Name: 방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 배우세요 음성 염색 투과 전자 현미경을 이용하여 나노디스크 막에 결합하는 외인성 막 단백질을 시각화하는 방법을. 이 기술은 단백질-막 상호작용 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

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저자는 그들의 지원을 위해 스웨덴 연구위원회, 스톡홀름 카운티위원회, 및 KI 기금 감사합니다. MSP의 발현 및 정제는 카롤린스카 연구소 / SciLifeLab 단백질 과학 핵심 시설에 (http://PSF.ki.se)을 수행 하였다. 저자는 또한 기술 전문 지식을 공유하고 자신의 적시 지원을 위해 박사 파시 Purhonen 박사 마틸다 베르그에게 감사의 말씀을 전합니다.

Nanodiscs 1. 준비 <ol><li> 식 및 멤브레인 비계 단백질 (8)의 정화 (35) <ol><li> 대장균 BL21에서 그의-태그 MSP1E3D1 (DE3) 플라스크에 T1R pRARE2의 피로를 표현한다. 37 ° C에서 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 LB 배지 50 mL의 하룻밤 스타터 문화를 준비합니다. 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 훌륭한 국물 매체의이 L에서 하룻밤 스타터 문화를 희석. </li><li> 약 3 18 ° C에서 3 시간 동안 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 단백질 발현을 유도 도달 600nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도까지 37 ℃에서 세포를 성장한다. </li><li> 용해 완충액 (100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)을 준비한다. 사용 직전에 1 mM의 TCEP를 추가합니다. </li><li> 18 ° C에서 유도 3 시간 후, 4500 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확4 ° C를. , 상층 액을 버린다 수확 된 세포를 무게, 그리고 세포의 g 당 2 mL의 용해의 버퍼의 비율로 용해 버퍼에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. </li><li> 를 Lyse 펄스 초음파 (반복 속도 : 4의 ON, 4의 OFF)에 의한 세포의 80 % 진폭에서 3 분. </li><li> 49,000 XG, 4 ° C에서 20 분 동안 해물을 원심 분리기. 이 원심에서 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 바람직하게는 4 ℃에서 보관하는 자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 연결된 5 ㎖의 니켈로 상등액 + 킬레이트 컬럼을 주입. </li><li> 그분의-태그 MSP를 제외한 모든 단백질을 제거하기 위해 아래 - 3 용출 단계 (단계 1.1.9)하기 전에 버퍼 1 열을 씻는다. 정제 공정을 수행하기 위해 280 nm에서의 단백질 함량을 모니터; 280 nm에서 UV 기록은 각 세척 후 다시 기본에 가야한다. <ol><li> 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 10 mM의 이미 다졸, 1 % 트리톤, pH가 8.0 : 1 세척 완충액으로 세척 하였다. </li><li> 40 mM 트리스 - 염산, 300 MM : 세척 버퍼 (2)로 세척염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, 50 mM의 나트륨 콜레이트, pH가 8.0. </li><li> 40 mM 트리스 - 염산, 300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 이미 다졸, pH가 8.0 : 세척 버퍼 3 씻으십시오. </li></ol></li><li> 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 및 500 mM의 이미 다졸, pH를 8.0으로 MSP를 용출. </li><li> 겔 여과 (8), (35)에 의해 표준 버퍼 (0.5 mM의 EDTA, 100 mM의 NaCl을 20 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5) MSP하기 위해 버퍼를 변경; 배치 당 수율은 약 7 mg을 L해야한다 -1. </li></ol></li><li> 인지질 원액의 제조 <ol><li> 유리 비이커를 25 ㎎ / ㎖의 농도로 클로로포름에 용해 된 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (POPC) 305 μL를 첨가하고 부드러운 질소 스트림으로 퍼징하여 클로로포름을 증발 . 진공 데시 케이 터에서 지질 밤새 건조. 주 :이 단계는 유리 비이커의 바닥에서 지질의 박막을 남긴다 지질로부터 용매를 제거한다.</li><li> 용액이 투명해질 때까지 튜브를 볼 텍싱하여 100 mM의 나트륨 콜레이트를 함유 MSP 표준 완충액 200 μL의 지질 케이크를 재현 탁; 이것은 50 mm의 POPC 농도를 갖는 용액을 제공한다. 주 : 2 (지질 : 세제) (8) 일반적으로,이 때 세제로 지질의 몰비는 1이어야한다. 이 지질 세제 혼합은 약 2 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 세제 제거를위한 소수성 구슬의 준비 <ol><li> 50 ㎖의 튜브에 비즈 5g (건조 중량)을 놓습니다. </li><li> 초순수 물 40 mL로 한 후 100 % 메탄올 30 ㎖로 세척하고 비드. </li><li> 10 mL의 MSP의 표준 버퍼로 구슬을 씻으십시오. 마지막으로, 4 ° C에서 MSP 표준 버퍼의 15 mL로 구슬을 저장합니다. </li></ol></li><li> 나노 디스크의 재구성 <ol><li> 의 microfuge 튜브에 MSP1E3D1 (0.124 mM)을 190 μL를 분배 및 인지질 원액 (50 mM의 P의 61.5 μL를 추가같은 튜브에 OPC). 1 시간 동안 젖은 얼음에 재구성 혼합물을 품어. 주 : 130 (MSP1E3D1 : POPC)이 (1)의 몰비가 동일하다. </li><li> 자기 조립 공정을 시작하도록 재구성 혼합물을 1 ㎖ 당 비드 0.5 g의 농도로 소수성 비드를 추가한다. 4 ℃에서 16 시간 동안 회전 배양기에서 품어. </li><li> 배양 후, 13,000 XG에 10 분, 4 ° C를위한 원심 분리기 침전물 및 집계를 제거합니다. 펠렛을 버리고 상층 액을 저장합니다. </li><li> 280 nm에서의 흡광도가 안정 될 때까지 MSP 표준 완충액 (자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 장착) 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. 컬럼에 상층 액을 주입 피크 분수를 수집합니다. </li><li> 280 nm에서의 피크 분획 nanodiscs의 농도를 측정한다. 나노 디스크 농도 계산 MSP1E3D1 (ε = 29,910cm -1 M-1)의 몰 흡광 계수를 사용한다. 참고 :나노 디스크 당 지질의 수는 방사성 표지 된 지질 및 인산 분석 (4)의 조합에 의해 또는 인산 형 분석에 의해 측정 할 수있다. </li></ol></li></ol> Monotopic 단백질 2. 5- 리폭 시게나 제 (35) <ol><li> 밤새 스타터 문화를 준비합니다. 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린 LB 배지 50 ㎖를 보완. 5- 리폭 시게나 제 유전자 (ALOX5)의 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21 (DE3)를 배지에 접종. 42 mM의 나트륨 2 HPO 4, 24 mM의 KH 2 PO 4, 9 mM의 염화나트륨, 19 mM의 NH 4 CL, 1mM의 황산, 0.1 mM의 CaCl2를, 0.2 % D- 글루코오스, 0.1를 함유하는 발현 배지에서 밤새 스타터 배양 희석 %, 5 μM 다음날에 FeSO4, 100 μg의 / ㎖ 암피실린. 600 인 OD ~ 0.5에서 25 ° C까지 세포를 성장. 20 ° C에서 16 시간 35 0.2 mM의 IPTG로 단백질 발현을 유도한다. </li><li> 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확하고 상층 액을 버린다. 프로테아제 억제제 및 0.5을 포함하는 (1 mM의 TCEP 100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 용해 완충액에서 수확 된 세포 및 재현 탁 수확 된 세포를 포함하는 상기 튜브의 하단에있는 펠릿 무게 ㎎ / ㎖ g 당 세포 용해 완충 용액 2의 비율로 35 리소자임. </li><li> 80 % 진폭에서 5 × 15 초 동안 초음파로를 Lyse는 세포. 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용액 (35)에 단백질을 침전 포화도 60 % - 30 황산 암모늄 침전 법을 수행한다. 16,000 XG에 15 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 주 : 5LO 펠릿 급속 냉동 최대 6 개월 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 40,000 XG에 15 분, 4 °의 C에 대한 용해 버퍼와 원심 분리기 20 mL를 펠렛을 재현 탁. </li><li> 에 뜨는을 품어<html> 30 분 동안 4 ° C에서 ATP 아가로 오스 열입니다. 0.5 M NaCl을 함유하는 용해 버퍼 중 하나 열 볼륨을 한 번 열을 씻으십시오. 10 μM 다음날에 FeSO4 및 20 μg의 / ㎖의 카탈라제를 함유하는 용해 완충액에 20 mM의 ATP로 5LO을 용출. ATP에 (35)을 제거하기 위해 겔 여과 크로마토 그래피를 수행한다. 주 : 5LO이 불안정 및 정제 후 즉시 사용하여야한다. 그렇지 않으면, 황산 암모늄 침전시키는 단계 (단계 2.1.3 후 메모 참조)에서 중단하는 것이 좋습니다. </li></ol> 나노 디스크 - 단백질 복합체의 3 준비 <ol><li> 복잡한 100 μL의 총 부피를 준비한다. MSP 표준 버퍼의 1 ㎜ 칼슘 2 + 현재와 0.8 μM ND 0.8 μM 5LO 믹스 (20 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 100 mM의 NaCl을 0.5 mM의 EDTA, 1.5 mM의 염화칼슘 2)과는 10 분 동안 품어 얼음 에다가요. 참고 : 샘플 1 개월까지 C ~ 35 ° 4에 저장할 수 있습니다. </li></ol>샘플의 ove_title &quot;&gt; 4. 분석 <ol><li> 겔 전기 영동 <ol><li> 비 변성 전기 영동 <ol><li> 5 로딩 버퍼의 μL (50 mM의 BisTris, 6 N 염산, 50 mM의 NaCl을, 10 % (w / v)의 글리세롤, 0.001 % 폰소 s, 산도 7.2) 49 시료의 15 μL를 혼합하고 4로드 - 16 % 비스 - 트리스 젤 전기 영동을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 광 음극 버퍼 음극 탱크 채우기 (50 mM의 트리 신, 산도 6.8, 50 mM의 비스 트리스 및 0.002 % 쿠마 G-250) 및 버퍼 (50 mM의 비스 트리스 50 mM의 트리 신, 산도 6.8)를 실행하는 양극 탱크. 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작 </li><li> 쿠마 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지. </li><li> 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩. </li></ol></li><li> 변성 전기 영동 <ol><li> ((SDS를 함유 로딩 완충액 10 μL와 0.05 %의 시료 40 μL를 혼합 / V) 브로 모 페놀 블루 w 0.2 M 트리스 -HCl,pH가 6.8; 20 % (v / v)의 글리세롤; 10 % (W / V) SDS; 전기 영동을 수행하기 위해 20 % 트리스 글리신 젤 - 10 mM의 2- 머 캅토 에탄올)과는 4로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행하는 캐소드와 애노드 탱크를 채우기 (25 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 200 mM의 글리신 및 0.1 % (W / V) SDS). 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작 </li><li> 로딩 염료 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지. </li><li> 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩. </li></ol></li></ol></li><li> NAPT 용액의 제조 <ol><li> (w / v)의 산성 용액을 2 %를주고, 실온에서 교반하여 물 50 mL에 phosphotungstate 나트륨 1 g을 녹인다. </li><li> 1 M NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 입자를 제거한다. 실온 또는 4 ℃에서 용액을 저장한다. </li></ol></li><li> TEM 분석을위한 시료의 준비 <ol><li> 글로우 방전 탄소 코팅 된 구리 그리드 (430mA에서 20 초 00 메쉬) 시료의 흡착 전에 친수성 그리드 렌더링합니다. 그리드에서 샘플합니다 (nanodiscs에 대해 0.8 μM)의 3.5 μL를 놓고 30 초 동안 품어. 참고 : 적용된 볼륨이 시료 농도에 따라 2.5 내지 5 μL 다를 수 있습니다. 1 μM - nanodiscs에 적합한 농도 범위는 0.5입니다. </li><li> 여과지를 사용하여 잉여의 용액을시킨다. </li><li> 즉시 30 초 동안 2 %의 NAPT 방울 그리드 얼룩. 초과 솔루션을 가릴 공기 건조에 그리드를 둡니다. </li><li> TEM에 의한 격자를 평가합니다. 120-200 keV의 가속 전압을 갖는 현미경 겹침의 정도를 추정하는 데 충분하다. 참고 : 본 프로토콜은, 교정 된 투과 전자 현미경을 사용 하였다 200 keV의 전계 방출 총 장비. </li><li> TEM에 이미지를 기록합니다. 긴 스택을 보여주는 이미지의 경우, 추가로 처리하지 않는다; 이미지는 몇 가지를 포함 할 수 있습니다 외부 단백질 nanodiscs의 복잡한을 보여짧은 스택하지만, 대부분의 입자는 복잡한에 있습니다. 녹음 여러 이미지 공정 급 평균 및 저해상도의 복합체의 3 차원 모델을 획득하기 위해 표준 방법에 의해이. 주 : 네가티브 염색 데이터의 수집을 위해, 격자는 적어도 세 개의 다른 날에 이루어졌다. 부정적인 얼룩이 적용되기 전에 매일 신선한 샘플 배양 (단계 3.1에서와 같이)가 만들어졌다. </li></ol></li></ol>

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빈 nanodiscs의 재구성, 나노 디스크 단백질 복합체의 제조, 및 이들 복합체의 TEM 용 네가티브 염색 :이 방법은 세 부분으로 분리 될 수있다. 각 부분은 기술, 중요한 단계, 유용한 수정의 한계에 대해 개별적으로 해결 될 것입니다. 빈 nanodiscs의 재구성. 생산과 nanodiscs의 사용에서 중요한 단계 및 제한. nanodiscs 빈의 제조를위한, 상기 MSP 대 지방의 비율을 최적화하는 것이 필수적이다. 가장 일반적인 MSP 및 (세제로 콜레이트를 사용하여) 지질의 경우, 최적의 비율에 대한 제안이 문헌에서 찾을 수있다 (예를 들어, 125 - 본 프로토콜에 사용 MSP1E3D1 8, 51 당 130 POPC). 차이는 단백질 농도 결정, (L)의 효율을위한 방법에 의존 할 수있다 게시 비...

의학 연구에 많은 관심이 지질 상호 작용의 다양한 관련된 진성 또는 외부 중 막 단백질에 초점을 맞추고있다. 지질 상호 작용하는 단백질과 작업 중 하나가, 세제 등의 지질에 대체를 선택 1 amphipols, 또는 작은 단백질 2, 또는 수용성 활성 단백질을 유지하는 막 대용품을 찾는 포함되어 있습니다. 리포 막 대체는 리포좀과 nanodiscs (ND) 3, 4를 포함한다. Nanodiscs 당연히 혈액에서 발생하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 단백질의 일부 ​​ApoA-1 엔지니어링 개발 가까운 천연 막 플랫폼이다. ApoA-1은 짧은 양친 매성 α-나선의 243 잔류 긴 체인 및 지질없는 수용성 형태가 있습니다. 시험관 내에서의 지질의 존재 하에서, 단백질 ApoA-1 개의 카피 자발적 히드을 둘러싸 재정렬 때지질 이중층 패치 5 ophobic 아실 사슬 부분. ApoA-1의 엔지니어링 버전은 일반적으로 멤브레인 비계 단백질 (MSP)라고하고, 증가는 플라스미드이나 정제 단백질과 같은 시판되고있다. 6 길거나 짧은 7 막 비계 단백질 ApoA-1 결과에 반복 또는 α-나선의 삭제. 차례로 이로써 7 8 내지 17 6nm의 주위 디스크를 형성 할 수있다. nanodiscs 3, 9 응용 프로그램의 다른 유형이있다. 가장 일반적으로 사용되는 애플리케이션이 이전 3 구 검토 일체 세포막 단백질 (8)의 안정화를위한 니어 - 네이티브 막 환경을 제공하는 것이다. 덜 탐구 이용의 연구 나노 멤브레인 표면을 제공하는 것이다말초 막 단백질 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 프로토콜의 제 1은 인지질 막 단백질 폴딩 이루어지는 nanodiscs의 제조 과정을 시각화한다. 샘플 준비는 대부분의 방법에서 병목 현상입니다. 방법 별 샘플은 특정 정보를 추가 할 수 있습니다,하지만 그들은 또한 결과의 비교를 어렵게 만든다. 샘플 복합있는 여러 가지 방법에 직접 사용할 수있는 경우에 따라서, 간단하다. nanodiscs의 사용과 장점은 리포좀 (예를 들어, 샘플을 직접 본 프로토콜에서와 같이, TEM 및 비 - 변성 겔 전기 영동에 모두 사용될 수 있음)에 비교하여 나노 디스크의 작은 크기이다. 18이다. 그러나, 리포좀 막에 포함 된 monotopic 막 단백질의 더 높은 해상도의 3D 구조는 우리가 아는까지로, 아직 게시되지 않았습니다. 금 나노 입자는 항체 또는 TEM (19)을 사용하여 리포솜 소낭 또는 결합 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 이 프로브는 매우 특정한 비록 그들이 막 결합 부위를 베일로 덮기하거나 유연한 부분과 관심 영역을 마스킹함으로써 막 - 결합 단백질을 방해 할 수있다. 골드 표지 또는 항체 복합체 단백질은 아마 겔에서 분석 할 수 있지만,이 실험의 비용을 증가시킬 것이다. 리포좀이 뛰어난 플랫폼 비록, 하나는 팝업이 확신 할 수 없다위험률은 리포좀 당 단백질의 특정 비율, nanodiscs (20)를 사용하여 탐색 할 수있는 기능이 있습니다. 리포좀에서, 보조 인자 및 기판 수용성 내부에 트랩 될 수있다. 막 용해 물질은 막 모방 체의 두 가지 유형에 대해 동일한 운명을 공유합니다. 이중층 영역 nanodiscs 작다 그럼에도 불구하고, 약물의 적은 양의 나노 디스크 막을 포화 요구된다. 원자 구조의 결정을 통해 이해 단백질의 기능 연구의 많은 분야에 대해 필수였다. 단백질 구조 결정하는 방법은 X 선 (21)을 포함한다; 핵 자기 공명 (NMR) 22, 23; 및 투과형 전자 현미경 (TEM) 저온에서 24 cryoEM. cryoEM에서 해상도가 최근 크게 주로 직접적인 전자 드의 사용으로 개선 된26, 25 tectors. 거대 분자는 거의 원시 상태에서 얇은, 유리체 얼음 27 군데 있습니다. 200 kDa의 - 그러나, 생체 분자의 낮은 대비로 인해, 그들 (100)의 크기의 범위가 검출하기 어려운된다. 적절한 크기의 샘플은 데이터를 수집 할 수 있고, 하나의 입자의 재구성 방법은 구조물 (28)을 얻기 위해 적용될 수있다. 그러나, TEM에 의한 단백질 구조의 측정은 다단계 과정이다. 그것은 일반적으로 부정적인 얼룩 TEM (29) phosphotungsten (PT) 30 우라늄 (31)과 같은 중금속을 사용하여 샘플 단 분산의 평가로 시작합니다. 음으로 염색 고분자의 저해상도 모델의 재구성은 일반적으로 이루어지고, 분자 구조 (29)에 대한 중요한 정보를 산출 할 수있다. 병행하여,cryoEM 시작할 수 있습니다 사용하여 데이터 수집. 인위 형성 오해를 방지하기 위해 네거티브 얼룩 TEM 데이터를 평가할 때주의를 기울여야한다. 한 특정의 인공물은 인지질의 PT 얼룩의 효과와 측면 (33)에서 본 동전의 스택을 닮은 긴 막대의 형성의 결과로, 32 리포솜. 이러한 &quot;ROULEAU&quot;또는 &quot;스택&quot;(이하 &quot;스택&quot;으로 표시됨) nanodiscs 35 이상 또한 34 HDL 초기에 관찰 하였다. 막의 적재 및 재 형성은 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 암모늄 몰 리브 데이트 얼룩 36 TEM 영상으로 나타낸 구리 등 공동 요인에 의해 유도 될 수있다. 리포좀의 막 지질의 일부분 따라서 구리 이온의 첨가 후 리포좀 스태킹 EDTA하여 금속 착물을 모방 이미 노디 아세트산 머리기를 포함 <s클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 36입니다. 스태킹 인해이나 지질 이중층에 의한 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 될 수있다 (37) (사용 된 스테인 언급되지 않음). PT에 의한 인지질의 스택 형성은 초기에 관찰되었다; 그러나, 나중에 작업을 제거하거나이 이슈 형성 (38) 폐지에 초점을 맞추고있다. 여기서는 TEM에 의해 막 결합 단백질의 연구 적재 NAPT 유도 나노 디스크를 이용할 수있는 방법을 제안한다. 즉, nanodiscs에 결합 단백질은 스택에서 nanodiscs을 방지 할 수 있습니다. 적층에 대한 이유는 명확하지 않지만, 그것은 서로 (도 1A)에 부착하기 위해 디스크를 일으키는 인지질 및 PT의 포스 포릴 그룹 사이의 정전 기적 상호 작용이 있다는 것을 제시 하였다 (39). 우리 프로토콜 뒤에 가설 단백질은 나노 디스크에 결합하면, 인지질 표면의 대부분 availa 없다는 것이다<html> 때문에 단백질에 의한 입체 장애에 대한 PT와 상호 작용 BLE. 이 스택 형성 (그림 1B)를 방지 할 수 있습니다. 두 가지 결론을 그릴 수 있습니다. 우선, 적층 예방 관심있는 단백질은 막에 결합 된 것을 의미한다. 둘째, 단백질 ND 복합체는 복합체의 대략적인 형태를 얻기 위해 표준 단일 입자 처리 방법 (24) (40)로 처리 될 수있다. 또한, 비 - 변성 겔 전기 영동 또는 동적 광 산란과 같은 방법으로 분석을 수행 할 수있다. 이 가설을 입증하기 위해, 우리는 많은 염증성 질환 (41), (42)에 관여하는 막 결합 단백질 5 리폭 시게나 제 (5LO)을 사용했다. 이 78-kDa 단백질은 막 (43)에 결합하는 칼슘 이온을 필요로한다. 이 멤브레인 연관이 조사 된 경우에도 광범위 리포좀을 사용하여S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 44, 45, 46, 47의 막 분획, 이러한 TEM 분석과 구조 결정을 위해 사용될 수 없다. nanodiscs의 제조는 세제 나트륨 콜레이트 재현 탁 MSP 지질과 혼합함으로써 시작한다. 얼음상에서 1 시간 동안 배양 한 후, 세제 서서히 흡착 수지를 이용하여 재구성 된 혼합물로부터 제거된다. 이러한 종류의 재료는 종종 작은 비드로 성형 폴리스티렌 이루어진다. 그들은 상대적으로 소수성 및 지질 (48)에 비해 세제를 바인딩에 대한 강한 선호를 가지고있다. 소수성 비드를 제거하고, 원심 분리를 이용하여 설명을 수행 한 후에는 nanodiscs은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)에 의해 정제된다. 정제 nanodiscs은 (a 적정 또는 여러 비) 등몰 비율의 monotopic 막 단백질 (및 가능한 보조 인자)와 혼합하고, (R)에 남아어린애들입니다 사람들을 대피 (15 분). TEM 분석으로는 글로우 방전 탄소 코팅 된 그리드 상에 샘플 μL - 양을 적용하여 다음 NAPT 마이너스 염색을 수행함으로써 수행된다. 분취 액은 TEM 그리드에인가 된 경우에서 동일한 샘플은 별다른 변화 비 변성 또는 SDS의 PAGE 겔 전기 영동뿐만 아니라 의한 활성의 측정 각종 분석을 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>투과 전자 현미경: JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글로우 디스배기</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM 그리드: 400메시</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>크기 배제 크로마토그래피: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드:</td><td>MSP1E3D1 Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>박테리아: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>박테리아: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>단백질 과학 시설, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정제 매트릭스: ATP 아가로스</td><td>시그마 알드리치</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>정제 매트릭스: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>지질: POPC</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850457C</td><td>클로로포름 내 25 mg/mL</td></tr><tr><td>소수성 비드: Bio-Beads, SM-2 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm 주사기 필터: 0.2 &mu; m</td><td>Pall 생명 과학</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>염색 : 인산 텅스텐 산 나트륨 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2- 메르 캅토 에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>도데 실 황산나트륨 (SDS)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마 알드리치</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>시그마 알드리치</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>세제: 소듐 콜레이트 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 콜레이트</td><td></td><td></td><td>500 mM 소듐 콜레이트. miliQ 물에 재현탁하고 -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>지질 재고</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC, 100 mM 나트륨 콜레이트, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. <bt />4 &deg에서 저장; 일주일 동안 C; 또는 스토어 -80 &deg; C를 한 달 동안 질소로 용액을 정화 한 후.</td></tr><tr><td>MSP 표준 버퍼</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. 4 °C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>비변성 전기영동 양극 완충액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8</td></tr><tr><td>비변성 전기영동 음극 완충액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Non-Denaturaing 전기영동 4x 시료 로딩 완충액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10 % (w / v) 글리세롤, 0.001 % Ponceau S</td></tr><tr><td>변성 전기 영동 실행 버퍼</td><td></td><td></td><td>사내 레시피 : 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM 글리신, 0.1 % (w / v) SDS</td></tr><tr><td>변성 전기 영동 5x 샘플 로딩 버퍼</td><td></td><td></td><td>사내 레시피 : 0.05 % (w / v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20 % (v / v) 글리세롤, 10%(w/v) SDS, 10mM 2-메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>훌륭한 육수</td><td></td><td></td><td>트립톤 - 12.0g, 효모 추출물 - 24.0g, 100mL 0.17M KH2PO4 및 0.72M K2HPO4, 글리세롤 - 4 mL. 트립톤, 효모 추출물 및 글리세롤을 900 mL로 제조하고 별도로 오토클레이브했습니다. KH2PO4 및 K2HPO4를 별도로 준비하고 오토클레이브했습니다. 매체를 사용하기 전에 둘 다 혼합되었습니다.</td></tr></tbody></table>

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic 단백질은 막 표면에 부착될 때 기능을 발휘하며, 이러한 상호 작용은 특정 지질 조성 및 기능을 수행하기에 충분한 영역의 가용성에 따라 달라집니다. 나노 디스크는 크기와 지질 함량이 제어된 멤브레인 표면을 제공하는 데 사용됩니다. 결합된 외인성 단백질이 없는 경우, 인산화텅산나트륨으로 염색된 나노디스크는 투과전자현미경(TEM)으로 측면에서 볼 때 동전 더미처럼 보입니다. 따라서 이 프로토콜은 의도적으로 스태킹을 촉진하도록 설계되었습니다. 결과적으로, 적층 방지는 멤브레인 결합 단백질이 나노 디스크에 결합하는 것으로 해석될 수 있습니다. 추가 단계에서, 단백질-나노디스크 복합체의 TEM 이미지는 표준 단일 입자 방법으로 처리하여 고분해능 cryoEM 작업의 기초로 저분해능 구조를 생성할 수 있습니다. 게다가, nanodiscs는 TEM 또는 non-denaturing 젤 전기 이동법, 또는 tématoring를 위해 적당한 표본을 제공합니다. 이 방법을 설명하기 위해 나노 디스크에서 5-리폭시게나제의 Ca2+ 유도 결합이 제시됩니다.

우리가 제안하는 방법은 결합 monotopic 막 단백질 막 표면을 제공 nanodiscs의 제조 방법에 의존한다. 나노 디스크 지질 이중층에 매립에는 막 관통 단백질이 없을 때, nanodiscs 여기에서 &quot;빈 nanodiscs&quot;(도 2A)로 표시된다. 이 두 MSP1E3D1 비계 단백질과 POPC (8)의 약 260 분자의 조성물 256 kDa의의 계산 된 분자량이있다. 이 단백질 사용 : 재구성을위한 지질 비율, 하나의 주요 피크 (그림 2A하는) 겔 여과 동안 용출 하였다. 9 ㎖ (그림 2A) 주변의 피크 분획을 하나의 밴드 (그림 2B, 레인 1)을 보여주는 파란색 기본 겔 전기 영동 (49)에 의해 조사 하였다. 밴드 256 kDa의 ...

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 단백질의 고해상도 구조 결정을 위한 첫 단계로서, 음성 염색 투과 전자 현미경을 통해 나노디스크 막 표면에서의 외인성 막 단백질 결합을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 세포막 내부 및 표면에서 일어나는 단백질 활성과 관련이 있으므로 여러 연구 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질이 막에 결합하지 못할 경우 나노디스크 형태가 특징적인 적층 구조를 이룬다는 점입니다.이러한 적층 구조는 투과 전자 현미경을 통해 명확하게 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 응용 범위는 약물 개발로 확장되어, 화합물이 막 단백질 상호작용을 차단하거나 활성화하는 능력이 있는지 쉽게 스크리닝할 수 있습니다. 이 방법은 단일 부위 단백질이 막에 결합하기 위한 최적 조건에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 단백질 나노디스크 복합체의 저해상도 구조 정보 또한 제공합니다.절차를 시작하려면 MSP1E3D1과 같은 막 스캐폴딩 단백질을 발현시키고 정제하십시오. 다음으로, 금속 바늘이 달린 유리 주사기를 사용하여 25 mg/mL 농도의 클로로포름 내 POPC 305 µL를 유리 둥근 바닥 플라스크에 분주합니다. 흄 후드 내에서 완만한 질소 가스 흐름 아래 클로로포름을 증발시키십시오.남은 지질을 진공 데시케이터에서 하룻밤 동안 건조합니다. 그런 다음 건조된 지질 케이크를 세제로서 100 millimolar sodium cholate가 첨가된 200 microliters의 MSP 표준 완충액에 녹입니다. 혼합액이 투명해질 때까지 볼텍싱하여 완충액 내 50 millimolar POPC 현탁액을 얻습니다.다음으로, 5 g의 소수성 비드를 30 mL의 100% methanol로 세척한 후, 40 mL의 초순수와 마지막으로 10 mL의 MSP 표준 완충액으로 세척합니다. 비드를 15 mL의 표준 완충액에 담가 4 °C에서 보관하십시오. 그 다음, 0.124 mM MSP1E3D1 용액 190 µL와 완충액 내 50 mM POPC 현탁액 61.5 µL를 혼합하여, MSP 대 POPC의 몰비를 1:130으로 하고 sodium cholate 농도를 25 mM이 되도록 합니다.MSP당 지질의 이상적인 비율은 선택한 지질 유형과 MSP 렌즈에 따라 다르며, 균일한 나노디스크 표본을 얻기 위해 최적화해야 합니다. 혼합물을 젖은 얼음 위에서 1시간 동안 배양하십시오. 그 후, 나노디스크 자가 조립을 시작하기 위해 재구성 혼합물 1mL당 세척된 소수성 비즈 0.5g이 들어 있는 튜브에 해당 용액을 첨가하십시오.혼합물을 4 °C에서 분당 7~8회 회전시키며 16시간 동안 배양합니다. 배양 후, 비드가 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 상층액을 제거하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 때까지 4 °C에서 보관합니다.크기 배제 크로마토그래피를 수행하기 전, 혼합물을 4°C에서 13,000 g로 10분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 따라내고 펠렛은 폐기하십시오. 280 nm에서 베이스라인이 안정될 때까지 MSP 표준 완충액으로 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 평형화하십시오.상층액을 컬럼에 주입하고 생성물을 0.5 milliliter 분획으로 수집합니다. UV vis 분광광도계를 사용하여 각 분획의 280 nanometers에서의 흡광도를 측정합니다. 선택한 MSP의 몰 흡광계수를 이용하여 나노디스크의 농도를 계산합니다.비변성 젤 전기영동을 수행하려면, 먼저 샘플 15 µL를 적절한 로딩 버퍼 5 µL와 혼합하십시오. 음극 탱크에는 가벼운 음극 버퍼를, 양극 탱크에는 러닝 버퍼를 채웁니다. 샘플을 4~16% Bis-Tris 젤에 로딩하고 전기영동을 시작하십시오.겔 제조업체의 지침에 따라 겔을 염색하십시오. 단백질로 five lipoxygenase를 사용하는 나노디스크 모노토픽 단백질 복합체 준비를 시작하려면, 1.5 mM calcium chloride가 첨가된 MSP 표준 버퍼를 준비하십시오. 5LO 단백질을 발현 및 정제하십시오.calcium이 풍부한 MSP 표준 완충액에서 0.8 µM 5LO와 0.8 µM nanodiscs의 100 µL 혼합물을 즉시 준비하십시오. 본 실험에서 사용된 단일토픽 단백질분해효소 5-리폭시게나제는 막에 결합하기 위해 calcium 양에 의존합니다. 5LO는 매우 민감하므로 준비 후 몇 시간 이내에 사용해야 합니다.혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 생성된 나노디스크 단백질 복합체 샘플은 4°C에서 최대 한 달 동안 보관하십시오. TEM 분석 준비를 시작하려면, 상온에서 초순수 50 mL에 포스포텅스텐산 나트륨 염 1 g을 녹입니다.1 M 수산화나트륨 용액을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조정합니다. 0.22 µm 시린지 필터로 포스포텅스테이트 나트륨 용액을 여과한 후 실온에서 보관합니다. 다음으로, 400 mesh 탄소 코팅 구리 그리드를 30 mA에서 20초 동안 글로우 방전시켜 그리드 표면을 친수성으로 만듭니다.2.5에서 5 µL의 나노디스크 단일 부위 단백질 복합체 샘플을 그리드 위에 떨어뜨리고 30초 동안 방치합니다. 그 다음 거름종이를 사용하여 그리드에서 과량의 용액을 흡수해 제거합니다. 즉시 포스포텅스테이트 나트륨 용액 한 방울을 떨어뜨리고 30초 동안 방치합니다.과잉 용액을 흡수시키고 그리드를 공기 중에서 건조시킵니다. 120에서 200 kilovolts의 가속 전압으로 투과전자현미경 관찰을 수행합니다. 긴 스택이 나타나는 이미지는 이후의 이미지 처리 과정에서 제외합니다.선택된 이미지에 대해 표준 처리 방법을 사용하여 클래스 평균을 결정하고, 나노디스크 단일위치 단백질의 저해상도 3D 모델을 생성합니다. 이 방법을 사용하여 막 지지 단백질과 지질의 비율을 1:130으로 하여 빈 나노디스크를 준비했습니다. 크기 배제 크로마토그래피에서는 하나의 주요 피크만 관찰되었으며, 블루 네이티브 젤 전기영동에서는 단 하나의 밴드만 관찰되었습니다.빈 나노디스크를 포스포텅스테이트 나트륨 염 용액으로 처리하면 적층이 유도됩니다. 이렇게 형성된 긴 적층 구조는 TEM으로 관찰할 수 있습니다. 이러한 적층 현상은 포스포텅스테이트 나트륨 용액을 처리하기 전 나노디스크 용액에 칼슘 이온을 포함시켜도 저해되지 않았습니다.5-리폭시게나제와 같은 단일위치 단백질이 나노디스크 표면에 결합하면, 단백질에 의한 입체 장애로 인해 적층이 방해받습니다. 나노디스크의 양면 모두 결합이 가능하므로, 1:1 및 2:1 5LO 나노디스크 복합체가 형성될 수 있습니다. 2:1 5LO 나노디스크 복합체 시료는 1:1 시료보다 적층 현상이 적게 나타났습니다.5LO 결합에는 칼슘 이온의 존재가 필요합니다. 이는 칼슘이 없는 5LO와 나노디스크 혼합물에서 적층 현상이 관찰됨으로써 확인되었으며, 이는 5LO가 막 표면에 결합하지 않았음을 나타냅니다. 모노토픽 단백질과 나노디스크가 준비되면, 적절하게 수행할 경우 단백질의 막 결합 평가를 오후 한나절 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 적절한 MSP 길이를 선택하기 위해 나노디스크 상의 단백질 면적을 추정하는 것이 중요합니다. 크기가 잘 맞을 경우, 최대 두 개의 외인성 단백질이 디스크의 양면에 하나씩 결합할 수 있습니다. 또한, 단백질 결합 여부는 모노토픽 단백질이 없는 샘플의 긴 적층 구조와 적층 구조의 부재를 비교하여 확인하므로, 최대 적층을 보장하기 위해 음성 염색에 포스포텅스텐 나트륨염을 사용하는 것이 중요합니다.리포좀 대신 나노디스크를 사용하면 동적 광산란, 소각 X선 산란을 통해 시료의 균질성, 크기 또는 분자 구조에 관한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 나노디스크에 결합된 단일 토픽 막 단백질의 저해상도 3D 구조는 이러한 결합 단백질의 고해상도 구조로 나아가는 과정에서 쉽게 접근 가능한 첫 번째 단계가 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 하나의 세포에서 형광을 사용하여 conformational 변화의 특정 사이트 분석과 함께 막 단백질의 이온 전달의 속도론을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 이온 채널 전송기 및 이온 펌프에 적응하고 단백질 subunits 사이의 거리 제한을 결정하기 위해 이용하실 수 있습니다.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

배우세요 음성 염색 투과 전자 현미경을 이용하여 나노디스크 막에 결합하는 외인성 막 단백질을 시각화하는 방법을. 이 기술은 단백질-막 상호작용 연구와 약물 개발에 활용됩니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

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