전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

다음 실험의 전반적인 목표는 eis로 알려진 전기 전지 기질 임피던스 감지를 사용하여 세포 거동을 특성화하는 것입니다. 이는 어레이의 전극에서 세포를 성장시키고 다양한 모드에서 측정을 수행하여 내피 장벽 형성, 성숙 및 전기 상처 및 자극제 추가와 같은 기능 조작을 정량화한 다음 세포 운동성 및 장벽 기능을 테스트함으로써 달성됩니다. ESIS를 기반으로 세포 부착, 증식, 이동, 내피 투과성 검출 및 세포, 세포 및 세포 기질 접촉의 평가를 설명하는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 정량적 데이터의 온라인 생성을 제공하고 표준 세포 배양 조건에서 자연 합류 상태의 세포를 특성화하는 것과 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 기본 이론이 복잡해 보이고 실험을 시작하기 전에 몇 가지 기본 고려 사항을 알고 있어야 하기 때문에 어려움을 겪습니다. 시작하려면 전극 드리프트를 방지하고 재현성을 개선하며 신호 강도 비율을 높이기 위해 어레이를 청소하고 안정화해야 합니다.

그러므로, 15분 후에 8개의 웰 어레이의 각 웰에 10 밀리몰 EL ine 200 마이크로리터를 첨가하고, 실온에서, 인산염 완충액이 아닌 2개의 초순수 세척제로 EL 시스틴을 제거한다. 또한 단백질 흡수를 방해할 수 있으므로 코팅하기 전에 전극을 혈청 함유 용액에 노출시키지 마십시오. 다음으로, 200마이크로리터의 데워진 1% 젤라틴을 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 어레이를 배양합니다.

젤라틴을 제거하려면 초순수를 사용하고 전극 표면이 마르지 않도록 하십시오. 그런 다음 이제 혈청을 포함할 수 있는 400마이크로리터의 완전한 배양 배지로 웰을 채웁니다. 어레이를 홀더에 로드합니다.

아홉 개의 금색 사각형을 확인하세요. POGO 핀에 연락해야 합니다. 어레이를 손으로 조심스럽게 제자리에 고정하고 컴퓨터의 조정 나사를 조입니다.

측정 소프트웨어를 엽니다. 설정을 누른 다음 데이터 수집 섹션에서 확인하여 기본 주파수인 4, 000Hz에서 각 웰의 빠른 임피던스 측정을 수행합니다. 값은 의견 섹션에 저장됩니다.

검사에서 배열 다이어그램의 웰 구성 섹션에서 사용 중인 EIS 어레이 유형을 정확하게 선택했는지 확인합니다. 빨간색과 녹색은 연결의 기능을 나타냅니다. 클리닝 및 코딩이 성공적이었다면, 8개의 W1E시스 어레이는 약 5 내지 6개의 나노패러드와 8개의 W10 E 어레이를 등록해야 한다.

따라서 세포 파종 전 50-60 나노 패럿 기준선 저항은 약 2000 옴입니다. RB 알파 및 cm을 사용하여 데이터를 모델링하려면 중간 실패 어레이로 MFT 기록을 시작합니다. cell-free 데이터를 15분 동안 취하여 세포를 추가하는 실험을 마칩니다.

이제 어레이를 제거하고 각 웰에 400마이크로리터의 단일 세포 현탁액을 파종합니다. 세포 성장 씨를 공부하기 위하여는, 거의 합류하는 인구 씨, 60 의 평방 센티미터 당 000의 세포로 시작하는 평방 센티미터 당 000의 세포. 어레이를 홀더에 로드한 후 well configuration 섹션에서 측정할 well을 선택합니다.

그런 다음 데이터 수집 옵션으로 이동하여 고정 주파수에서 시계열에 대한 측정 모드를 선택하고 SFT를 선택한 다음 전극 커버리지를 측정할 측정 주파수를 선택하고 RB 및 알파를 모델링하고 MFT를 선택하면 장치가 사용 가능한 모든 주파수에서 자동으로 측정을 수행합니다. 가능할 때마다 다중 주파수 모드에서 측정을 실행하십시오. 이를 위해서는 사용 가능한 모든 빈도의 데이터가 필요하므로 대부분의 통찰력을 얻을 수 있습니다.

마이크로 모션 분석의 경우 RTC를 선택하고 샘플링 주파수를 조정합니다. 표준 시간 분해능은 1헤르츠이지만 임피던스의 빠른 변화를 추적하기 위해 높일 수 있습니다. z 세타에 대해 값을 25헤르츠로 늘릴 수 있습니다.

여러 웰에서 마이크로 모션을 순차적으로 측정하려면 도움말 메뉴를 선택하십시오. 그런 다음 show expert toolbar menu items(전문가 도구 모음 메뉴 항목 표시)를 선택하고 다중 웰 RTC를 획득합니다. collect data(데이터 수집) 섹션에서 시간 제한을 시간 단위로 지정해야 합니다.

이 설정을 사용할 때 소프트웨어는 데이터 수집이 시작된 후 사이클 수를 묻는 메시지를 표시합니다. SFT 또는 MFT를 사용하여 데이터를 수집하는 경우 초 단위로 지정된 측정 사이의 시간 간격을 선택합니다. 최대 데이터 수집을 위해 이 옵션을 선택하지 않은 상태로 두십시오.

이제 시작을 누르고 데이터를 저장할 위치를 지정합니다. finish를 눌러 실행이 중지됩니다. pause를 누르면 데이터 수집이 중지되지만 실험 시계는 계속 실행됩니다.

이제 어레이를 제거하고 층류 후드 아래에서 우물을 조작합니다. 어레이를 홀더에 반환한 후 연결 확인을 클릭하여 전기 연결을 확인한 다음 실험을 다시 시작하여 데이터 수집을 계속합니다. 조작 후 세포를 멸균할 필요가 없는 경우, 데이터 수집 중에 트롬빈과 같은 자극을 웰에 직접 추가할 수 있습니다.

이렇게 도입된 변형은 mark를 누르고 주석을 추가하여 실험 시계에 표시할 수 있습니다. 또 다른 옵션은 세포를 전기적으로 감는 것입니다. 이에 대한 설정은 짧은 상처 시간을 얻기 위해 약간의 조정이 필요하며 너무 길면 효과적이지 않으며 전극이 손상될 수 있습니다.

소프트웨어가 제공하는 기본 설정으로 시작하여 거기에서 시작하십시오. The wound electro parade setup section(상처 일렉트로 퍼레이드 설정) 섹션으로 이동하여 wound를 활성화합니다. 이제 웰 구성에서 감을 웰을 선택합니다.

확인된 우물만 부상을 입게 됩니다. 활성화를 클릭하면 부상 여부를 묻는 팝업 창이 나타납니다. 상처를 입은 후 신호가 거의 셀이 없는 전극 값으로 떨어지는지 확인하십시오.

데이터 작업을 위해 일반적으로 상처를 반복하지 않은 경우 데이터 내보내기 옵션을 사용하고 Excel로 선택합니다. 그러나 RB 및 알파 모델링은 소프트웨어 내에서 수행할 수 있습니다. MFT 데이터에서 모델링은 confluence cell layers에서만 유효하다는 점을 기억하십시오.

그리고 셀 없는 참조를 추가하는 것을 잊지 마십시오. 먼저 Frequency Scan Modeling and Analyze(주파수 스캔 모델링 및 분석) 섹션의 find 함수를 사용하여 무세포 참조를 자동으로 선택합니다. set을 사용하여 값을 수락합니다.

그런 다음 모델을 눌러 계산을 시작합니다. 이 작업에 몇 분이 걸리더라도 놀라지 마십시오. 일반적인 실험에서 세포는 성장 단계에서 안정기로 이동합니다.

합류점에 도달하면 이 과정에서 전극에서 직접 이미지가 획득됩니다. 다음 단계는 EC 장벽의 형성 및 성숙입니다. 그런 다음 전기 상처를 사용하여 세포 이동을 연구합니다.

신호가 기준선으로 특징적으로 떨어지면 합류 상태가 다시 설정됩니다. 마지막으로, 자극에 대한 반응을 실시간으로 추적한다. 여기서, 혈관 활성 제제인 트롬빈(thrombin)을 적용하였다.

이로 인해 세포 수축이 발생하여 장벽의 작은 틈이 일시적으로 열렸고, 이로 인해 임피던스 저항이 떨어졌으며 커패시턴스 측정은 가장 민감한 측정에서 셀 접착 및 성장 저항에 대한 무료 정보를 제공합니다. 주파수는 세포 장벽의 품질과 기능을 나타내며 paracellular 및 transcellular Current flow에 대한 저항을 고려합니다. 셀이 전극에 부착되면 전류 흐름이 제한되고 커패시턴스가 비례적으로 떨어집니다.

이 단계는 전극 커버리지의 전반적인 측정을 제공하며 40kW보다 높은 주파수에서 커패시턴스를 기록할 때 가장 잘 정량화됩니다. 저항은 좋은 세포가 어떻게 전류 흐름을 차단할 수 있는지, 따라서 세포 장벽의 품질을 어떻게 차단할 수 있는지에 대한 명확한 아이디어를 제공합니다. 따라서 서로 다른 계대와 다른 유형의 세포는 서로 다른 저항을 가지고 있습니다.

RB와 알파는 세포 세포와 세포 기질 부착을 구별하는 데 도움이 됩니다. RB는 전류 흐름에 대한 세포 세포 접촉의 저항률 또는 투과성의 역 측정입니다. 알파는 세포 전극 접합부의 임피던스 기여도를 측정

RB 및 알파 값은 모두 ISIS 소프트웨어 내에서 계산할 수 있습니다. 저항 신호의 작은 변동은 합류 세포층의 미묘한 움직임 또는 마이크로 움직임으로 인한 것일 수 있습니다. 가장 민감한 주파수에서 하나의 E 어레이로 측정할 수 있으며 EIS 내에서 빠른 푸리에 변환으로 분석할 수 있으며, 세포 거동에 대한 통찰력을 제공하는 소프트웨어 조작을 정밀하게 수행할 수 있습니다.

예를 들어, 세포 이동을 연구하기 위해 몇 시간 내에 닫히는 250미크론의 전기 상처를 만들 수 있습니다. 임피던스 분광법은 또한 첨가된 물질의 영향을 분석하는 데 적합합니다. 앞서 언급했듯이 트롬빈은 ARO 키나아제 억제제로 기저세포 장력을 낮춰 세포 장벽을 과투과성으로 만들며, 트롬빈의 효과는 감소할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 ESIS는 온도, pH, 중간 고갈 등과 같은 세포 환경의 변화에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후. 이 기술은 ology 분야의 연구자들이 합류 세포 배양에 대한 혈관 활성 물질의 추세와 효과를 실시간으로 연구할 수 있는 길을 열었습니다.