전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

다음 실험의 전반적인 목표는 전기 세포 기질 임피던스 센싱(electric cell substrate impedance sensing, ECIS)을 사용하여 세포 행동을 특성화하는 것입니다. 이는 전극 어레이 상에서 세포를 배양하고 다양한 모드에서 측정함으로써 혈관 내피 세포 장벽의 형성, 성숙 및 기능을 정량화함으로써 달성됩니다. 이후 전기적 손상 유도 및 자극제 첨가와 같은 조작을 통해 세포 운동성과 장벽 기능을 테스트합니다. 이를 통해 ECIS를 기반으로 세포 부착, 증식, 이동, 혈관 내피 투과성 검출, 그리고 세포-세포 및 세포-기질 접촉 평가에 대한 결과를 얻습니다.

이 방법은 표준 세포 배양 조건에서 세포의 자연스러운 합류 상태를 특성화하고 정량적 데이터를 실시간으로 생성하는 등, 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 기초 이론이 복잡해 보이고 실험 시작 전 몇 가지 기본적인 고려 사항을 숙지해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 전극 드리프트를 방지하고 재현성을 높이며 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 어레이를 세척하고 안정화해야 합니다.

따라서 8-웰 어레이의 각 웰에 10 millimolar EL ine 200 microliters를 첨가합니다. 상온에서 15분 후, 인산염 완충액이 아닌 초순수로 두 번 세척하여 EL cystine을 제거합니다. 또한, 코팅 전에는 전극을 혈청 함유 용액에 노출시키지 마십시오. 혈청 성분이 단백질 흡착을 방해할 수 있기 때문입니다. 다음으로, 가온된 1% gelatin 200 microliters를 각 웰에 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 어레이를 배양합니다.

젤라틴을 제거하려면 초순수를 사용하고 전극 표면이 마르지 않도록 주의하십시오. 그 후, 혈청이 포함될 수 있는 완전 배지 400 µL를 웰에 채웁니다. 어레이를 홀더에 장착하십시오.

9개의 금색 사각형을 확인하십시오. 이 사각형들은 POGO 핀과 접촉해야 합니다. 컴퓨터에 있는 조절 나사를 조여 배열이 제자리에 고정되도록 손으로 조심스럽게 고정하십시오.

측정 소프트웨어를 엽니다. 설정(set up)을 누른 다음 데이터 수집(collect data) 섹션에서 기본 주파수인 4,000 hertz로 각 웰의 임피던스를 빠르게 측정하도록 선택합니다. 측정값은 비고(comments) 섹션에 저장됩니다.

어레이 다이어그램의 웰 구성 섹션에서 사용 중인 EISs 어레이 유형이 정확하게 선택되었는지 확인하십시오. 빨간색과 녹색은 연결의 기능 상태를 나타냅니다. 세척과 코딩이 성공적으로 이루어졌다면, 8개의 W 1 E sys 어레이는 약 5~6 NANOFARAD로 측정되어야 하며, 8개의 W 10 E 어레이도 마찬가지입니다.

세포 파종 전 50에서 60 nanofarad의 기저 저항은 약 2000 ohms입니다. RB alpha 및 cm를 사용하여 데이터를 모델링하려면, medium failed array로 MFT 기록을 시작하십시오. 세포가 없는 상태에서 15분 동안 데이터를 수집한 후, 실험을 종료하고 세포를 추가하십시오.

이제 어레이를 제거하고 각 웰에 400 µL의 단일 세포 현탁액을 분주합니다. 세포 성장을 연구하려면 cm²당 10,000 cells를 분주하고, 거의 합류된(confluent) 상태의 세포군으로 시작하려면 cm²당 60,000 cells를 분주하십시오. 홀더에 어레이를 장착한 후, 웰 구성(well configuration) 섹션에서 측정할 웰을 선택합니다.

그 다음 데이터 수집 옵션으로 이동하여 고정 주파수 시계열을 위한 측정 모드를 선택합니다. 전극 피복도와 RB 및 alpha 모델을 측정하기 위한 측정 주파수를 선택하려면 SFT를 선택하고, MFT를 선택하면 장치가 사용 가능한 모든 주파수에서 자동으로 측정을 수행합니다. 가능한 경우 항상 다중 주파수 모드로 측정을 실행하십시오. 이 모드는 사용 가능한 모든 주파수의 데이터를 필요로 하며, 이를 통해 가장 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

미세 움직임 분석을 위해 RTC를 선택하고 샘플링 주파수를 조정하십시오. 표준 시간 분해능은 1 Hz이지만, 임피던스의 빠른 변화를 추적하기 위해 높일 수 있습니다. z theta의 경우 이 값을 25 Hz까지 높일 수 있습니다.

여러 웰에서 순차적으로 미세 움직임을 측정하려면 도움말 메뉴를 선택하십시오. 그런 다음 전문가 도구 모음 메뉴 항목 표시를 선택하고 acquire 및 multi-well RTC를 선택하십시오. 데이터 수집 섹션에서 시간 제한을 시간 단위로 반드시 지정하십시오.

이 설정을 사용하면 데이터 획득이 시작된 후 소프트웨어에서 사이클 수를 입력하라는 메시지가 표시됩니다. SFT 또는 MFT를 사용하여 데이터를 수집할 때는 초 단위로 지정된 측정 간 시간 간격을 선택하십시오. 최대 데이터 획득을 위해서는 이 옵션을 선택 해제한 상태로 두십시오.

이제 시작(start) 버튼을 누르고 데이터가 저장될 위치를 지정하십시오. 종료(finish) 버튼을 누르면 실행이 중단됩니다. 일시정지(pause) 버튼을 누르면 데이터 수집은 중단되지만, 실험 시계는 계속 작동합니다.

이제 어레이를 제거하고 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서 웰을 조작하십시오. 어레이를 홀더에 다시 장착한 후, 'check connection'을 클릭하여 전기 연결 상태를 확인하고 'resume experiment'를 클릭하여 데이터 수집을 계속합니다. 조작 후 세포의 무균 상태를 유지할 필요가 없다면, 데이터 획득 중에 thrombin과 같은 자극제를 웰에 직접 첨가할 수 있습니다.

이렇게 도입된 변수는 mark를 누르고 코멘트를 추가하여 실험 시계에 표시할 수 있습니다. 또 다른 옵션은 세포에 전기적 상처를 입히는 것입니다. 이 설정의 경우, 너무 짧은 상처 생성 시간으로는 적절한 효과를 얻기 위해 세밀한 조정이 필요하며, 너무 길어지면 효과가 없을 뿐만 아니라 전극이 손상될 수 있습니다.

소프트웨어에서 제공하는 기본 설정으로 시작하여 진행하십시오. 상처 전기 패러드(wound electro parade) 설정 섹션으로 이동하여 wound 기능을 활성화하십시오. 이제 웰 구성(well configuration)에서 상처를 낼 웰을 선택하십시오.

체크된 웰만 상처를 입힙니다. 'activate'를 클릭하면 상처 유도를 위한 팝업 창이 나타납니다. 상처 유도 후, 신호가 거의 세포가 없는 전극의 값까지 떨어지는지 확인하십시오.

데이터 작업을 위해 상처 입히기 과정이 일반적으로 반복되지 않았다면, 데이터 내보내기 옵션을 사용하여 Excel을 선택하십시오. 하지만 RB 및 alpha 모델링은 소프트웨어 내에서 수행할 수 있습니다. MFT 데이터의 경우, 모델링은 합류성 세포층(confluence cell layers)에서만 유효하다는 점에 유의하십시오.

그리고 무세포 기준점(cell-free reference)을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 주파수 스캔 모델링 및 분석 섹션의 찾기 기능을 사용하여 무세포 기준점을 자동으로 선택하는 것부터 시작하십시오. 설정(set)을 통해 해당 값을 적용하십시오.

다음으로 모델 버튼을 눌러 계산을 시작하십시오. 계산 완료까지 수 분이 소요될 수 있으나 이는 정상적인 과정입니다. 일반적인 실험 과정에서 세포는 성장기에서 정지기로 진입합니다.

세포가 합류(confluence)에 도달하면, 이 과정 동안 전극에서 직접 이미지를 획득합니다. 다음 단계는 EC 장벽의 형성 및 성숙 단계입니다. 이후 세포 이동을 연구하기 위해 전기적 상처(electrical wounding) 기법이 사용됩니다.

신호가 기저선까지 특징적으로 감소한 후, 다시 합류 상태가 회복됩니다. 마지막으로, 자극에 대한 반응을 실시간으로 관찰합니다. 여기서는 혈관 활성 제제인 thrombin을 처리하였습니다.

이로 인해 세포 수축이 발생하고 그 결과 장벽에 일시적인 작은 틈이 생기며, 이는 임피던스 저항의 하락을 유발합니다. 커패시턴스 측정은 가장 민감한 측정 시점에서 세포 접착 및 성장 저항에 대한 보완적인 정보를 제공합니다. 주파수는 세포 장벽의 품질과 기능을 나타내며, 세포 간(paracellular) 및 세포 내(transcellular) 전류 흐름에 대한 저항을 고려합니다. 세포가 전극에 부착되면 전류 흐름이 제한되며 커패시턴스가 이에 비례하여 감소합니다.

이 단계에서는 전극 피복도의 전반적인 측정이 이루어지며, 40 kilohertz보다 높은 주파수에서 커패시턴스를 기록할 때 가장 정확하게 정량화할 수 있습니다. 저항은 세포가 전류 흐름을 얼마나 잘 차단하는지를 명확하게 보여주며, 따라서 세포 장벽의 품질을 나타냅니다. 그러므로 계대 배양 횟수나 세포 종류가 서로 다른 세포들은 각기 다른 저항값을 가집니다.

본 연구의 RB 및 alpha는 세포-세포 접합과 세포-기질 접합을 구분하는 데 도움을 줍니다. RB는 전류 흐름에 대한 세포-세포 접합의 저항성 또는 투과성의 역측정값입니다. Alpha는 세포-전극 접합부에서 발생하는 임피던스 기여도를 측정하는 지표입니다.

RB 값과 alpha 값 모두 ISIS 소프트웨어 내에서 계산할 수 있습니다. 저항 신호의 작은 변동은 confluence 세포층의 미세한 움직임이나 마이크로 모션으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 변동은 가장 민감한 주파수에서 하나의 E 어레이로 측정할 수 있으며, EIS 소프트웨어 내의 고속 푸리에 변환(fast Fourier transformation)을 통해 분석함으로써 세포 행동에 대한 통찰력을 정밀하게 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 세포 이동을 연구하기 위해 몇 시간 내에 폐쇄되는 250 micron 크기의 전기적 상처를 만드는 것이 가능합니다. 임피던스 분광법은 첨가된 물질의 효과를 분석하는 데에도 매우 적합합니다. 앞서 언급했듯이, thrombin은 기초 세포 장력을 낮추어 세포 장벽을 과투과성으로 만들며, ARO kinase inhibitor를 통해 thrombin의 효과를 감소시킬 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 ESIS는 온도, pH, 배지 고갈 등과 같은 세포 환경의 변화에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 이후, 이 기술은 혈관학 분야의 연구자들이 혈관 활성제의 경향과 효과를 합류 세포 배양에서 실시간으로 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.