전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 C 2에서 미토콘드리아 단백질의 구조와 조직을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 샘플을 포함하는 동결 수화 전자 현미경 그리드를 생성하여 수행됩니다. 다음으로, 샘플의 용량 제한 틸트 시리즈를 전자 극저온 현미경에 기록합니다.

그런 다음 틸트 시리즈를 처리하여 단층 촬영 볼륨을 생성합니다. 마지막으로, 단백질의 구조를 결정하기 위해 단백질 밀도의 평균을 구하고 멤브레인을 분할하여 3D 구조를 나타냅니다. 단백질의 평균을 톰 그레이엄(Tom Grahams)으로 다시 재배치함으로써, 막에 있는 단백질의 구조와 조직이 밝혀진다.

그래서 우리는 미토콘드리아의 전자 cry 단층 촬영을 하는데, 그 이유는 미토콘드리아가 분자 수준에서 어떻게 작용하는지 이해하고 싶기 때문입니다. 얇은 플라스틱 절편의 전자 현미경과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 해상도가 더 높다는 것입니다. 물질은 어떤 식으로든 화학적으로 고정되지 않으며 단백질의 분자 세부 사항이 보존됩니다.

전자 crytography 기술은 마스터하는 데 시간이 걸릴 수 있지만 숙련된 사용자는 세션당 5-6개의 양질의 TOM 접지를 얻을 수 있습니다. 절차의 가장 어려운 부분은 최적의 얼음 두께의 동결된 수화 그리드를 생성하는 것입니다.미토콘드리아를 분리하고 펠릿화한 후 텍스트 프로토콜에 따라 10밀리몰 HEPA 버퍼에 250밀리몰 T 트리오스를 사용하여 펠릿을 총 단백질 글로우 방전 밀리리터당 약 5밀리그램의 농도로 다시 현탁시킵니다. Wallly carbon EM grids 탄소 면이 위로 향하게 합니다., 제조업체의 지침에 따라 진공 장치에서 에탄 가스 흐름을 액체 질소 냉각 알루미늄 용기의 내부로 유도하여 몇 밀리리터의 에탄을 액화합니다.

핀셋을 사용하여 글로우 방전 DM 그리드를 선택하고 벤치 믹스 단백질, 공액 금 기준 현탁액, 미토콘드리아 현탁액과 일대일로 놓고 즉시 3마이크로리터의 용액을 그리드에 적용합니다. 다음으로, 핀셋을 집에서 만든 단두대와 같은 유리화 장치에 넣고 여과지 쐐기로 그리드에서 과도한 액체를 닦아내고 방아쇠를 놓아 그리드를 즉시 액체 에탄으로 떨어뜨립니다. 그런 다음 그리드를 액체 에탄에서 액체 질소로 옮깁니다.

새 여과지 쐐기의 끝을 액체 에탄에 넣어 그리드에서 초과 에탄을 제거합니다. 액체가 상승하면 그리드를 여과지 위로 부드럽게 드래그하여 액체 전면 아래에 유지한 다음 즉시 액체 질소로 옮겨 나중에 사용하기 위해 저장합니다. 그리드를 그리드 상자에 넣고 액체 질소로 채워진 doer에 보관하여 단층 촬영 틸트 시리즈를 기록합니다.

먼저 액체 질소 작업자가 가득 찼는지 확인하고 시료 스테이지 및 그리드 이송 장치의 온도가 100켈빈 미만인지 확인합니다. 테스트 그리드의 이미지를 획득하고 가시 고리의 품질을 확인하여 전자 현미경이 잘 정렬되었는지 확인합니다. Ttho 고리는 둥글고 이미지의 가장자리까지 확장되어야 합니다. 다음으로, 얼어붙은 수화 미토콘드리아가 있는 그리드를 삽입합니다.

그런 다음 검색 모드에서 적절한 얼음 두께와 표본 품질의 영역을 검색합니다. 데이터 수집에 대한 적합성을 결정하기 위해 유망 지역에 대한 6초 검색 이미지를 촬영합니다. 좋은 표본 영역을 찾은 후 스테이지를 플러스 또는 마이너스 60도 기울여 유사한 모양의 가까운 얼음으로 채워진 구멍의 그리드 막대 또는 얼음 결정에 의해 노출 또는 초점 영역을 방해하지 않고 사용할 수 있는 최대 틸트 범위를 결정하고 노출 모드로 변경하고 빔 강도 또는 이미지 획득 시간을 조정합니다.

따라서 기록된 각 이미지는 CCD의 경우 픽셀당 30-50전자, 초당 픽셀당 6-8전자의 전자 선량을 갖습니다. 직접 전자 검출기의 경우, 0도에서 획득한 1초 이미지에 대한 평균 전자 수를 빈 구멍에 대한 60도 이미지의 전자 수로 나누어 I 60에 대한 선량 분포 비율 또는 I 0을 계산합니다. 노출 모드에서 1초 이미지를 획득하고 옹스트롬 제곱당 전자 수를 기록합니다.

선량 분포 비율을 고려하여 적절한 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 특정 총 전자 선량에 대해 기록할 수 있는 총 이미지 수와 기울기 간격을 계산합니다. 방금 결정한 매개변수로 Tom Agram을 설정하고 기록합니다. 이러한 샘플의 경우 플러스 또는 마이너스 20도에서 시작하여 높은 기울기에 도달하기 전에 0도를 거칩니다.

TOMO를 작성하고 세그먼트화하려면 틸트 시리즈를 복원 소프트웨어에 적합한 파일 형식으로 변환합니다. Im mod와 같은 Tom Graham 재구성 프로그램을 사용하여 금 기준 마커의 위치를 표시하여 이미지를 정렬합니다. 정렬이 완료되면 Tommo Graham을 생성합니다.

시각화를 위해 IM o와 함께 배포되는 비선형 등방성 확산 필터와 같은 이미지 필터를 사용하여 tommo Graham의 대비를 향상시킬 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 프로그램을 사용하여 Tom을 수동으로 분류합니다. 내부 및 외부 멤브레인에 해당하는 복셀을 할당하여 할당된 레이어를 분리하고 멤브레인을 시각화할 수 있는 표면을 만듭니다.

emira용 EM 패키지 플러그인의 clicker 옵션을 사용하여 표시된 입자를 입력으로 사용하고 입자 추정과 같은 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하여 TP syntase 입자의 위치를 표시합니다. 전자 단층 촬영 프로그램의 경우, 분해능 추정치에 대한 agram 평균을 계산합니다. 무료 시각화 프로그램을 사용하여 독립적으로 결정된 두 개의 sub tommo 평균 간의 로비 셸 상관 관계를 계산합니다.

키메라는 알려진 X선 구조를 먼저 수동으로 톰 에이그램 이하로 맞추고, 이 그림에서 볼 수 있듯이 fit 명령을 사용하여 자동으로 미토콘드리아 전자 울음소리에서 막을 수동으로 분할하면 미토콘드리아에서 크리스티의 구조를 알 수 있습니다. 특정 단백질이 부족한 효모 녹아웃 균주에서 미토콘드리아를 이미징합니다. 이러한 단백질이 Christi 형태학에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 TP synthe dimers의 형성에 필요한 TP synthesis subunit E가 결핍된 효모 균주로부터의 미토콘드리아입니다. 야생형 미토콘드리아의 정상적인 라라 크리스티(Lala Christi)와 달리, 이 소기관은 대신 크리스티(Christi)가 없거나 작은 풍선 모양의 막 침입을 포함하는 여러 개의 내막 구조를 포함합니다. 대비가 좋은 Ingrams에서 A TP Synthes 이량체는 노란색 화살표로 표시된 것처럼 쉽게 볼 수 있습니다.

멤브레인을 분할함으로써 현재 노란색 구로 표시되는 A TP 합성의 위치를 Christi의 형태와 관련하여 시각화 할 수 있습니다. 이 경우, A TP 합성은 Lo Meer Christi Sub tommo 평균의 고도로 구부러진 가장자리를 따라 이량체 행을 형성하여 단백질의 구조를 4나노미터 이상의 분해능으로 결정할 수 있습니다. 알려진 X-ray 구조를 sub tomo Graham에 피팅함으로써, 본래 환경에서 단백질 복합체의 평균 원자 모델을 조립할 수 있습니다.

이 예시에서, 평균 부피는 서로 상대적이고 멤브레인 내의 다른 단백질 복합체에 대한 개별 복합체의 조직을 돕기 위해 Tomo Graham에 다시 배치될 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 전자 극저온 단층촬영(electron cryo tomography)을 사용하여 내부 미토콘드리아 막 내 단백질 복합체의 구조와 조직을 결정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 또한 서로 다른 세포 구획 내에서 다른 막 결합 단백질의 구조와 조직을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

시료 전처리는 좋은 서모그램을 얻기 위한 핵심입니다. 얼어붙은 수화 그리드에는 70-150나노미터 두께의 완벽한 유리체 눈이 포함되어야 합니다. 일반적으로 최적의 얼음 두께와 표본 품질의 영역을 찾을 때까지 5-6개의 그리드를 스크리닝합니다.

그램 수집의 경우 전용 극저온 스테이지와 에너지 필터가 있는 300킬로볼트 투과 전자 현미경과 직접 전자 검출기가 있는 카메라가 가장 좋지만 측면 입구 크라이오 스테이지와 CCD 카메라가 있는 200킬로볼트 기기도 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 cry m 그리드를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 기울기 시계열을 수집하고, 서모그램을 재구성하고, sub tommo 평균을 계산합니다.

이는 세포 내 단백질의 조직이 효율적인 A TP 합성과 같은 생물학적 기능을 수행하는 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 필요한 기본 기술입니다. 액체, 질소 및 액체로 작업하는 것을 잊지 마십시오.Ethan은 매우 위험할 수 있으므로 항상 보안경과 장갑을 착용해야 합니다.