Name: 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 직렬 섹션 전자 단층 촬영법을 사용하여 Drosophila 간접 비행 근육의 미토콘드리아 초미세 구조를 3차원으로 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 초미세 구조와 기능 관계 연구에 필수적입니다.

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연구는 세포 연구소와 Organismic 생물학에서 EM 코어와 학계 Sinica, 타이 페이, 대만의 곳을 알아내는-엠 코어에서 수행 했다. 작품은 학계 Sinica 및 대부분에 의해 지원 되었다.

1. 섹션 초파리 조직을 진동 블레이드 톰을 사용 하 여
<ol>
	<li>얼음에 초파리 를 anesthetize 하 고 인산 염 버퍼에 4% 낮은 녹는 agarose의 1 mL에 각 하나의 비행을 담가. 얼음에 공고히 agarose를 허용 합니다. 일반적으로, 4-6 파리 처리 되었습니다.</li>
	<li>진동 블레이드 톰을 사용 하 여 섹션 agarose 젤에 포함 된 초파리 조각 100 µ m 두께 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션에 몰두. 참고: 조직 아키텍처 다른 방법에 비해 더 그대로 남아 있기 때문에 선호는 Vibratome 단면입니다. 또는, 핀셋을 해 부 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션으로 IFM을 해 부를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 준비는 고압 및 동결 대체 (HPF/FS) 방법으로 EM 표본
<ol>
	<li>인산 염 버퍼, 2 방울 (~ 100 µ L) 20 %BSA 인산 염 버퍼의 다음의 3 방울 (~ 150 µ L)에서 조직 단면도 씻어. 다음 HPF 버퍼 및 20 %BSA 가득에 대 한 금 사업자에 섹션을 배치 합니다.</li>
	<li>사용자 설명서에 따라 고압 냉동 고에 운반대를 포함 하는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>동결, 후 액체 질소 아래 홀더 사업자 놓고-140 ° c 냉각 동결 대체 장치에 전송</li>
	<li>표 1, 2%도, 2% 오스뮴 tetroxide 그리고 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 칵테일 fs와 같이 동결 대체 프로토콜을 수행 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 바늘으로는 표본 캐리어에서 제거 하 고 실 온에서 수 지에 견본을 포함. 16 h 65 ° C에서 수 지 유해 참고: FS 프로토콜 샘플의 준비를 수정 해야 합니다. HPF/FS는 열 대권 외의를 유지 하 고 세포 내용의 손실을 최소화를 선호 된다.<ol>
		<li>양자 택일로, 화학 기정 프로토콜을 적용 됩니다. 표본 2.5%도 함께 하룻밤, 버퍼와 세척 고 1% 오스뮴 tetroxide 2 h. 세척에 대 한 해결 및 에탄올의 농도 오름차순으로 탈수와 다음 침투 고치고 16 65 ° C에서 polymerizing 전에 Spurr의 수 지에 견본을 포함 h입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 전자 단층 촬영에 대 한 직렬-섹션은 견본의 준비
<ol>
	<li>조직에 있는 원하는 블록 얼굴 노출 견본 블록을 잘라.</li>
	<li>금 입자를 pretreat (10 nm 직경에서) 30 분 세척에 대 한 1 %BSA PBS 버퍼에 금 입자를 일시 중단 하 고. 표준 마커를 만드는 탄소 필름으로 코팅 된 구리 슬롯 격자에 금 입자를 오버레이 합니다.</li>
	<li>단층 촬영 수집의 보기의 필드에 충분 한 표준 마커 (마커 적어도 5-10)를 가장 아래에서 확인.</li>
	<li>두께 ultramicrotome를 사용 하 여 200-250 nm 직렬 섹션을 잘라.</li>
	<li>슬롯 격자 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여에 직렬 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 Reynold의 리드 시트르산과 섹션 얼룩.</li>
	<li>섹션 상단 표준 금 입자의 두 번째 레이어를 오버레이 합니다.</li>
</ol>
4. 수집 이중 기울기 전자 단층 촬영
<ol>
	<li>이중 축 단층 촬영 홀더에 그리드를 로드 하 고 200에서 전송 전자 현미경에 삽입 kV.</li>
	<li>Eucentric 초점에 현미경을 맞춥니다.</li>
	<li>자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정 합니다. 조정 하 고 다중 스케일 영상 설정에서 전자 빔 정렬. 작업 세부10 (그림 2)에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>단층 촬영 컬렉션 설정에서 탄소 필름 없이 빈 영역에 카메라 어둡고 밝은 참조를 취득 합니다.</li>
	<li>낮은 확대율에서 격자 아틀라스를 수집 합니다. 단층 촬영 컬렉션의 대상으로 직렬 섹션에 미토 콘 드리 아를 선택 합니다.</li>
	<li>에 2 ° 증가와 60 °-60 °에서 기울기 시리즈를 취득 축-A 각 대상에 대 한. 참고: 기울기 각도 기계적으로 제한 될 견본 홀더 디자인. 홀더는 높은 기울기 각도에서 빔을 차단 됩니다.</li>
	<li>두 번째 기울기 시리즈를 수집 하려면 견본 홀더 90 ° 회전 합니다. 새로운 지도 획득 합니다. 해당 위치를 선택 하 고 각 대상에 대 한 축-B에 기울기 시리즈를 취득. 참고: 다른 소프트웨어 패키지, SerialEM 및 Xplore3D, 자동 데이터 수집을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
5. 3D Tomograms 재구성 및 세그먼트 하위 볼륨 소프트웨어를 사용 하 여
<ol>
	<li>아이 모드 소프트웨어11를 사용 하 여 이중 축 기울기 이미지의 tomograms를 재구성 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>골드 표준 마커의 위치에 의해 개별 기울기 시리즈를 맞춥니다. 모두 축 A에 다시 투영 메서드 또는 동시 반복적 재구성 기법 (SIRT) 메서드에서 tomograms를 재구성 및 축-B, 각각 (그림 3).</li>
		<li>축-A의 tomograms 결합 축-b 감소 누락 쐐기 유물와 이중 기울기 tomogram 생성 하.</li>
		<li>전체 mitochondrion 볼륨을 취재 하는 개조를 직렬 섹션의 더블-틸트 tomograms 함께 가입. 모델 아이 모드 프로그램에 의해 직렬 섹션 사이의 간격.</li>
		<li>결합 된 tomograms 및 빈 볼륨 세분화에 대 한 원하는 크기 트림.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>조인 된 직렬 tomograms 3D 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>필터링 기능 대비 개선 하 고 배경 밀도 줄일 가우스 필터 (또는 다른 방법) tomograms.</li>
		<li>수동 또는 자동으로 미토 콘 드리 아의 열 대권 외 세그먼트.</li>
		<li>3d에서 검사 수 있도록 세분화 모델을 표시 합니다.</li>
		<li>3D에서 사용할 수 있는 도구를 사용 하 여 영화를 생성 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).</li>
<li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+by+electron+tomography%3A+from+cells+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li>
<li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+electron+tomography%3A+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li>
<li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22SciRep%22%5BJournal%5D)">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474(2017).</li>
<li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Cristae%3A+Where+Beauty+Meets+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22TrendsBiochemSci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li>
<li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v505/n7483/full/nature12985.html">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li>
<li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 초파리 간접 비행 근육의 연구에 적용 하기 위한 최적화 된 워크플로 설명 합니다. 샘플에서 열 대권 외의 보존은 분석의이 유형에 대 한 기본 기술 도전 이다. 위해 최고의 열 대권 외의 두 방법론 단계 포함 되었습니다. 첫째, 조직 조직 아키텍처를 가능한 한 많이 유지 블레이드 톰을 진동으로 단면에 의해 샘플링 되었다. 둘째, HPF/FS 프로토콜 포함된 견본 블록의 준비 하는 동안 세포 기관이 열 대권 외의를 유지 하기 위해 최적화 되었다. 표본 높은 압력, 물의 어는 점을 손상 열 대권 외1얼음 결정의 형성을 감소 시킨다는 동결 했다. 표본으로 0.1 m m 두께 즉시 vitrified 고 EM 분석을 위한 견본 블록을 생성 하는 대체 동결 대상이 될 수 있습니다. HPF/FS로 열 대권 외의 향상 된 보존, 화학 고정 방법에 비해 지적 했다. 이 일련의 단계를 사용 하 여 샘플 준비, 미토 콘 드 리아 이중 막과 cristae 막의 보존 극적으로 개선 되었다.
시료의 직렬 섹션을 얻는 방법의 가장 어려운 단계입니다. 으로 전자 빔 침투 전력 제한, 섹션의 두께 어느 250 또는 500 nm 200에서 가장을 사용 하 여 k v 또는 300 kV, 각각. mitochondrion의 두께 이상의 2 µ m 일 수 있으므로 직렬 섹션 전체 볼륨 복원을 얻기 위해 필요 합니다. 그러나, 전체 세포 기관이 되도록 직렬 섹션의 충분 한 수를 복구 하는 것은 기술 도전 이다. 트리밍는 사다리꼴의 기초 사이 가능한 평면 수 블록 얼굴 슬롯 눈금 더 많은 부분을 수용 하 고 따라서 더 큰 볼륨을 커버 수 있습니다. 또한, 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여 직렬 섹션 그리드 전송 성공률을 증가 합니다.
표준 안에 핵심 장비와 직렬 섹션 전자 단층 촬영을 수행할 수 있습니다. 그러나, 메서드는 기술적 제한에서 발생 하는 몇 가지 피할 수 없는 제한이 있습니다. 하나는 자료 직렬 섹션, 조인된 재건에 격차를 떠나 사이 필연적으로 손실입니다. 두 번째 달성 제한 기울기 각도 때문에 발생 하는 누락 된 쐐기 유물이 이다. 이 제한에는 견본 홀더 전자 빔 차단 하지 않고 전체 회전에 설정할 수 없습니다 때문에 발생 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 직렬 섹션 전자 단층 세포와 세포 기관이 열 대권 외의 차원에서 공개를 충분 한 확인을 합니다.
작은 규모 이미징, cryo 전자 단층 촬영은 고분자 복합물 및 어셈블리에 현장에서 함께 하위 단층 또는 하위 angstrom 해상도 구조를 사용할 수 있는 신흥 기술 재건축3. 이 응용 프로그램에서 셀 단면 또는 집중 된 이온 빔 액체 질소에서 밀링 thinned 있다. tomograms 분자 구조는 화학 고정, 탈수, 또는 포함 하지 않고 기본 상태에 가까운 유지 하는 곳을 알아내는-조건 하에서 수집 됩니다. 규모의 다른 쪽 끝에 해상도, 비용 큰 조직의 볼륨을 분석 하 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법은 매력적인 적임 비록 특정 악기4필요 합니다.

전자 현미경 subcellular 어셈블리 및 세포질 과정을 수행 하는 세포의 구조적 맥락을 연구 하는 귀중 한 도구입니다. 방법은 알데하이드와 화학 기정에 의해 조직이 나 세포의 열 대권 외를 보존 하기 위해 개발 되었습니다 또는 높은 압력에 의해 대체 (FS)1,2동결 동결 (HPF) 다음. 포함 된 견본 블록 있습니다 수 sectioned, 스테인드, 그리고 전송 전자 현미경 (TEM)으로 관찰 합니다. HPF 표본 수 또한 처리 cryo-조건 같은 곳을 알아내는 단면 또는 집중 된 이온 빔 (FIB) 밀링, 및 곳을 알아내는-EM3,4에 의해 관찰.
얇은-섹션 안에 유익한 형태학 통찰력 제공, 하지만 결과 2D 이미지만 특정 횡단면의 열 대권 외를 밝힐 수 있다. 3D 볼륨에서 열 대권 외의를 구성 하는 방법을 가려진 남아 있습니다. 세포 열 대권 외의 3 차원에서 시각화를 위해서는 전자 단층 촬영 방법 틸트 이미지의 시리즈 인수 하 고 다시 단층 촬영 개조5 (그림 1)을 생성 하 예상 했다 개발 되었다. 이중 기울기 시리즈 샘플 90 °를 회전 하 고 두 번째 기울기 시리즈를 취득 하 여 수집할 수 있습니다. 이 제한 된 샘플링 각도에서 발생 하는 tomogram의 해상도 개선 누락 쐐기 아티팩트 최소화 됩니다.
여기, 우리는 초파리 간접 비행 근육 (IFM)6,7,,89 의 열 대권 외의 미토 콘 드리 아 연구 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 설명 . 3D 복원 전체 미토 콘 드리 아 (약 2.5 µ m 두께) 취재를 얻으려면 직렬 섹션 초파리 IFM 조직 블록에서 얻은 했다. 각 섹션의 Tomograms 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 개별적으로 수집 했다. 단층 촬영 개조 했다 생성 하 고 직렬 tomograms를 전체 mitochondrion의 재건된 볼륨 아이 모드 패키지와 함께 합류 했다. 결합 된 tomograms는 3D 소프트웨어에 의해 분석 되었다. Cristae 미토 콘 드리 아의 밀도 3 차원에서 조직 공개 세분화 모델을 생성 하 세그먼트 했다.

<table><tbody><tr><td>진동 블레이드 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>조직 절편</td></tr><tr><td>고압 냉동고</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>표본 준비</td></tr><tr><td>동결 대체 장치</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>표본 준비</td></tr><tr><td>초박 절편기</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>초박형 절단</td></tr><tr><td>이중 축 단층 촬영 홀더</td><td>Fischione</td><td>모델 2040</td><td>단층 촬영 수집</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>단층 촬영 컬렉션</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>단층 촬영 컬렉션</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>단층 촬영 컬렉션</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography 재구성&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>단층 촬영 분석</td></tr></tbody></table>

3d 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

미토 콘 드리 아 ATP, 지질, 및 대사 산물, 뿐만 아니라 칼슘 항상성 및 세포 죽음 통제 세포 강국은. 이 세포 기관이의 독특한 cristae 풍부한 이중 막 열 대권 외 우아하게 생체를 분할 하 여 여러 기능을 수행 하기 위해 배열 된다. 열 대권 외의 미토 콘 드 리아는 연결 되어 속속들이 다양 한 기능; 그러나, 이러한 구조-기능 관계의 좋은 정보는 설명에 시작 됩니다. 여기, 우리가 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3 차원에서 어떤 세포질 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 cristae 미토 콘 드리 아의 구조 기능 분석에 그것의 에너지 상태와 노화 반영 하 적용. 우리 초파리 IFM의 미토 콘 드리 아 통합 형성 했다 cristae 및 매트릭스 3D (그림 4)7네트워크. 또한, 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함 및 가속된 노화 형 돌연변이 파리 양파 모양의 소용돌이 코어 (그림 5)7의 하위 섹션을 포함 하는 미토 콘 드리 아를 축적.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
그림 1: 전자 단층 촬영 개조 기울기 시리즈에서의 일러스트. 실험에서 전자 빔은 개체를 다양 한도로 기울이면 3D 개체를 통해 전달 됩니다. 각 기울기 조건에 대 한 2D 투영은 생성 하 고 카메라와 함께 캡처. 2D 계획은 다시 중앙 조각 정리에 따라 3D 개체를 재구성 하 예상 됩니다. 그림에서 같은 프로세스는 다양 한 기울기 각도에서 단일 차원에 투영 하는 원래 2D 이미지 표시 됩니다. 1 D 계획 다음 2D 이미지를 재구성 하는 데 사용 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
그림 2: 자동 데이터 수집. 직렬 섹션을 포함 하는 슬롯 격자의 아틀라스를 보여주는 소프트웨어의 이미지 뷰어 디스플레이, 미토 콘 드리 아의 대상으로 하 고 취득 다중 스케일 이미지 기울기. 눈금 막대 = 500 µ m (왼쪽된 상단 패널), 100 µ m (왼쪽된 하단 패널), 1 µ m (오른쪽 패널). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
그림 3: 직렬 섹션 전자 초파리 간접 비행 근육에 단일 mitochondrion의 단층 촬영. 2D 현미경 (A) 및 (B) 3D tomograms는 mitochondrion의 전체 볼륨을 덮고 직렬 섹션에서. (C) 조인 된 직렬 섹션 tomograms 섹션을 만드는 한 경도, 수직으로 표시 하는 z 축으로 투영 됩니다. 특히, 조직 단면 소재, 조인된 tomograms 사이의 격차를 떠나의 손실에 지도. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
그림 4: 내부-미토 콘 드리 아 cristae 및 매트릭스 네트워크 차원에서 통합. (A) 조각 z 축을 통해 플레이트 막 사이 스위치를 보여주는 미토 콘 드리 아 전자 단층 촬영 개조. (B) 스위칭 오른쪽 손으로 및/또는 왼손잡이 나선 패턴 관찰된 cristae의 삽화. (C) 단층 세분화 보여주는 3 차원 (D) Cristae 스위칭 패턴에에서 왼손잡이 나선 분석 하 고 세분화 모델 (E, F)에 색상 렌더링 했다. Cristae 막 (흰색 밀도)에 걸쳐 측면 매트릭스 confluency (어두운 밀도, 빨간색으로 표시)를 보여주는 단층 쪼 갠 다. (G) 세분화 보여줍니다 측면 매트릭스 confluency (레드) (E)에 tomogram의 모델 및 대표 cristae (회색)에서. 눈금 막대 = 50 nm (A), 200 nm (C), 그리고 300 nm (D, E, F, G). 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
그림 5: 양파 모양의 소용돌이 코어와 미토 콘 드리 아 노화 중 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함을 가진 파리에 축적. 대표적인 단층 조각 고 보여주는 횡단면 뷰 (위)와 소용돌이 코어의 경도 섹션 보기 (아래) 해당 세분화 (오른쪽 패널). 볼륨 세분화는 소용돌이 코어를 강조 하기 위해 임의의 색상 렌더링으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 200 nm. 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>단계</td>
			<td colspan="2">온도</td>
			<td colspan="2">시간</td>
			<td colspan="2">솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">--9 0 ° C 140 ° C</td>
			<td colspan="2">30 분</td>
			<td colspan="2">액체 질소</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C ~-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C ~-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C에 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 시간 x 3 회</td>
			<td colspan="2">아세톤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">방 온도</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">수 지 침투</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 동결 대체 프로토콜입니다.

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

이 비디오의 전반적인 목표는 초파리 간접 비행 근육의 미토콘드리아 미세 구조를 연구하기 위해 연속 절편 전자 단층 촬영의 적용을 결정하는 것입니다. 이 방법은 구조 세포 생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 미토콘드리아와의 구조 및 기능적 관계에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 미세 구조가 3차원으로 드러난다는 것입니다.실험을 시작하기 위해 5개의 Drosophola 표본을 얼음 위에서 마취하고 각 파리를 인산염 완충액에 있는 4% 저용융 아가로스 1밀리리터에 담그십시오. 아가로스가 얼음 위에서 굳어지도록 합니다. 그런 다음 진동 블레이드 마이크로톰을 사용하여 아가로스 젤이 포함된 드로소포라를 100마이크로미터 두께의 조각으로 절단합니다.영점 1몰 인산염 완충액에 2.5%글루타르알데히드가 포함된 고착 용액에 슬라이스를 담그십시오. 인산염 완충액 3방울로 조직 절편을 세척한 다음 20% BSA가 함유된 인산염 완충액 2방울로 세척합니다. 고압 동결을 위해 금 캐리어 또는 HPF에 절편을 넣고 버퍼와 20%BSA로 채웁니다.다음으로, 캐리어가 들어있는 샘플을 사용 설명서에 따라 고압 냉동고에 넣습니다. 동결 후 액체 질소 하에서 홀더에서 캐리어를 분리하고 섭씨 영하 140도로 냉각된 자유 치환 장치로 옮깁니다. 아세톤에 글루타르알데히드 2%, 테트록사이드 오스뮴 2%, 우라닐 아세테이트 0.1%를 함유한 FS 칵테일로 자유 대체 프로토콜을 수행합니다.실온에서 수지에 표본을 삽입합니다. 그런 다음 수지를 섭씨 65도에서 16시간 동안 중합합니다. 시편 블록을 잘라 조직이 포함된 원하는 블록 면이 노출되도록 합니다.다음으로, 10나노미터 금 입자를 1% BSA로 30분 동안 전처리합니다. 금 입자를 세척하여 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 현탁시킵니다. 탄소 필름으로 코팅된 구리 슬라이드 그리드에 금 입자를 오버레이하여 기준 마커를 만듭니다.초박 절편을 사용하여 200-250나노미터 두께의 연속 절편을 절단합니다. 그런 다음 얇은 섹션에 대한 완벽한 루프를 사용하여 슬롯 그리드의 직렬 섹션을 수집합니다. Reynolds lead citrate로 섹션을 10분 동안 염색합니다.섹션 상단에 기준 금 입자의 두 번째 층을 오버레이합니다. 그리드를 이중 축 단층 촬영 홀더에 로드하고 200k볼트에서 작동하는 투과 전자 현미경에 삽입합니다. 유센트릭 초점에 현미경을 정렬합니다.자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정하고, 멀티스케일 이미징 설정에서 전자빔을 조정 및 정렬하고, 단층 촬영 수집 설정에서 탄소 필름이 없는 빈 공간에서 카메라의 어둡고 밝은 기준을 획득합니다. 다음으로, 저배율에서 그리드 아틀라스를 수집합니다. 연속 절편에서 미토콘드리아를 단층 촬영 수집 대상으로 선택하고, 각 대상에 대해 축 A에서 2도 증분으로 음의 60도에서 양의 60도까지 기울기 시리즈를 획득합니다.마지막으로 두 번째 틸트 시리즈를 수집합니다. 시편 홀더를 90도 회전합니다. 새로운 아틀라스를 획득하세요.해당 위치를 선택하고 각 대상에 대해 축 B에서 틸트 시리즈를 획득합니다. 이 방법을 사용하여 미토콘드리아의 전체 부피를 포괄하는 연속 절편에서 2D 현미경 및 3D 단층 촬영을 생성했습니다. 결합된 직렬 단면 단층촬영은 z축이 수직으로 표시된 세로 단면을 생성하도록 투영됩니다.연속 절편 전자 단층 촬영은 에너지 상태와 노화를 반영하는 미토콘드리아 크리스테의 구조적 특징을 분석하기 위해 적용되었습니다. 미토콘드리아 전자 단층 촬영 재구성의 슬라이스는 z축을 통한 얇은 판막 사이의 스위치를 보여줍니다. 3D에서 왼손잡이 나선을 보여주는 단층 촬영 분할.Cristae 스위칭 패턴을 분석하고 세분화 모델에서 색상을 렌더링했습니다. 단층 촬영 절편은 크리스테 막(cristae membranes)을 가로지르는 측면 기질 포화도를 보여줍니다. 측면 매트릭스 포화도와 대표 크리스테를 보여주기 위해 단층촬영에 대한 분할 모델이 생성되었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 3차원의 세포 구조를 연구하는 데 적합할 수 있는 연속 절편 전자 단층 촬영을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

근육 손상을 기본 메커니즘의 확인이 중요합니다. 여기 파라핀 - 임베디드 및 Drosophila 흉부 근육의 부분을 냉동을 준비 histological 기술을 제시한다. 이것은 근육 형태학 및 단백질 및 기타 근육 세포 구성 요소의 로컬 리 제이션의 분석이 가능합니다.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

이 보고서는 Drosophila Larvae의 신경근 접합부를 시각화하기 위한 새로운 샘플 준비 절차를 제공합니다. 이 방법은 기존 방법에 비해 샘플의 말림을 방지하는 데 더 효과적이며 초파리 신경근 접합부 초구조 분석에 특히 유용합니다.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

초파리는 근발생의 기본 메커니즘을 이해하는 강력한 모델입니다. 흉부 반절편 절편을 해부 및 준비하기 위한 이 프로토콜은 번데기 및 성인 단계 모두에서 간접 비행 근육의 현미경 분석을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세포 형태, 단백질 국소화, 근육 구조 및 근형성의 기타 여러 측면의 공초점 이미징을 가능하게 합니다.

현미경 접근을 위한 Drosophila melanogaster 간접 비행 근육의 해부

배우세요 직렬 섹션 전자 단층 촬영법을 사용하여 Drosophila 간접 비행 근육의 미토콘드리아 초미세 구조를 3차원으로 분석하는 방법을. 이 기술은 세포 초미세 구조와 기능 관계 연구에 필수적입니다.

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

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