잡 I (NADH 탈수소 효소)는, 어느 한쪽의 행 (8)의 막 부분에 위치9. 호흡 사슬의이 조직은 미토콘드리아 생물 에너지 학에 지대한 영향을 미친다. 이량 행 의한 이량 특정 단백질 서브 유닛의 부재로 형성 할 수없는 경우도 3 (41)에 도시 된 효모 돌연변이 관찰로서, 세포는 더 이상 발생 시간 및 감소 된 세포의 적합성을 나타낸다. 미토콘드리아 질환에 대한 관심과 함께, 상세한 미토콘드리아 미세 구조와 기능에 적용되는 분자 기준의 이해는 매우 중요하다. 전자 크라이 단층은 나노 미터 규모의 막 단백질의 고해상도 방법에 의해 결정 구조 및 분포와 이들 단백질의 배열 사이의 링크를 제공한다. 이것은 크라이 ET에게 건강과 질환에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 만든다. 극저온 ET에 또한 기술 개발 및 개선 PROTEI의 위치를​​ 식별하기 위해 단백질 표지 전략을 포함거대 분자 복합체의 N 서브 유닛 또는 셀에 작은 이하 별개의 단백질의 위치 (&lt;0.5 MDA)가 있습니다. 또한, 단일 입자 분석 또는 나선형으로 재구성 subtomogram 평균화 결합 하이브리드 EM 처리 방법은, 최근 단백질 구조를 결정한 42, 8 ~ 43이다. 이러한 처리 방법은 현재 잘 얼음에서 분리 또는 나선형 어셈블리를 형성하고 현재 미토콘드리아와 같은 붐비는 셀룰러 환경에서 적용되지 않고 세포막을 cristae 아르 정제 된 단백질 제한됩니다. 데이터 수집을 위해, 새로운 컴퓨팅 및 하드웨어 도구, 자동화 된 단층 취득을 가능하게 이미지의 명암 대비가 증가하고 총 필요한 전자 투여 량을 줄이기 위해 개발되고있다. 극저온에서 ET 만 근본적인 한계는 전자선에 의해 시료에 방사선 손상이다. 이것은 매우 낮은 전자 선량 불량 신호 t 결과 단층 틸트 각 시리즈의 이미지를 촬영하는데 사용될 수 있음을 의미오 - 노이즈 궁극적으로 달성 해상도를 제한하는 비율. 년 전보다 발표 된 새로운 직접 전자 감지기는 현재 단일 입자 냉동-EM 44, 45의 분야에 혁명을 일으키고있다. 이 새로운 검출기는 낮은 전자 투여 량 높은 콘트라스트와 더 나은 해상도를 제공합니다. 전자 크라이 단층 촬영의 경우, 이것은 과도한 방사선 손상 (하나의 CCD 이미지 5 직접적인 전자 검출기 이미지를 전자 량에 상당)에 대한 우려없이 수집 할 수있는 더 작은 스텝 크기 또는 이중 축 단층 촬영과 그 기울기 시리즈를 의미한다. 이들 검출기에 의해 생성 된 데이터의 방대한 양이 극복되어야 할 것이다 데이터 처리, 저장 및 가공에 자신의 과제를 생성한다. 또한, 상 콘트라스트를 향상시키기 위해 광학 현미경에서 일상적으로 사용되는 것과 유사한 원리에서 작동 위상 판은, 현재 투과형 전자 현미경 (46), (4)를 위해 개발되고있다7. 이것은 단층 촬영 포커스에 가까운 수거하고 따라서 더 높은 해상도로, 동시에 낮은 해상도를 유지하면서 것은 배향 단층과 볼륨의 해석에 필요한 기능을 할 수 있도록한다. 함께 찍은, 이러한 기술 발전이 크게 크라이 ET에 의해 해결 될 수있다 생물 질문의 범위를 확장됩니다.

미토콘드리아는 세포의 전원 주택. 화학 결합 에너지로 미토콘드리아 내막에 걸쳐 전기 양성자 구배를 변환함으로써, 미토콘드리아 ATP 합성 효소는 세포 프로세스를 구동하는 ATP의 대부분을 생산하고 있습니다. 미토콘드리아 에너지 변환 뒤에 메커니즘을 이해하기 위해, 우리는 시츄 ATP 합성 효소의 구조를 결정하고, 그 배치 및 미토콘드리아 내막에 분포되는 방법을 알 필요가있다. 전체 복합체 (4)의 미토콘드리아 ATP 합성 효소 성분 1-3 및 저해상도 맵 대부분의 고해상도 구조를 사용할 수 있지만, 막에 작용 효소의 구조와 형태를 설정하는 것이 중요하다. 미토콘드리아 내막에서 ​​ATP 합성 효소의 분포는 광범위하게 랜덤 인 것으로 가정하지만, 6이 톤되지 않은 것으로 나타났다 (5) 및 자체의 초기 결과를 발견 한 초기그는 케이스. 전자 수송 체인의 프로톤 펌프 양쪽에 위치하도록 표시하는 동안 후속 우리 그룹에서의 연구와 다른 7 ATP 합성 효소는 미토콘드리아 내막의 cristae 8 밀접 만곡 능선을 따라 이량 체의 긴 행으로 배열되어 있음을 확인했다 행 9. 이 배열은 미토콘드리아의 에너지 전환의 메커니즘에 대한 중요한 의미를 가지고있다. 우리는이 배열을 결정하는 데 사용한 기술은 전자 크라이 단층 촬영 (크라이 동부 표준시)입니다. 곳을 알아내는-ET는 현재 분자 해상도에서 세포, 세포 구획 또는 세포 내 소기관의 정확한 3 차원 (3D) 볼륨을 제공하는 유일한 방법입니다. 막이 좋은 대조와 함께 표시 및 3D 단층 촬영 볼륨에 손쉽게 추적 할 수 있기 때문에 곳을 알아내는-ET는 생체막 큰 단지를 공부에 특히 적합하다. 다른 방법은 세포 또는 organell의 3 차원 구조를 연구하기 위해ES는 분자 세부 사항을 제공하지 않습니다. 수퍼 - 해상도 광 현미경 (10), (11)는 위치 나 내지 수십 정밀도 관심 단백질에 부착 된 발광 라벨 사이의 거리를 드러내는에서 최상의이지만, 심지어 낮은 해상도, 단백질 자체의 구조를 공개하지 않는다 . 플라스틱 내장 된 생물학적 시료의 전자 현미경 (13)를 스캔하여 시리얼 섹션 12 블록 얼굴 영상의 투과 전자 현미경은 세포 볼륨의 저해상도 뷰를 제공하지만 이와 같이 분자 세부 사항을 공개하지 않습니다. 원자력 현미경 (14)는 원칙적으로, 분자 또는 원자 분해능을 제공하지만, 유일한 원자 적으로 평평한, 고체 지지체 상에 물체의 표면에있다. 마지막으로, X-선 단층 촬영 (15) 또는 자유 전자 레이저로부터의 강한 X 선 펄스의 산란은 16 m 등의 전체 세포 또는 세포 내 소기관으로 크고 복잡한 오브젝트의 비 주기적 구조를 공개하지 않을 것이다가까운 미래에 olecular 해상도입니다. 따라서 현재 나노 미터 해상도로 세포 나 세포 소기관의 3D 구조의 연구에-ET를 알아내는 할 대안이 없다. 극저온 ET는 핵공 복합체 17 인플루엔자 스파이크 18 복합체를 포함한 막 - 관련 단백질 어셈블리의 구조 및 형태를 조사하기위한 선택의 방법 및 편모 모터 단백질 (22), (23)뿐만 아니라 전체의 균체 19의 조직이다 세포 20-23에 이러한 HIV와 같은 병원성 바이러스 및 항목. 곳을 알아내는-ET는 액틴 필라멘트 (24) 또는 axonemes (25)를 포함하여 사상 단백질과 세포의 상호 작용을 시각화 헤아릴 수 없다. 해상도는 반복, 일반 기능의 서브 볼륨이 단일 입자 이미지 프로에 의해 단층 볼륨에서 잘라 평균을함으로써 subtomogram는, 26의 평균을 2 나노 미터 또는 그 이상으로 향상 될 수있다프로세싱 기술. 극저온 ET는 투과형 전자 현미경 (TEM)에 다른 경사 각도에서 찍은 얇은 시험편 (&lt;250 ㎚)의 투영 이미지의 시리즈의 획득을 포함한다. 물질과 강하게 상호 작용하는 전자, 한 번만 더 흩어져되지 않도록 표본은 얇은해야합니다. 다중 산란 해석 결과 이​​미지가 어렵와 대비를 줄일 수 있습니다. 시험편 선택된 영역의 이미지는 각각 서로에 대해 정렬 및 시험편의 3D 볼륨을 생성하는 적절한 컴퓨터 프로그램에 의해 3 차원 공간에 투영한다. 이미지의 배향은 동결에 앞서 샘플과 혼합 금 기준 마커에 의해 도움을 받는다. 이상적으로는 10 개 이상의 균일하게 분포 된 기준 마커는 좋은 정렬하기 위해 각 이미지에 존재해야한다. 분자 세부 사항을 준수하기 위해, 샘플 플 런지 냉동 그 나라의 수화 상태를 유지 액체 에탄,에 있습니다. 액체 동결에탄이 너무 빨리 (5 ~ 10 ° C / 초) 물이 결정화하지만, 유리화, 유리 같은 상태로 유지되지 않습니다 27. 얼음 결정 형성 손해에게 중요한 생물학적 구조. 생물학적 시료는 방사선 손상으로 고통 같이, 시험편 견딜 수 산란 이벤트의 총 수에 한계가있다. 이미지 따라서 저용량 모드에서 획득됩니다 관심의 영역은 한 전자 아래의 전자 량 낮은 배율 (1,500X)에서 확인됩니다 - / 나노 미터 (검색 모드). 화상이어서 관심 (포커스 모드)의 면적 떨어져 높은 배율로 집중된다. 화상이 획득되는 경우에만, 관심 영역은 높은 전자 선량 (노광 모드)로 조사된다. 여기서는 예로서 미토콘드리아 내막에서 ATP 합성 효소를 사용하여 이량 체, 수집 및 처리 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 개요를 제시한다. 다음 프로토콜은 크라이 ET에 대한 미토콘드리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다, 어떻게 설정하는및 특정 전체 전자 선량 방법 및 관심 영역의 3D 용적을 구하는 일련의 경사를 함께 처리하는 일련의 경사를 수집. 절차의 개요가도 1에 도시되어있다.

<table><tbody><tr><td>설탕</td><td>로스</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>트레할로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>자이몰라제</td><td>바이오몰</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 매체</td><td>시그마-알드리치</td><td>D1556 또는 P1644</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A 금</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>에탄</td><td>에어 리퀴드</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>질소</td><td>에어 리퀴드</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumables</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>Non-magnetic, pattern #5</td></tr><tr><td>EM combined test grid</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>구멍이 뚫린 탄소 필름의 그라파이트 및 골드 아일랜드</td></tr><tr><td>Holey 탄소 그리드</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH 또는 C-flat</td><td></td><td>R2/2 300 Cu 메쉬</td></tr><tr><td>극저온 그리드 박스</td><td>Plano GmbH</td><td>160-42</td><td>대체 홈메이드 금속 상자</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>8011S</td><td></td></tr><tr><td>유리 비드 밀 - 비드 비터</td><td>BioSpec 제품</td><td>1107900-105</td><td>0.5mm 비드 포함</td></tr><tr><td>볼 베어링(Balch) 균질화기</td><td>isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>글로우 방전 장치</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>그리드 유리화 장치</td><td>FEI, Gatan 또는 Leica</td><td></td><td>대체 수제 플런저</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI 또는 Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>직접 전자 검출기</td><td>Gatan</td><td>K2 summit</td><td>4k x 4k 픽셀, 카운트 모드</td></tr><tr><td>전하 결합 장치(CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k 픽셀(직접 전자 검출기의 대안</td></tr><tr><td>)에너지 필터</td><td>Gatan 또는 Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Image acquisition software</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tomogram acquisition software</td><td>Gatan, FEI, USCF 또는 UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternative</td></tr><tr><td>Tomogram processing software</td><td>FEI, UCSF 또는 UC-Boulder</td><td></td><td>3 alternative</td></tr><tr><td>서브 토모 그램 평균 소프트웨어</td><td>UC-Boulder 또는 University of Basel</td><td></td><td>2 대안</td></tr><tr><td>토모 그램 시각화 소프트웨어</td><td>UC-Boulder, FEI 또는 University of Utah</td><td></td><td>3 대안</td></tr><tr><td>시각화 소프트웨어 플러그인</td><td>Goethe university</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>구조 시각화 소프트웨어</td><td>UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>수치 계산 소프트웨어</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 atp 합성 효소 이량 체의 시각화

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

전자 크라이 단층 촬영 분자 세부에서 세포 소기관, 막 소포, 또는 바이러스와 같은 생물학적 샘플의 입체 구조를 시각화 할 수있는 구조 생물학에 강력한 도구이다. 이를 위해 수성 샘플은 빠르게 확대에 네이티브, 냉동 수화 상태를 유지 액체 에탄에서 유리화된다. 전자 현미경에서, 틸트 시리즈는 3D 단층 촬영이 재구성되는 액체 질소 온도에서 기록된다. 단층 볼륨의 신호 대 잡음비는 본질적으로 낮다. 인식 할 수있는, 반복 기능은 개별 서브 볼륨은 잘라 정렬 및 소음을​​ 줄이기 위해 평균을하는 subtomogram 평균화에 의해 강화된다. 이러한 방식으로, 3D를 얻을 수 나노 미터 또는 그 이상의 해상도로 매핑한다. 3D 볼륨 이용할 고해상도 구조 착용감은 그 나라의 환경에서 단백질 복합체의 원자 모델을 생성한다. 여기에서 우리는 우리가 전자 크라이 tomograp를 사용하는 방법을 보여줍니다숨바꼭질은 미토콘드리아에서 큰 막 단백질 복합체의 현장에서 조직을 연구한다. 우리는 단지 I 임의로 행 양쪽 멤브레인 영역에 분포되어있는 반면 ATP 합성 효소는, 막 내부의 높은 cristae 곡선을 따라 정점 다이머의 행이 구성되는 것을 알. subtomogram 평균으로 우리는 cristae 막 내 미토콘드리아 ATP 합성 효소 이량 체의 구조를 획득했습니다.

미토콘드리아의 전자 크라이 단층 촬영 명확하게 (그림 2) 세포 기관의 3 차원 형태를 알 수있다. 단층 막의 부피 수동 세분화 미토콘드리아에 cristae의 구조를 도시한다. 특정 단백질 성분이없는 다른 효모 녹아웃 균주로부터 미토콘드리아 촬상함으로써 cristae 형태에서 이들 단백질의 효과를 평가하여있다. 3는 ATP 합성 효소 서브 유닛 전자 결여 효모 균주로부터 미토콘드리아를 보여준다. ATP 합성 효소 복합체의이 구성 요소는 미토콘드리아 ATP 합성 효소의 이합체가 필요합니다. 이 균주에서 미토콘드리아 (그림 2) 야생형 미토콘드리아의 정상적인 층상 cristae 부족 대신 내막 구획의 번호가 포함되어 있습니다. 이러한 구획 cristae 중 하나없는 또는 작은 풍선 모양의 막 함입 (그림 3)이 포함되어 있습니다. 톰에서프로그램 RL FR RR FL이 경우 ATP 합성 효소 이량 체에서 좋은 대조, 큰 미토콘드리아 단백질 복합체로, 쉽게 볼 수 있습니다 (그림 4, 영화 1). (; 동영상이도 5) 착물의 구조는 subtomogram 평균화함으로써 2-3 nm의 해상도에서 결정될 수있다. (; 영화 3도 6) 평균 볼륨은 막에서 서로에 대해 그리고 다른 단백질 복합체 개별 복합체의 구성을 평가하기 위해 단층 화상에 다시 배치 될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> 전자 극저온 단층 촬영의 단계를 보여주는 1 플로우 차트를 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 야생형 S. cerevisiae의에서 미토콘드리아의 그림 2 형태론. 야생형 S.의 단층 볼륨을 통해 중앙 슬라이스 cerevisiae의 미토콘드리아 (왼쪽)과 대응하는 표면 렌더링 볼륨 (오른쪽). 외막의 분할 된 볼륨은 회색으로 표시 및 내부 경계의 볼륨과 하늘색으로 막을 cristae됩니다. 데이비스 외 8에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> S에서 3 미토콘드리아 그림. cerevisiae의 변형에 필요한 소단위 부족ATP 합성 효소 이합체. 단층 볼륨 (왼쪽)와 S에서 미토콘드리아의 표면 렌더링 볼륨 (오른쪽)를 동반를 통해 조각. ATP 합성 효소 이합체에 필요한 단백질 서브 유닛 전자 부족한 cerevisiae의 부담을. 도 2와 비교하면, 변이주로부터 미토콘드리아는 야생형 미토콘드리아의 정상적인 라멜라 cristae 없다. 대신, 미토콘드리아없이 cristae 또는 풍선 모양의 cristae 중 많은 내막 함이 있습니다. 따라서 전자 극저온 단층 촬영 유전자 삭제로 인해 막 형태의 변화를 강조한다. 데이비스 외 8에서 적응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figur곰팡이 P.의 전자 4 미토콘드리아 anserina. 사상균 P.에서 미토콘드리아의 단층 볼륨 (왼쪽)과 (오른쪽) 첨부 표면 렌더링 볼륨을 통해 썰어 anserina. 이 단층에서, 10 nm의 입자 (노란색 화살촉)의 열이 내부 멤브레인 cristae 매우 굽은 막 리지 위에 위치 (동영상 1 참조). 이 입자는 subtomogram 평균에 의해 ATP 합성 효소의 이합체로 확인되었다. 데이비스 외 9.에서 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> 미토콘드리아 ATP 합성 효소도 5의 구조 및 조직. 측 S.로부터 ATP 신타 이량의 전자 밀도를 나타내는 평면도 C<html> erevisiae 장착 원자 모델 (왼쪽)와 subtomogram 평균에 의해 결정으로. 열 (오른쪽)에서 ATP 신타 다이머의 조직을 도시 미토콘드리아 내막 소포. 그림 중에 계산 된 평균 좌표를 이용하여, 막 소포의 볼륨으로 분할 된 ATP 합성 효소의 이량 subtomogram 평균 위치에 의해 생성되었다. 데이비스 외 8에서 적응. 원자 모델 : F 1 / 로터 링 [PDB : 2WPD] 39 (파란색과 보라색); 단백질 성 부여 OSCP oligomycin [PDB : 2BO5] 40 (녹색); 주변 스토킹 단편 [PDB : 2CLY]에서 N-말단 잔기 일 [PDB : 2WSS]이 (노랑, 빨강) (동영상 2 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; P.에서 그림 6 고립 crista 소포 anserina 미토콘드리아. 조각 P.에서 crista 소포의 단층 볼륨 (왼쪽)과 (오른쪽) 첨부 표면 렌더링 볼륨에서 anserina. 막에서 튀어 나온 단백질 밀도를 명확하게 볼 수 있습니다. subtomogram 평균에 의해 확인 된 노란 화살촉으로 표시 밀도, ATP 합성 효소 이량 체입니다. 녹색 화살촉 NADH 탈수소 효소로 항체 라벨에 의해 식별 밀도를 가리 (1 복잡 한 세부 사항은 9 참조를 위해). 단백질 농도의 분할 (참고 행 양쪽 멤브레인 영역에서 고도로 만곡 cristae 능선을 따라 행을 형성하는 (빨간색과 노란색) ATP 신타 다이머 및 NADH 탈수소 효소 복합체 (녹색)로, cristae의 조직을 보여준다 영화 3). 데이비스 등 구에서.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. P.의 영화 1 전자 크라이 단층 촬영 anserina 미토콘드리아는. 영화는 사상균 P.에서 미토콘드리아의 촬영 단층 볼륨을 통해 연속적인 조각을 보여줍니다 anserina. ATP 합성 효소의 행 노란색 화살촉으로 표시됩니다. 표면 렌더링 분할 볼륨 cristae 3 차원 구조에 관련된 ATP 신타 제 (노란색 분야)의 위치를​​ 나타낸다. 외부 막, 회색; 내측 경계 막, 투명 블루; 막 불투명 파란색 cristae. 데이비스 등 구에서. 또한 그림 4를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> S에서 미토콘드리아 ATP 합성 효소 이량 체의 영화 2 Subtomogram 평균. 장착 원자 모델로 미세스 세 레비 시아. 평균이었다121 서브 볼륨 계산. 밀도는 세 윤곽 수준에 표시됩니다 : 1 초이 - 메시, 2 초 - 밝은 회색 -3 - 어두운 회색. 원자 모델은 키메라에서 순차 착용감 루틴을 사용하여 밀도에 끼워졌다. 원자 모델 : F 1 / 로터 링 [PDB : 2WPD] 39 (파란색과 보라색); 단백질 성 부여 OSCP oligomycin [PDB : 2BO5] 40 (녹색); 주변 스토킹 단편 [PDB : 2CLY]에서 N-말단 잔기 일 [PDB : 2WSS]. 2 (노랑, 빨강) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 데이비스 외 8에서 적응. 또한 그림 5를 참조하십시오. P.에서 영화 3 절연 cristae 소포 anserina 미토콘드리아. 연속 슬라이스 단층 촬영을 통해 볼륨이 분할 된 표면 렌더링 볼륨 다음에 표시됩니다. membran에서 튀어 나온 단백질 밀도전자 명확하게 볼 수 있습니다. 빨간색과 노란색 밀도는 ATP 합성 효소 이량 체입니다. 그린 밀도 항체 표지에 의해 결정되는 NADH 탈수소 효소 (복합체 I)을한다. 데이비스 등 구에서. 또한 그림 6을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

본 절차의 전반적인 목표는 C two 내 미토콘드리아 단백질의 구조와 조직을 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 샘플을 포함하는 동결 수화 전자현미경 그리드를 제작합니다. 그다음, 전자 저온 현미경을 사용하여 샘플의 선량 제한 틸트 시리즈를 기록합니다.그다음 틸트 시리즈를 처리하여 토모그래피 볼륨을 생성합니다. 마지막으로, 단백질 밀도를 평균화하여 단백질의 구조를 결정하고, 막을 분할하여 3D 구조를 드러냅니다. 단백질 평균값을 다시 Tom Grahams로 재배치함으로써, 막 내 단백질의 구조와 조직을 확인할 수 있습니다.우리는 미토콘드리아가 분자 수준에서 어떻게 작동하는지 이해하기 위해 미토콘드리아의 전자 저온 토모그래피를 수행합니다. 얇은 플라스틱 절편의 전자 현미경 관찰과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 해상도가 더 높다는 것입니다. 시료가 어떠한 방식으로도 화학적으로 고정되지 않으므로, 단백질의 분자적 세부 구조가 보존됩니다.전자 저온단층촬영(electron crytography) 기술을 숙달하는 데는 어느 정도 시간이 걸릴 수 있으나, 숙련된 사용자는 세션당 5~6개의 고품질 TOM 기반 시료를 확보할 수 있습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 최적의 얼음 두께를 가진 동결 수화 그리드를 제작하는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아를 분리 및 펠렛화한 후, 10 millimolar HEPA 버퍼에 포함된 250 millimolar T trioses를 사용하여 펠렛을 총 단백질 농도 약 5 mg/mL가 되도록 재부유시키십시오. 제조업체의 지침에 따라 진공 장치에서 전면 탄소 EM 그리드를 탄소 면이 위로 향하게 하여 글로우 방전을 처리하십시오. 액체 질소로 냉각된 알루미늄 용기의 내측에 에탄 가스를 분사하여 몇 mL의 에탄을 액화시키십시오.핀셋을 사용하여 글로우 방전 처리된 DM 그리드를 집어 벤치믹서 위에 놓습니다. 접합 금 표지자(gold fiducial) 현탁액과 미토콘드리아 현탁액을 1:1 비율로 혼합한 후, 즉시 이 용액 3 µL를 그리드에 도포합니다. 다음으로, 필터 페이퍼 웨지가 장착된 수제 길로틴과 같은 유리화 장치에 핀셋을 넣고 그리드에서 과잉 액체를 흡수시킨 후, 트리거를 놓아 그리드를 액체 에탄에 즉시 급속 동결시킵니다. 그런 다음 그리드를 액체 에탄에서 액체 질소로 옮깁니다.새 필터 페이퍼 웨지(filter paper wedge)의 끝부분을 액체 에탄(ethane)에 담가 그리드에서 과잉 에탄을 제거합니다. 액체가 타고 올라올 때 그리드를 필터 페이퍼를 따라 천천히 끌어올리되, 액체 전면(liquid front) 아래에 유지한 후 즉시 액체 질소로 옮겨 추후 사용을 위해 보관합니다. 그리드를 그리드 박스에 넣고 액체 질소가 채워진 보관 용기에 보관하여 토모그래피 틸트 시리즈(tomographic tilt series)를 기록합니다.먼저 액체 질소 도너가 가득 찼는지 확인하고, 시료 스테이지와 그리드 전송 장치의 온도가 100 kelvin 미만인지 확인하십시오. 테스트 그리드의 이미지를 획득하고 쏜 링(Thorn rings)의 품질을 확인하여 전자 현미경의 정렬 상태가 양호한지 확인하십시오. Th rings는 원형이어야 하며 이미지의 가장자리까지 확장되어야 합니다. 다음으로, 동결 수화된 미토콘드리아가 포함된 그리드를 삽입하십시오.그 다음 탐색 모드에서 적절한 얼음 두께와 시료 품질을 갖춘 영역을 찾습니다. 데이터 수집에 적합한지 판단하기 위해 유망한 영역의 탐색 이미지를 6초 동안 촬영합니다. 적합한 시료 영역을 찾은 후, 스테이지를 ±60도로 기울여 그리드 바(grid bars)나 유사한 외관의 인접한 얼음 충전 홀에 있는 얼음 결정에 의해 노출 또는 초점 영역이 가려지지 않는 최대 기울기 범위를 결정합니다. 이후 노출 모드로 전환하여 빔 강도 또는 이미지 획득 시간을 조정합니다.따라서 각 기록된 이미지의 전자 선량은 CCD의 경우 픽셀당 30 ~ 50 electron이거나 초당 픽셀당 6 ~ 8 electron입니다. 직접 전자 검출기의 경우, 빈 홀(empty hole)에서 0°로 획득한 1초 이미지의 평균 전자 수(average electron count)를 60° 이미지의 전자 수로 나누어 선량 분포 비율 또는 I zero/I 60를 계산하십시오. 노출 모드에서 1초 이미지를 획득하고 Å⁻²당 전자 수를 기록하십시오.선량 분포 비율을 고려하여, 적절한 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 특정 총 전자 선량에 대해 기록할 수 있는 총 이미지 수와 기울기 간격을 계산하십시오. 방금 결정한 파라미터를 사용하여 전형적인 토모그램(tomogram)을 설정하고 기록하십시오. 이 샘플들의 경우, ±20도에서 시작하여 고각 기울기에 도달하기 전에 0도를 거치도록 하십시오.토모그램을 생성하고 분할하려면, 틸트 시리즈를 재구성 소프트웨어에 적합한 파일 형식으로 변환하십시오. Imod와 같은 토모그램 재구성 프로그램을 사용하여 금 피듀셜 마커의 위치를 표시함으로써 이미지를 정렬하십시오. 정렬이 완료되면 토모그램을 생성하십시오.시각화를 위해 IM o와 함께 제공되는 비선형 등방성 확산 필터와 같은 이미지 필터를 사용하여 토모그램(tomogram)의 대비를 높입니다. 상용 프로그램을 사용하여 토모그램을 수동으로 분할합니다. 내막과 외막에 해당하는 복셀(voxel)을 각각 별도의 레이어로 지정하고, 지정이 완료되면 막을 시각화하기 위한 표면을 생성합니다.emira의 EM 패키지 플러그인에 있는 클릭커 옵션을 사용하여 TP syntase 입자의 위치를 표시하고, 표시된 입자들을 입력값으로 하여 particle estimation과 같은 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하십시오. 전자 토모그래피 프로그램을 통해 해상도 추정치를 위한 agram 평균을 계산하십시오. 무료 시각화 프로그램을 사용하여 독립적으로 결정된 두 개의 sub tommo 평균 간의 foyer shell 상관관계를 계산하십시오.먼저 Chimera를 사용하여 알려진 X선 구조를 sub Tomogram 평균에 수동으로 맞춘 다음, 이 그림에서 보는 것과 같이 fit 명령어를 사용하여 자동으로 맞춥니다. 미토콘드리아 전자 저온 단층 촬영 이미지에서 막을 수동으로 분할하면 미토콘드리아 내 크리스테(Christi)의 구조가 드러납니다. 특정 단백질이 결핍된 효모 녹아웃 균주에서 미토콘드리아를 이미징함으로써, 이러한 단백질이 크리스테 형태에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.여기에 표시된 것은 TP 합성 서브유닛 E가 결핍된 효모 균주의 미토콘드리아이며, 이 서브유닛은 TP 합성 이량체의 형성에 필수적입니다. 야생형 미토콘드리아의 정상적인 Lala Christi와 달리, 이 소기관들은 Christi가 없거나 작은 풍선 모양의 막 함입 구조를 포함하는 다수의 내막 구조를 가지고 있습니다. 대비가 좋은 이미지에서는 노란색 화살표로 표시된 것과 같이 TP 합성 이량체를 쉽게 확인할 수 있습니다.막을 분할함으로써, 노란색 구체로 표시된 ATP 합성효소의 위치를 Christi의 형태와 관련하여 시각화할 수 있습니다. 이 경우, ATP 합성효소는 Lo Meer Christi의 매우 굽은 가장자리를 따라 이량체 행을 형성합니다. Subtomogram averaging을 통해 단백질 구조를 4 nm 이하의 해상도로 결정할 수 있습니다. 알려진 X선 구조를 피팅함으로써, 그림에서 보는 바와 같이 천연 환경 내 단백질 복합체의 평균 원자 모델을 조립할 수 있습니다.본 예시에서는 개별 복합체 간의 상대적 위치와 막 내 다른 단백질 복합체와의 관계를 효율적으로 정리하기 위해 평균 볼륨을 Tomo Graham에 다시 배치할 수 있습니다. 본 프로토콜은 전자 저온 단층 촬영(electron cryo tomography)을 이용하여 미토콘드리아 내막 내 단백질 복합체의 구조와 조직을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이 프로토콜은 다양한 세포 구획 내에 존재하는 다른 막 결합 단백질의 구조와 조직을 결정하는 데에도 활용될 수 있습니다.시료 준비는 양질의 써모그램(thermograms)을 얻기 위한 핵심 단계입니다. 동결 수화된 그리드는 70에서 150 nanometer 두께의 완벽한 유리질 얼음 영역을 포함해야 합니다. 일반적으로 최적의 얼음 두께와 시료 품질을 갖춘 영역을 찾을 때까지 5~6개의 그리드를 스크리닝합니다.그람 수집을 위해서는 전용 저온 스테이지, 에너지 필터 및 직접 전자 검출기 카메라가 장착된 300 kV 투과 전자 현미경이 가장 적합하지만, 측면 진입 저온 스테이지와 CCD 카메라가 장착된 200 kV 기기도 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 cryo-EM 그리드를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 틸트 시리즈를 수집하고, 토모그램을 재구성하며, 서브토모그램 평균을 계산하십시오.이 과정은 세포 내 단백질 구성이 효율적인 ATP 합성과 같은 생물학적 기능을 수행하는 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 필요한 기본 기술들을 다룹니다. 액체 질소 및 액체 에탄을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 보안경과 장갑을 착용해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

초저온 전자 단층촬영(cryo-ET)을 사용하면 나노미터 분해능에서 세포 초미세 구조를 3D로 시각화할 수 있지만 수동 분할은 여전히 시간이 많이 걸리고 복잡합니다. 우리는 cryo-ET 단층촬영을 위한 고급 가상 현실 소프트웨어를 통합한 새로운 워크플로우를 제시하고, 포유류 세포의 미토콘드리아를 분할하여 그 효과를 보여줍니다.

초저온 전자 단층촬영(cryo-electron tomography) 데이터의 몰입형 세분화 및 분석을 위한 가상 현실 활용

배우세요 전자 저온 단층 촬영법을 활용한 미토콘드리아 단백질 구조 및 조직 분석 방법을. ATP 합성 효소 이량체의 3차원 구조를 시각화하여 세포 에너지 대사의 분자 수준 이해를 돕습니다.

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