3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

이 비디오의 전반적인 목표는 초파리 간접 비행 근육의 미토콘드리아 미세 구조를 연구하기 위해 연속 절편 전자 단층 촬영의 적용을 결정하는 것입니다. 이 방법은 구조 세포 생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 미토콘드리아와의 구조 및 기능적 관계에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 미세 구조가 3차원으로 드러난다는 것입니다.

실험을 시작하기 위해 5개의 Drosophola 표본을 얼음 위에서 마취하고 각 파리를 인산염 완충액에 있는 4% 저용융 아가로스 1밀리리터에 담그십시오. 아가로스가 얼음 위에서 굳어지도록 합니다. 그런 다음 진동 블레이드 마이크로톰을 사용하여 아가로스 젤이 포함된 드로소포라를 100마이크로미터 두께의 조각으로 절단합니다.

영점 1몰 인산염 완충액에 2.5%글루타르알데히드가 포함된 고착 용액에 슬라이스를 담그십시오. 인산염 완충액 3방울로 조직 절편을 세척한 다음 20% BSA가 함유된 인산염 완충액 2방울로 세척합니다. 고압 동결을 위해 금 캐리어 또는 HPF에 절편을 넣고 버퍼와 20%BSA로 채웁니다.

다음으로, 캐리어가 들어있는 샘플을 사용 설명서에 따라 고압 냉동고에 넣습니다. 동결 후 액체 질소 하에서 홀더에서 캐리어를 분리하고 섭씨 영하 140도로 냉각된 자유 치환 장치로 옮깁니다. 아세톤에 글루타르알데히드 2%, 테트록사이드 오스뮴 2%, 우라닐 아세테이트 0.1%를 함유한 FS 칵테일로 자유 대체 프로토콜을 수행합니다.

실온에서 수지에 표본을 삽입합니다. 그런 다음 수지를 섭씨 65도에서 16시간 동안 중합합니다. 시편 블록을 잘라 조직이 포함된 원하는 블록 면이 노출되도록 합니다.

다음으로, 10나노미터 금 입자를 1% BSA로 30분 동안 전처리합니다. 금 입자를 세척하여 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 현탁시킵니다. 탄소 필름으로 코팅된 구리 슬라이드 그리드에 금 입자를 오버레이하여 기준 마커를 만듭니다.

초박 절편을 사용하여 200-250나노미터 두께의 연속 절편을 절단합니다. 그런 다음 얇은 섹션에 대한 완벽한 루프를 사용하여 슬롯 그리드의 직렬 섹션을 수집합니다. Reynolds lead citrate로 섹션을 10분 동안 염색합니다.

섹션 상단에 기준 금 입자의 두 번째 층을 오버레이합니다. 그리드를 이중 축 단층 촬영 홀더에 로드하고 200k볼트에서 작동하는 투과 전자 현미경에 삽입합니다. 유센트릭 초점에 현미경을 정렬합니다.

자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정하고, 멀티스케일 이미징 설정에서 전자빔을 조정 및 정렬하고, 단층 촬영 수집 설정에서 탄소 필름이 없는 빈 공간에서 카메라의 어둡고 밝은 기준을 획득합니다. 다음으로, 저배율에서 그리드 아틀라스를 수집합니다. 연속 절편에서 미토콘드리아를 단층 촬영 수집 대상으로 선택하고, 각 대상에 대해 축 A에서 2도 증분으로 음의 60도에서 양의 60도까지 기울기 시리즈를 획득합니다.

마지막으로 두 번째 틸트 시리즈를 수집합니다. 시편 홀더를 90도 회전합니다. 새로운 아틀라스를 획득하세요.

해당 위치를 선택하고 각 대상에 대해 축 B에서 틸트 시리즈를 획득합니다. 이 방법을 사용하여 미토콘드리아의 전체 부피를 포괄하는 연속 절편에서 2D 현미경 및 3D 단층 촬영을 생성했습니다. 결합된 직렬 단면 단층촬영은 z축이 수직으로 표시된 세로 단면을 생성하도록 투영됩니다.

연속 절편 전자 단층 촬영은 에너지 상태와 노화를 반영하는 미토콘드리아 크리스테의 구조적 특징을 분석하기 위해 적용되었습니다. 미토콘드리아 전자 단층 촬영 재구성의 슬라이스는 z축을 통한 얇은 판막 사이의 스위치를 보여줍니다. 3D에서 왼손잡이 나선을 보여주는 단층 촬영 분할.

Cristae 스위칭 패턴을 분석하고 세분화 모델에서 색상을 렌더링했습니다. 단층 촬영 절편은 크리스테 막(cristae membranes)을 가로지르는 측면 기질 포화도를 보여줍니다. 측면 매트릭스 포화도와 대표 크리스테를 보여주기 위해 단층촬영에 대한 분할 모델이 생성되었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 3차원의 세포 구조를 연구하는 데 적합할 수 있는 연속 절편 전자 단층 촬영을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.