Name: 전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 배우세요 ECIS 기술을 활용하여 내피 세포의 증식, 운동성 및 장벽 기능을 실시간으로 정량화하는 방법입니다. 이 기법은 세포 부착, 이동, 손상 회복 및 화학적 자극 반응을 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다.

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저자는 자신의 조언을 찰스 박사 Keese 박사 기독교 Renken, 기독교 Dehnert (응용 생물 물리학 주) 박사 울프 위 Radler (ibidi GmbH에) 감사 도움이 원고를 준비하는 동안 유익한 토론 것이다. 또한 우리는 자신의 우수한 기술 지원을 위해 얀 반 Bezu에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 측정 시스템의 준비 <ol><li> 결로를 방지하기 위해 실험을 시작하기 전에 37 ° C에 인큐베이터에있는 어레이 홀더를 Prewarm. </li><li> 우물의 건조를 방지하기 위해 증류수로 인큐베이터의 물을 관을 입력합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 층류 캐비닛에 세포와 배열에 대한 모든 조작을 수행합니다. </li></ol> 2. 세포의 배열과 예방 접종의 준비 NOTE : ECIS 배열 잘 투 아니라 재현성 및 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해, 전극 드리프트를 방지하기 위해 실험 전에 세정하고 안정화시킬 필요가있다. 따라서 두 가지 옵션을 사용할 수 있습니다 : L-시스테인과 B) ECIS의 안정화 기능을 가진 전극 A) 전처리. 옵션 A : L-시스테인은 가장 일관된 전처리로 추천하지만, 일부 특별한 경우 단백질로 코팅과 상호 작용할 수 있습니다전극에 GS. 제시 볼륨은 표준 8 잘 배열에 사용됩니다. <ol><li> 200 μL / 잘 된 10 mM의 L-시스테인을 추가합니다. 시스테인은 청소하고 높은 재현성 전극 용량을 제공하는 전극면을 수정한다. </li><li> 실온 (RT)에서 15 분 알을 품다. </li><li> 초순수 (유형 1)로 두 번 500 μL / 잘 씻으십시오. 일부 단백질의 흡착을 방해 할 수있는 인산염 버퍼를 사용하지 마십시오. 금 표면이 접촉 가져온 최초의 거대 분자를 흡착 때문에 또한, 코팅 전에 혈청이 포함 된 용액을 피하십시오. </li><li> 200 μL / 잘 따뜻한 1 % 젤라틴과 코트. </li><li> 37 ℃에서 30 분 알을 품다 </li><li> 젤라틴을 제거 할 수 있지만 표면을 건조하게하지 않는다. 이 전극을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 초순수 (유형 1)에 한 번 씻으십시오. </li><li> (혈청, 항생제와 모든 성장 인자를 포함) 400 μL / 잘 완전한 세포 배양 매체를 추가합니다. </li><li> 어레이 홀더에 슬라이드 배열D 배열이 금 9 평방 패드가 제대로 스프링이 장착 된 포고 핀 및 수정 조정 나사를 손으로 꽉 연락을되도록 배치되어 있는지 확인합니다. 투명 배열에주의, 금 층은 쉽게 손상 될 수 있습니다. </li><li> 각각의 잘의 빠른 임피던스 측정을 수행 할 &quot;데이터 수집&quot;섹션에서 확인 다음에 측정 소프트웨어를 눌러 설정을 엽니 다. 결과 값은 측정 기준이며 자동 &quot;설명&quot;에 저장 될 것이다. </li><li> 잘 요금 자동 사용 ECIS 어레이의 유형을 결정한다. &quot;잘 구성&quot;절에서 선택한 배열을 확인합니다. </li><li> 배열도 비어 있거나 잘못 연결된 우물 제대로 연결 우물을위한 녹색과 빨간색으로 점등됩니다. 그러나 항상 배열이 홀더에 올바르게 배치되었는지 확인합니다. 참고 : 청소 및 코팅이 성공한다면 8W1E ECIS 배열은 교류가약 5 NF 각각 2,000과 200 Ω의 기준 저항 결과 50 NF,,의 8W10E 배열 apacitance. </li><li> 홀더에서 배열을 제거합니다. </li><li> 400 μL / 웰 완전한 세포 배지에서 단일 세포 현탁액으로서 종자 세포. </li></ol> 옵션 B : 전극 드리프트 또는 잘 - 투 - 웰 저항 및 커패시턴스의 큰 차이의 문제가 발생할 경우 ECIS의 안정화 기능은 L-시스테인 치료 대안 또는 조합으로 사용될 수있다. <ol><li> 단백질 (선택 사양)과 시스테인 처리 (옵션) 및 프리 코팅 전극을 수행합니다. </li><li> 각 웰에 완전 배지 200 μL / 잘을 추가하고 배열 ​​홀더에 배열을 배치합니다. </li><li> 배열을 확인하기 위해 체크 한 다음 열기 측정 소프트웨어를 눌러 설치 C.에게 제대로 연결되어 초기 Z, R을 측정하고, </li><li> 눌러 전극을 안정 <strong&gt; &quot;데이터 수집&quot;섹션에서 안정. ECIS는 전극을 청소하는 높은 전류 (CA. 3mA), 높은 주파수 (64 kHz에서) 펄스를 적용합니다. </li><li> 다시 전극을 확인한다. 정전 용량은 증가되어야하고, 저항 값은 비교 가능한 범위에 있어야한다. </li><li> 정전 용량 및 저항 값이 여전히 만족하지 않는 경우, 안정화를 반복합니다. </li><li> 홀더에서 배열을 제거하고 세포를 접종. </li></ol> 3. 측정 소프트웨어 및 데이터 수집을 설정 <ol><li> 전술 한 바와 같이 배열 홀더에 배열을 놓습니다. </li><li> 열기 측정 소프트웨어와 ECIS 악기에 ECIS 소프트웨어를 연결하고 잘 확인 다른를 실행하려면 &quot;데이터 수집&quot;섹션에서 설정 버튼을 누릅니다. </li><li> &quot;잘 구성&quot;절에서 선택한 배열을 확인합니다. </li><li> &quot;잘 구성 오 측정 할 수있는 우물을 선택이온 &quot;절을 참조하십시오. </li><li> &quot;데이터 수집&quot;옵션 측정 모드를 선택합니다 : <ol><li> 고정 주파수에서 시계열은 단일 주파수를 선택합니다. / 시간 (SFT)와 드롭 다운 메뉴에서 측정 주파수를 선택합니다. </li><li> 전극 범위 및 Rb 및 알파의 모델링의 측정을 위해 여러 개의 주파수를 선택합니다. / 시간 (MFT). ECIS 장치는 사용 가능한 모든 주파수에서 자동으로 측정됩니다. </li><li> 미세 운동 내용 (데이터 분석 참조) 래피드 시간 (RTC)을 상환 선택 측정 주파수 및 샘플링 주파수를 조정한다. 여기에 표준 시간 해상도는 초 (1 Hz에서) 당 하나의 샘플입니다 만, 샘플링 주파수는 (Z-세타의 경우) 25 Hz에서 최대 임피던스의 빠른 변화를 추적하기 위해 증가 될 수있다. 중요 : RTC 모드에서 단일 잘 측정된다. 참고 : 미세 운동 이후 여러 우물에서 측정해야 할 경우, 도움말로 이동합니다&gt; 쇼 전문 도구 모음 / 메뉴 항목&gt; ACQuire&gt; 다 음 RTC. 데이터 수집 섹션에서 제한 시간 (시간)을 지정, ECIS는 지금 숫자 순으로 선택한 우물을 측정 할 것입니다. 측정을 시작하면 소프트웨어는 사이클의 수를 지정하는 요청합니다. 측정을 반복해야하는 빈도에 대한 값을 입력합니다. </li></ol></li><li> SFT 및 MFT를 들어, 측정 또는 사이의 시간 간격 (초)을 선택 데이터가 가능한 한 빨리이 옵션을 선택하지 취득해야합니다. 참고 : ECIS 장치가 최소 SFT 수집 0.25 초의 속도와 MFT 7.5 초 잘 하나에서 다른 전환하는 멀티플렉서를 사용하여 데이터를 수집. 간격을 의미하는 것은 선택 우물과 주파수의 수에 따라 달라집니다. 천천히 증식하는 세포에 대한 측정 또는 시간 대 저항의 간단한 기록을 위해, 600 초 이상의 간격을 사용합니다. </li><li> 시작을 눌러, 파일의 이름 및 데이터를 저장할 위치를 선택한다. 참고 : 파일 크기는 홍보해서는 안oblem, ECIS 데이터도 모든 측정 주파수와 선택 우물의 수와 수백 MB를 초과하지 않습니다 *. ABP라는 일반 텍스트 형식의 종류에 저장되어 있기 때문에. </li><li> 마침을 눌러 실행 중지합니다. </li></ol> 4. 중간 변경 및 세포 조작 <ol><li> 보도 일시 정지,이 데이터 수집을 중지하지만, 실험적인 시계를 계속 실행됩니다. </li><li> 홀더에서 배열을 제거하고 층류 벤치 (즉, 변경 중) 아래를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 다시 홀더에 배열을 배치하고 연결을 확인하거나 데이터 수집을 계속하는 실험을 다시 시작을 클릭하거나. 측정 소프트웨어는 데이터 세트의 시간 마크를 배치한다. </li></ol> 5. 데이터 수집 중 급성 자극 참고 : 두 번째 옵션은 즉시 변경 사항을 수행하는 데이터 수집 동안 세포를 조작하는 것입니다. 에만 가능; 샘플은 실험의 추가 과정에서 멸균 될 필요가 없을 때. <ol><li> 직접 우물에 자극을 추가하고 200 μL 피펫으로 혼합주의해야합니다. </li><li> 마크 시간 표시를 눌러 수동으로 포인트 댓글을 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 전기 부상 참고 : 사용 된 세포 유형에 대한 올바른 설정을 찾는 것은 전기 남긴 상처에 대한 열쇠입니다. 부상이 남긴 상처가 너무 오래 및 / 또는 거친면이 (특히 투명 배열)에 전극을 손상시킬 수있는 반면,이 세포의 불충분 한 제거 될 수 있습니다 너무 짧은 경우. 따라서, 여러 단편 남긴 상처 펄스 권장합니다. HUVEC 문화 60 kHz에서 5 V의 두 10 ~ 20 초 길이 남긴 상처 펄스는 각각 ECIS 1600R을 사용하여 최적의 발견되었습니다. 일반적으로 그것은 세포에 걸쳐 균일 한 높은 필드를 유지하고 전극의 손상을 방지하기 위해&gt; 20 kHz의 높은 주파수를 사용하는 것이 좋습니다. <ol><li> 지속 시간 부상 수행활성 ECIS 측정을 보내고. </li><li> 상처 / Electroporate 설정을 사용하고 상처를 클릭하고 시간 (초)을 작성 상처 전압 (1,600 R에 대한 V) 또는 전류 (Z와 Z-세타에 대한 μA) 및 주파수 (Hz). 카달로그 기본값 배열 ECIS 장치의 유형에 기초한다. </li><li> &quot;잘 구성&quot;절에 상처에 우물을 선택합니다. 만 확인 우물 부상 할 것입니다. </li><li> 시간까지 지연 활성화 및 지연 상처 기능을 활성화하기 위해 지연 시간을 입력합니다. 이 기능은 중지를 누르거나 수동으로 상처를 적용하여 언제든지 중지 할 수 있습니다. 하나의 지연 명령은 한 번에 활성화 될 수 있습니다. </li><li> 를 눌러 활성화 및 부상 시작하는 팝업 창에서 확인을 클릭합니다. </li><li> 그렇지 않으면 남긴 상처를 반복 저항 신호가 남긴 상처 후 오프셋 임피던스 삭제해야합니다. </li></ol> 7. 데이터 분석 </P&gt; <ol><li> 데이터 표현 및 수출. <ol><li> &gt; [파일] - [열기]를 통해 설정 마침 측정 데이터를 불러 오거나. </li><li> &quot;잘 구성&quot;창에서 표시 할 수있는 우물을 선택합니다. 평균을 제시하는 그룹의 개별 우물. </li><li> 상단 도구 모음 (Z, R 또는 C)에서 표시 할 매개 변수를 선택했다. </li><li> 상단 도구 모음 (T = 시간, F = 주파수, 3D = 폭포 오)에서 선택 그래프 유형. </li><li> 그래프 창 아래의 슬라이더 그래프 오프셋 범위를 정의하거나 인접 컨트롤에 정확한 값을 입력합니다. </li><li> 데이터의 평균 또는 정상화를 실행, 표준 편차를 수행 할 수있는 &quot;분석&quot;섹션의 기본 &quot;시간 시리즈 옵션&quot;을 선택했다. </li><li> Nyuist 플롯과 푸리에 변환과 같은 고급 작업에 대한 도움말 메뉴에서 전문가 도구 모음을 활성화합니다. </li><li> RA를 정의하는 &quot;분석&quot;절에 &quot;표시 옵션&quot;을 사용X 및 Y 축과 수출 그래프의 NGE. </li><li> 엑셀 (선택)&gt;를 필요에 따라 심층 분석, 통계 및 표현에 대한 선택의 제 3 자 소프트웨어를 사용 -&gt; 데이터 내보내기 - 내보내기 파일을 통해 엑셀 파일로 데이터를 선택했습니다. </li></ol></li><li> RB와 알파의 모델링. 참고 : 모델링 내용은 다음 참고 자료로 잘 못 셀 - 무료 매체를 사용하는 것이 좋습니다. <ol><li> 마침 MFT 측정 또는로드 MFT 데이터 세트. </li><li> 무 세포 참조 잘 사용할 키를 눌러 경우 자동으로 기준 값 또는 &quot;분석&quot;절에 &quot;주파수. 스캔 모델링&quot;에서 수동으로 무 세포 시점을 선택하는 설정을 선택 찾기 중 하나. </li><li> 제공된 무 세포 참조가 없으면, 다른 데이터 세트로부터 기준치를 가져. 참조 데이터 세트를 (같은 배열 및 매체가 사용되었는지 확인)를 열고 찾기 또는 기준 값을 선택하도록 설정합니다.그 후 측정 된 데이터와 키를 눌러 가져 오기로 이동합니다. </li><li> 가능한 사용에게 공장 출하시 기본 설정을하지 무 세포 참조 데이터가없는 경우. </li><li> 계산을 시작하기를 눌러 모델. 모델링은 데이터 세트의 크기에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미세 운동의 계산. 주 :이 계산은 측정 소프트웨어의 일부가 아니지만, 어떠한 신호 처리 소프트웨어로 수행 될 수있다. <ol><li> RTC 측정을 완료 또는 RTC 데이터 집합을로드합니다. </li><li> 전체 기간의 평균 저항에 의해 설정 데이터를 표준화. </li><li> 256 데이터 포인트의 길이 세그먼트로 설정 데이터를 분리 및 해닝 창에서 각각의 세그먼트를 청소합니다. </li><li> 랜덤 노이즈를 최소화하기 편면 129 포인트 파워 스펙트럼에 256 - 포인트 푸리에 변환하고 보통 얻어진 주파수 스펙트럼을 실행하고, 생체 신호를 강화. </li><li> 로그 - 로그 그래프 및 적용 진폭에 대한 플롯 주파수최소 제곱 선형 적합. </li><li> 선형 피팅의 기울기는 전체적인 신호에서 잡음 및 세포시켜 미세 운동의 척도이다. </li></ol></li></ol>

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ECIS는 셀 속성과 행동의 심사뿐만 아니라 알려진 알 수없는 물질의 효과를 정량화를위한​​ 훌륭한 도구입니다. 이에 세포가 표준 배양 조건에서 유지되며, 임피던스는 연속적으로 높은 시간 해상도로 모니터링하고 광 신호에 상관 될 수있다. 그 방법은 셀의 조작을위한 최적 시점은 형태 학적 및 기능적 셀 상태에 기초하여 선택 될 수있다. 불행하게도, 이러한 높은 측정 해상도는 온도, pH 또는 세포의 기계적 자극 (중간 변경)의 작은 변화가 즉시 임피던스 신호에 영향을 미칠 것 가격으로 제공됩니다. 세포에 작은 측정 전류의 응용 프로그램은 ECIS 측정은 비 침습적 비파괴 및 레이블이없는 만들지 만, 결과적으로 패시브 생체 전기 특성 (더 활동 전위)를 측정 할 수 없습니다. 주요 기능은 매개 변수의 수 데르 수 있다는 것입니다<html> 투과성 또는 상처 치유 분석법 같은 여러 고전 분석법로부터 정보를 결합, 단일 측정으로부터 ived. 여기에서 특히 흥미로운 점은 수학적으로 모델링 된 데이터가 저항 및 정전 용량의 변화를 탐구하고 서로 다른 세포 구조 (예를 들면 세포 연락처 또는 세포막)로를 참조하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 주의하는 것이 중요 임피던스 분광은 항상 하나의 세포에 대한 연구를 허용하고 또한 수학적 모델이 합류 세포층 만 유효하지 않습니다 감지 전극의 모든 세포에서 평균 신호를 제공하는 것입니다. 따라서 내피 세포는 이전에 성숙한 세포 유착과 정지 세포를 확인하기 위해 모델링에 사용되는 적어도 하루에 합류 상태로 유지되어야한다. 마찬가지로, 전기 상처는 최적의 상흔 효율을 달성하고 전극의 손상을 방지하기 위하여, 높은 주파수를 가진 다수의 상흔 짧은 펄스를 사용하는 셀 층을 컨 플루 언트하기 위해 적용되어야한다. jove_content &quot;&gt; 모든 분석에서, 이러한 각각의 세포 유형에 대한 어레이 기판, 코팅 및 파종 밀도의 조합과 같은 몇 가지 매개 변수를 실험하기 전에 테스트 및 최적화 할 필요에 따라, ECIS 측정에서 정보의 최대 양을 얻을 수 있습니다. ECIS의 가장 큰 한계는 측정이 분자 수준에서 직접 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 따라서 ECIS 측정은 세포 구조 나 특성을 가진 과학적인 문제를 연결하는 데 도움이하고 검증 가능한 가설의 생성에 중요한 입력을 제공하는 실험 시리즈의 시작 부분에 일반적으로 대부분의 정보를합니다. 따라서 ECIS의 모듈 형 설계는 맞춤 옷 배열에 대한 가능성과 응용 프로그램의 다양한 스펙트럼을 제공합니다. 최신 배열의 개발은 세포 증식 및 전기 남긴 상처에 대한 높은 처리량 임피던스 검사에 대한 미래의 초점과 생체의 시뮬레이션을위한 특별한 흐름 배열의 사전을 나타냅니다 </eM&gt; 다른 흐름 프로파일과 전단 응력. 또한 문학 또한 애플리케이션 노트, 웹 세미나 및 전체 ECIS 스펙트럼을 다루는 출판물의 자세한 목록은 응용 생물 물리학의 웹 페이지 (www.biophysics.com)를 참조하십시오.

ΩΩΩHere 우리는 ECIS, 문화 1 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 측정하고 분석 할 수있는 구체적인 방법으로 알려진 전기 세포 기판 임피던스 감지를 제시한다. 이 프로토콜의 목적은 임피던스 기반의 세포 분석이 특정 유형의 사용에 일반적으로 적용 할 수있는 가이드를 제공하고 응용 프로그램의 지속적 증가의 주요 기능 중 일부에 대한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 초점은 세포 증식, 장벽 기능, 세포 접합 및 세포 운동성의 연구에있을 것입니다. ECIS 및 생물학 관련 매개 변수의 임피던스 분광 데이터를 변환하기 위해 관련 모델을 1991 년 2 Giaever과 Keese으로 과학계에 현재의 형태로 도입 된 이후, 종종 (트랜스 봉사자의 측정을위한 시스템으로 언급 된 정확하지 않은 상피 전기 저항). 차이는 처음에 한계 보이지만,데이터 해석을 위해 중요하다. 고전 봉사자 측정의 경우, 세포는 상피 꽉 접합 또는 내피있는 adherens 접속점 (3)에 의해 지배되는 세포층의 전송 메커니즘을 특성화하기 위해 투과 필터를 재배하고 있습니다. 일반적으로, 상기 필터의 상하에 위치하는 두 개의 전극은 직류 (DC)으로 인해 발생하는 전압 강하를 측정하는 4 셀 층과 다른 두 전극 위에 유동을 적용하는데 사용된다. 전기 저항은 셀 배리어의 품질의 수치 설명을 허용 옴의 법칙을 사용하여 계산된다. ECIS이 기본 원칙을 다음과 확장합니다. ECIS 시스템에서 세포는 특별한 세포 배양 접시의 바닥에 포함 된 반대, 원형 금 전극에 재배하고 있습니다. 배양 당 전극의 개수는 물론 변수, 애플리케이션에 의존하고 전극이 250 ㎛의 직경을 갖는 표준이며 어떤 경우에는 더 큰 대향 전극회로를 완성하는 데 사용됩니다. ECIS 대신 직류 주어진 주파수 1 μA의 일정한 교류 전류 (AC)를 사용한다. 임피던스는 전극 사이의 값 (mV의) 전압에 해당하는 변경 계산됩니다. ECIS는 티이 통해 몇 가지 장점을 가지고 있으며,이 문서에서 상세히 설명 될 것이다 주파수 의존성 세포 특성을 연구하는 주파수 범위에서 임피던스를 측정 할 수있는 가능성을 제공한다. 첫째, 복잡한 임피던스를 측정하는 것은 세포 장벽 저항과 전지 용량에 전체 임피던스를 분리 할 수​​ 있습니다. 또, 다수의 주파수에서 데이터를 취하고 수학적 모델을 적용하여, 하나의 세포 기질 상호 작용 (기본 매트릭스에 기초 세포막의 거리) 등으로 인한 접합부 임피던스 (세포 - 세포 접촉의 압박감) 및 임피던스 구별 할 세포막 커패시턴스의 포스팅. 둘째, 세포 증식 및 세포 운동성 때문에 평가할 수있다전극들과 직접 접촉하고있다. 셋째, 기판과 전극 시야 및 위상차 현미경을 허용하기에 충분히 얇다. 임피던스 측정의 근거 : 복소 임피던스 생물 개체 (예 : 세포)의 전기 임피던스의 측정을위한 기초는 옴의 법칙, 저항 (R)과의 관계를 설명하는 기본적인 전기 기술 원리, 전류 (I)와 전기 회로에서 전압 (U)입니다 주어진 시간 (t)에서. DC 회로에 적용 가능한 : R (t) = U (t) / I (t) AC 시스템에서 작업 할 때, 전류 및 전압은 진폭에 차이가 있지만, 또한 위상 (φ)에서뿐만 아니라. 이제 저항은 더 이상이 관계를 설명하기에 충분하지 않습니다. 대신에, 복소 임피던스 (Z) 또는 임피던스의 대부분의 강도 (| Z |) 다시 전술 오믹 저항 플러스 리액턴스 (X)를 포함하는, 사용AC에서 sults 커패시터 전압 및 전류 (5) 사이의 위상 시프트를 구동 인덕터를 통해 흐른다. AC 회로에 적용 가능한 : | Z (F) | = √ (R 2 + X (F) 2) φ = 아크 탄젠트 (X / R) 그 막의 특성에 의한 세포 손상에 임피던스 측정을 수행 할 때, 세포는 저항과 커패시터의 병렬 접속으로 작용한다. 정전 용량 (C)이 셀의 분극을 발생 세포막의 절연성 이층에서 전기 캐리어의 분리를 설명하는 반면 여기서, 저항, 전류 흐름에 대한 저항을 나타낸다. 이에 X는 세포막의 용량 성 특성에 의해 지배된다. X (F) ≈ (2 * 파이 *의 F의 *의 C 셀) -1 X는 주파수에 의존하기 때문에, 측정 주파수의 편차는 셀의 상이한 기능적 및 구조적 특성의 연구를 가능하게한다. ECIS 장치 측정 R과 X, 수 계산 모두의 | Z |, C 및 φ. 전기 등가 회로 : 임피던스 분광 전체 셀 레이어를 정량화. 셀이 전기장하게되면 이전에 설명한 바와 같이, 그것은 수동 전자 부품의 특성을 나타낸다. 이제, 대신 단일 셀의 전극 위에 성장 및 세포 배양 배지로 보충 된 셀 전체 층이 조사되는 경우, 저항과 콘덴서의 간단한 모델은 전체 전기 네트워크로 확장 될 필요가있다. 소위 등가 회로에서, 전극 / 전해질의 상호 작용을 특성화 배지 (R 메드)뿐만 아니라 커패시턴스 (C 전동식) 및 저항 (R 전동식)의 저항은 3,6 고려 될 필요가있다. 부착 성 세포 성장 층용 같은 등가 회로의 간략화, 일반 예는도 1에서 발견 될 수있다. 그러한 수학적의 장점생물학적 시스템을 설명하기 pproach 이러한 회로들은 임의로 품위 및 세포 내 소기관으로 인한 또는 세포 - 세포의 영향 (R 접합부)와 휴대 기판 유착을 구별하는 임피던스를 고려하여 예를 들면 특정 실험 질문에 조정될 수 있다는 것이다 전체 임피던스 7,8에 (R 하위). 그럼에도 모델링을위한 기준은 항상 의미 상관 관계를 허용하는 임피던스 측정 된 스펙트럼의 모든 특징을 기술하는 요소들의 최소 수를 사용하는 것. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 부착 성장 세포의 층.) 크로스 ECIS 문화의 섹션도에 대한 ECIS 시스템 대표 등가 회로의 회로도. 세포는 감지 및 카운터 전극 위에 성장다시 배양액으로 덮여있다. 전극 락인 앰프에 접속되고, AC 신호는 정전류 소스를 만드는 1 MΩ의 저항을 통해인가된다. 자극은 어떤 시점. B) ECIS 조치 임피던스에 대한 모든 개인 기여의 합에서 문화 매체에 직접 추가 할 수 있습니다. 저항 (R 전동식)와 커패시터 (C 전동식), 또한 전기적 특성의 병렬 조합으로 제시 단순성이다 전극 / 전해질 계면에 의해 발생 배양액 (R 메드)뿐만 아니라 임피던스의 저항 병렬 저항의 연결 (R 세포) 및 커패시턴스 (C MEM)에 의해 설명 세포막 건 모두 고려되어야한다. 그것이 현재 향해 세포 투과성에 의존하기 때문에 R 전지는 변수이다. 등가 회로를 확장하고 임의로 정제 할 수있다. 예를 들어 접합부 (R 접합부) 등으로뿐만 아니라 피하 (R 하위) 저항을 회로에 추가 된 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 임피던스 매개 변수 및 생물학적 의미 임피던스 측정으로부터 도출이 가장 직접적인 파라미터는 저항과 셀의 정전 용량이다. 저항은 품질과 세포 장벽의 기능을 나타내며, 따라서 고려 파라와 트랜스 세포의 전류 흐름을 향해 저항을합니다. 정전 용량은 전극 범위의 전체 측정을​​ 제공합니다. ECIS의 독특한 기능은 등가 회로의 도움과 모델링과 그 전역 매개 변수는이 문서의 뒷부분에서 논의 될 것이다 세포 - 세포 및 세포 - 기질 접착을 포함한 많은 세포의 특성에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 실험 conside을 : 시작하기 전에배급 측정 설정 - 설정이 몇 가지 별도의 구성 요소로 구성되어 측정 전자와 ECIS 장치, -, ECIS 배열과 선택의 세포 배양, 데이터 수집을위한 PC 또는 96 - 웰 시스템 8 어레이 홀더. 어레이 홀더 인큐베이터에 넣고 인큐베이터 외측 ECIS 디바이스에 연결되어야한다. PC는 ECIS 소프트웨어 (1.2.123.0의 2013년 2월 14일)를 탑재 ECIS 장치에 연결해야합니다. 배열 선택 - 여러 응용 프로그램을 위해 설계 ECIS 배열의 지속적으로 증가하고 다양한 있습니다. 표준 배열은 각각 (E로 표시) 1 또는 10 측정 전극, 상기 (W로 표시) 8 문화 우물로 구성되어 8W1E 및 8W10E 배열입니다. 큰 대향 전극은 회로를 완료되지만 그 임피던스는 실제 측정에서 6 본질적 무시할 수있다. 표준 8 잘 배열 홀더가 호스팅 할 수있는 두rrays, 16 문화 우물의 총 수의 결과. 금 전극은 50 nm의 두께의 절연막으로 묘사하고 광학적으로 맑은의 Lexan 폴리 카보네이트 기판 또는 인쇄 회로 기판 (PCB)을 어느 하나에 장착된다. PCB 배열은 더 강력하고 효율적인 비용. 투명 슬라이드 빛과 면역 형광 현미경을 허용. 어떤 고려되어야하는 것은 1E 어레이 셀 움직임에 의해 야기 저항 신호의 변동을 향상시키고 상처 치료 연구를 위해 필요하다는 것이다. 또한, 하나의 전극은 전기 및 광 신호의 상관 관계를 할 수 있습니다. 다중 전극 배열, 신호 인해 증가 된 측정 영역에 요철 접종하고 세포의 성장에 의해 데이터의 바이어스를 제한하고 인해 셀 신호의 치우침을 감소시키고, 측정에서 더 많은 세포를 포함하는 몇개의 전극 위에 평균화 운동. 따라서 다중 전극 배열은 세포 증식 및 장벽 형성을 연구하는데 유용하다. 옆에표준 배열 특별한 화성 (10)을 연구하는 전단 응력 (9)의 응용 프로그램에 해당하는 배열, 세포의 이동, 증식뿐만 아니라 높은 처리량 검사를위한 96 - 웰 플레이트가 있습니다. 결론적으로, 사용되는 배열은 과학적 질문 세포 유형에 크게 의존하고 선택하고 신중하게 테스트해야합니다. 측정 주파수 - RB 및 알파의 모델링 (데이터 분석 참조) 다중 주파수 측정 (MFT)가 필요합니다. 그렇지 임피던스 데이터가 더 높은 시간 해상도로 모아질 수있는 이점과 함께, 하나의 세포 유형 특정 주파수 (SFT)에 시간에 걸쳐 측정 할 수있다. 특정 세포 유형에 대해 가장 민감한 측정 주파수는 주파수 스캔에 의해 발견 될 수있다. 무 세포 및 세포 덮인 전극의 가장 큰 차이는 셀이 t를 차단 주파수이다 로그 - 로그 그래프에 주파수 대 주파수에 각각 저항 임피던스 플로팅되면그는 현재 가장 효과적으로. 내피 세포 (EC)의 경우에는이 주파수는 약 4 kHz에서입니다. 파종 밀도 - 모든 일반 세포 기반 실험 파종 밀도로는 과학적인 문제에 따라 달라집니다. 밀착성을 연구하고 확산 또는 배리어 형성하면 내피 세포 융합을 보장 / cm 2 40,000-60,000 세포를 고밀도로 48 시간 후에 안정 배리어를 시딩한다. 실험의 초점은 증식에 있으면, 내피 세포 / cm이 약 2000 ~ 10000 세포의 저밀도로 시딩한다.

<table><tbody><tr><td>ECIS Z&세타;</td><td>Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA</td><td>ibidi GmbH, 독일</td><td></td>뮌헨</tr><tr><td>8W1E PCB 전극 어레이</td><td>Applied Biophysics Inc., 트로이, NY, 미국</td><td>ibidi GmbH, 뮌헨, 독일</td><td></td></tr><tr><td>8W1E Lexan 전극 어레이</td><td>Applied Biophysics Inc., 트로이, NY, 미국</td><td>ibidi GmbH, 뮌헨, 독일</td><td></td></tr><tr><td>8W10E PCB 전극 어레이</td><td>Applied Biophysics Inc., 트로이, NY, 미국</td><td>ibidi GmbH, 뮌헨, 독일</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Merck Millipore</td><td>102838</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Merck Millipore</td><td>104070</td><td></td></tr><tr><td>소 트롬빈</td><td>Merck Millipore</td><td>604980</td><td></td></tr><tr><td>알부만 (인간 혈청 알부민)</td><td>Sanquin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상 구균</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

전지 셀 기판 임피던스 감지 (ECIS)가 부착 세포층 내의 셀의 동작을 정량화하는 체외 임피던스 측정 시스템이다. 이를 위해, 세포는 반대, 원형 금 전극 위에 특별한 문화 실에서 재배된다. 일정한 작은 교류 전류는 전극과 전위 걸쳐 측정 사이에인가된다. 세포막의 절연성 전극 간의 증가 된 전위의 결과로 전기 전류의 흐름 방향으로 저항을 생성. 이 방법으로 세포의 임피던스를 측정하는 것은 세포 부착, 성장, 형태, 기능 및 운동성의 자동화 연구를 할 수 있습니다. ECIS 측정 자체가 간단하고 쉽게 배울 수 있지만, 기본 이론은 복잡하고 올바른 설정과 정확한 분석 및 데이터의 해석의 선택은 자명하지 않다. 그러나, 명확한 프로토콜은 실험에서 각 단계를 설명준비, 구현 및 실험 분석에 디자인을 사용할 수 없습니다. 이 문서의 기본 측정 원리뿐만 아니라 가능한 응용 프로그램에서 실험 고려 사항, 장점과 ECIS 시스템의 제한 사항에 대해 설명합니다. 가이드는 확산 및 증식, 세포 부착의 연구를 위해 제공되고, 장벽 기능, 세포 운동성, 세포 - 세포 및 세포 - 기질 접착의 질에 관한 합류 층에있는 세포 행동의 정량화하고, 상처 치유의 정량 혈관 작용 자극에 대한 세포 반응. 대표적인 결과는 인간 미세 혈관 (MVEC) 및 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에 근거 논의하지만, 모든 부착 성장하는 세포에 적용 할 수있다.

실험을 설정하는 것은 매우 간단하고 측정 자체가 완전 자동입니다 ​​만, 자주의 경우와 같이, 정확한 분석 및 데이터의 해석은 매우 중요하다. 대표 데이터 섹션에 가이드는 ECIS와 임피던스 분광기가 제공하는 가장 중요한 매개 변수 해석을 위해 제공된다. 이 ECIS 측정이 매개 변수를 기록해야한다 유용 할 수 있습니다 과학적 문제의 어떤 종류를 결정하는 것이 도움이 될 것입니다. 전형적인 실험 판독은 일반적으로 세포 접종하고 세포가 합류에 도달 고원 단계 후 성장 단계에 나눌 수 있습니다. 각각의 단계는 서로 다른 셀룰러 특성에 대한 정보를 산출한다. 대표적인 측정은도 2에 도시되고 A) 세포 부착을 분석하는 네 subphases으로 나누어, 확산 및 확산되고 성숙 EC 장벽 B) 형성; C) 세포 이동의 전기 생성 후에) 혈관 활성 에이전트 트롬빈과 자극에 대한 세포 반응 및 D, 알 상처. 위상차 및 면역 형광 이미지는 전극에 따르면, 휴대 상태 및 기록 임피던스 신호 사이의 연결을 설명하기 위해 상이한 subphases 동안 측정 전극으로부터 직접 취득 하였다. 접착, 확산 및 확산 모든 세포 유형은 세포 외 기질 단백질이나 다른 자극에 코팅, 파종 밀도를 달리하여 조작 할 수있는 특징적인 접착 및 성장 곡선을 가지고 있습니다. 그 과정을 연구하는 주요 문제 중 하나는 확산 및 확산, 접착 성을 구별하는 것입니다. 베게너 등. (11)는 저항과 그 매개 변수와 그림 3은 저항 및 커패시턴스가 서로를 보완 할 수있는 방법 명백하게된다 구분하는 정전 용량의 조합의 사용에 대한 자세한 설명을했다. 그것은 중요합니다밀착성의 연구 및 여기 전계가 셀 주변 독점적 흐를 전류를 강제 현탁액 08에서 세포의 세포막의 분극의 원인이되기 때문에, 측정 주파수의 영향을 이해하기 위해 확산. 세포들은 전극 (소수 영역)에 개구 면적의 비율로 선형 방식으로 전극 및 용량 감소를 통해 확산에 의해 전류의 흐름을 제한하기 시작 붙이면. 용량의 감소는 전극의 범위에 비례 직접 40 kHz에서 (그림 3B),보다 높은 주파수에서 정전 용량을 기록 할 때 따라서, 접착 성, 확산 및 확산, 최고의 정량화 할 수있다. 또는 가장 민감한 측정 주파수에서 저항 합류 장벽에 분화 및 세포의 성숙 (그림 3A)에 대한 직접 측정 한 것입니다. 소수 지역뿐만 아니라, 베게너 등 알. 다른 두 가지를 소개T 1 / 2 전극의 50 %는 세포 (그림 3B, 삽입)으로 덮여 때까지의 시간입니다 (반 최대 용량), 및 용량 곡선 (S,하지의 기울기 : 접착 및 전극의 범위를 정량화하는 매개 변수 세포는 확산과 확산의 속도로) 표시됩니다. 배리어 품질의 척도로서 저항 저항은 막 전극과 매체 용량 구성 요소를 무시하기 때문에, 장벽 품질과 최고의 기능을 설명 임피던스의 일부입니다. 투과성이 정의 당 세포 - 세포 접촉에 의존적이기 때문에 단지 여기서 용어 배리어 품질하지 투자율은 사용된다. 그러나 저항은 전류 흐름을 차단하는 세포 및 그 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용의 능력에 의해 결정된다. 따라서 서로 다른 세포 유형 (복제 및 통로)의 특정 저항 값 (그림 4A)가있다. 저항이 훨씬 클레아보기 주지만셀 배리어 RER 대한 아이디어는, 임피던스 신호는 항상 고려되어야한다. RB와 알파의 모델링 ECIS 소프트웨어가 특정 기능을 버스, 세포 - 세포 및 세포 매트릭스 유착 (그림 (b)와 4 C)를 구분 두 개의 매개 변수를 모델링 할 수있는 능력. RB는 (2 cm X 옴에서), 전류 흐름함으로써 고전 투자율의 역 측정하는 세포 - 세포 접촉의 저항이다. RB는 높은 전류 흐름을 향해 낮은 투자율을 의미한다. 알파 (에 cm X 옴 0.5), 전지 전극의 접합에서 발생하는 임피던스의 기여에 대한 척도이다. 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 접점을 정량화 모델 Giaever 및 Keese 1991을 도입시키고, 세포가 원형임을 전제로, 절연성 막가 디스크 형 물체가 전극 가리키면 및 전해질이 전도성으로 채워진다 .세포막의 절연성하면 전류 세 경로 잎 : a) 세포와 전극의 복부 표면 사이, b) 세포 - 세포 접촉하고, c) 세포를 통한 사이 (단지 가능성이 높은 측정 주파수가 사용되는 경우 ). 더 자세한 유도 및 설명 소호 등 3,12의 논문에서 찾을 수 있습니다. 미세 운동 그것은 저항 신호 (그림 4A)의 작은 변동이 미묘한, 임의의 세포 융합 세포 층의 움직임뿐만 아니라 이동하는 세포와 스파 문화 2의 전극 오프에 의한 것으로 나타났다. 소호 및 오프에 의해 설명 ECIS 시간 코스 데이터의 이러한 측면은 등. 13, 14 간과 파라와 세포 내 전류 경로에 대해 설명하기 위해 1E 배열하고 가장 민감한 주파수에서 측정 할 때 가장 잘 볼 수 있습니다. 이 셀의 계산은 노이즈 (미세 운동)이 일의 일부가 발생전자 표준 측정 소프트웨어, 최신 버전의 고속 푸리에 변환 (FFT)이 통합되어 있지만. 4 kHz에서 1 시간 동안 1 Hz의 샘플링 주파수로 RTC 데이터를 기록하는 EC의 미세 운동의 계산에 충분한 해상도를 제공한다. 이 계산은 하나의 값을 제공하고 직접 통계 분석을 위해 사용될 수있다. 미세 운동에 대한 주파수 분석의 사용에 대한 확장 된 논의는 다른 15 찾을 수 있습니다. 대안으로 FFT에 다른 분석 전략은 증분 분산 같이 사용될 수있다. 차이는 미세 운동의 작은 변화를 향한 더 민감하지만,이 때문에 감도 개별 실험의 비교가 어려워진다. 파워 스펙트럼의 슬로프는 미세 운동의 더 강력한 둘레 (도 4d)이다. 여기서 곡선 아래 면적 미세 운동 또는 세포가 생성 노이즈의 양으로 볼 수있다. 따라서, 급격한 전력 스펙트럼의 경사 곡선 아래 면적 작아과 미세 운동 작은. 전기 상처 치유 분석 세포의 이동을 연구하기 위해, 일반적으로 기계적인 상처는 피펫 팁, 세포 스크레이퍼 또는 특정 우표와 문화 플레이트 떨어져 세포를 긁적 및 현미경 (16) 자신의 remigration를 수행하여 적용됩니다. 이 방법은 처음의 크기가 다양하며 일반적으로 상처 치유 과정에서 세포 증식의 영향을 무시하기에 너무 큰 명백한 단점이있다. ECIS의 부상 함수는 무 세포 전극을 얻기 위해, 고전압, 고주파 펄스를 사용하고,이어서 데스 세포 (도 5a)를 대체하기 위해 인접 셀의 remigration을 따른다. 표준, 노동 집약적 인 스크래치 분석을 통해이 자동화 된 방법의 장점은 ECIS 순수한 마이그레이션을 공부하는 몇 시간 내에 종료 250 ㎛의 정확한 직경의 높은 재현성 상처를 생산한다는 것입니다. 또한, 전기 펄스가 수행에스 단백질 코팅 및 분비 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 제거하지. 세포는 모든 측면에서 전극에 다시 이주하다는 가정 하에서, 이동 속도가 쉽게 감아 클로져 (17)을 위해 필요한 시간에 의해 권취 반경을 나눔으로써 계산 될 수있다. 전기 상흔에 대한 대안으로서, 최근 소위 전기 차단 방식 (도시하지 않음) 도입 하였다. 여기에 높은 전류 펄스는 접종 후 전극에 부착 세포의 이동을 방지. 세포는 측정 전극 주위에 성장하고 안쪽으로 즉시 전기 펄스가 해제 될 때 마이그레이션을 시작합니다. 전기 상흔을 통해 전기 울타리의 장점은 전극면이 세포 성장 또는 세포 이동에 다른 코팅의 영향을 측정하는 것이 중요하다 세포 제거에 의해 변경되지 않았다는 점이다. 세포 자극 세포 이동의 연구뿐만 아니라, 임피던스 분광은 (는) 도심에 적합합니다약물 및 세포 독성 효과를 측정한다.도 5b는 트롬빈은 저항의 일시적인 저하로 나타난다 세포의 수축 및 간극 형성하여 합류 EC 장벽에 하이퍼 투과성을 유도하는 데 사용 된 고전 자극 / 억제 실험을 제시 . Rho 키나아제 억제제 Y-27632와 함께 예비 배양하여 트롬빈 반응의 대부분은 기저 세포 텐션 (18)을 낮추는 스트레스 섬유화 (19)을 차단함으로써 감소된다. 그런 Rho 키나아제 차단제는 EC 장벽의 즉각적인 다운로드 복구에 이르는, 트롬빈​​ 첨가 후 상이한 시점에서 사용 하였다. 여기 급성 세포 반응을 연구하는 연속 임피던스 측정 시스템의 장점은 명백해진다. 일반 엔드 포인트 분석 (예를 들면 면역 형광 염색 또는 고분자 통로)에서 사용 차단이 급성 반응은 감지하고 정량화하기가 매우 어렵거나 불가능할 것입니다. 주의하는 것이 중요하다와 나mpedance 측정은 이온으로 투자율은 고분자으로 설명하고 있지 않습니다. ECIS 측정 및 고분자 통로 실험 사이의 우수한 비교가 제공 아만 등. 20을 참조하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig2.jpg" /> 그림 2. 대표적인 측정. MVEC 5,000 세포 / cm 2, MFT 기록을 10 일 동안 수행 된 낮은 시딩 밀도 젤라틴 코팅 8W1E 배열에 성장했다. 측정은 ECIS 실험의 다른 판독을 보여줍니다 : A) 부착, 확산 및 확산, B)의 형성과 합류 세포 장벽의 성숙, C) 상처 치유 전기 상처의 적용 후, 혈관 작용과 D) 자극 에이전트 트롬빈. 두 개의 화살표는 중간을 나타냅니다<html> 사일 간격으로 수행하고 기계적인 자극 온도 및 pH의 변화를 향해 측정의 민감도에 대한 아이디어를 제공 한 다과. 상단 패널에있는 이미지는 측정에 대응하고 측정 전극으로부터 직접 취득했다. 좌측 위상차 콘텐츠 전극을 덮도록 시작 24 시간 후 접종 내피 세포를 나타낸다. 중앙에 합류 내피 층의 오른쪽 현재 F-액틴 염색의 면역 사진 이전과 트롬빈 (1 U / mL)로 자극 후. 트롬빈은 소위 스트레스 섬유와 기준에 대한 내성의 저하로 ECIS 신호의 인식 간 내피 갭 (화살표 및 이미지 삽입)의 과도 개방의 형성에 의해 내피 세포의 수축을 발생합니다. 여기서 측정 감도가 명백하게된다 및 세포층의 변화는 임피던스 신호와 연관되다.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51300/51300fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig3.jpg" /> 그림 3. 세포 부착 및 성장. MVEC은 같은 기증자로부터 젤라틴 코팅 8W10E 배열 및 세포의 성장을 60 시간 동안 여러 주파수에서 기록 된 세 개의 다른 밀도와 씨앗을 품고 있었다.) 4 kHz에서 자신의 최적의 주파수에서의 세 가지 조건에 대한 저항 값을 측정 할 수 장벽을 형성합니다. 세 파종 밀도는 캘리포니아의 합류 장벽을 설치했다. 측정의 끝에서 1,200 Ω이;.하지만 확산 속도 (곡선의 기울기)가 현저하게 다른 B) 정전 용량의 측정을 64 kHz로하는 접착 및 확산에 대한 통찰력을 제공합니다. 접착에있다(2-8 시간 사이) 용량 곡선 itial 고원 단계. , 전극 따르면 선형 관계로되는, 확산하는 곡선의 기울기에 의해 표현되고, 파종 밀도에 따라 10 ~ 30 시간 후에 완료된다. 시간 점 t 1 / 2 (절반 최대 커버리지) 통계 분석에 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51300/51300fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51300/51300fig4.jpg" /> 그림 4. 합류 장벽의 특성. 다른 통로 번호 (통로 (3), 6) 젤라틴 코팅 8W1E 배열에 접종하고, MFT 측정이 EC의 장벽.) 저항의 특성을 30 시간 동안 수행 된 두 MVEC 기증자<html> 측정은 젊은 기증자 1은 캘리포니아의 높은 저항을 가지고 있음을 알 수있다. 캘리포니아 주에 비해 11,000 Ω. 이전 기증자 2. BC) ECIS의 모델링 기능의 7,500 Ω는 낮은 저항의 원인을 찾는 데 사용되었다. 모델링 유사한 세포 - 세포 상호 작용 RB를 계시하고 가능한 원인. D로 약해진 세포 - 매트릭스 상호 작용 알파를 나타냄) RTC는 곡선 아래 면적 미세 운동에 비례하는 푸리에 변환에 의한 합류 전지 층 내의 미세 운동을 정량화 하였다 . 스펙트럼의 분석은 이전 기증자 2 이하 미세 운동을 표시함으로써 이미 저항 신호 (이하 분산)에서 가정 할 수있는 지원합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 10 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot; &quot;FO : SRC =&quot;5 인치 / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 세포의 이동이 전기 남긴 상처와 트롬빈 자극의 효과 후. 임피던스 녹음이 최대 시간 해상도와 4 kHz에서 수행되었다.) MVEC 기증자 1 통로 (3)와 젤라틴 코팅 8W1E 배열에 통과 6 기증자 2에 사용 합류로 성장했다. 다음 전기 상처는 20 초마다 지속 시간 60 kHz에서 두 개의 5 V 펄스의 응용 프로그램에 의해 만들어졌습니다. 젊은 기증자 1 HUVEC는 젤라틴 코팅 8W10E 배열에서 성장했다) 이전 기증자 2. B에 비해 빠른 상처 폐쇄 (마이그레이션, 곡선의 기울기)를 기반으로 기능을보다 나은 상처 치유 및 부상 후 높은 저항을 보여 주었다. 합류시 세포는 혈청 기초 배지 플러스 1 % 인간 혈청 알부민 (HSA)과 완전 배양 배지로 대체하여 1.5 시간 동안 공복하였습니다. 우리미용액 성분이 트롬빈 반응을 차단하기 때문에 HSA와 일반 매체의 연령은 중요한 단계입니다. 즉시 안정된 저항 고원이 감지되었을 때, 트롬빈​​은 우물에 직접 첨가하고 200 μL 피펫으로 조심스럽게 혼합. 최대 트롬빈 효과는베이스 라인과 CA에 저항의 과도 드롭을 특징으로 30 분, 후 볼 수 있습니다. 복구 후 30 % ~ 50 % 낮은 저항. 세포 하나를 30 분 또는 차단을위한 Rho 키나아제 차단 Y-27632와 미리 배양 된 20, 30, 또는 즉시 트롬빈 효과를 감소 트롬빈을 첨가 한 후 40 분, 추가되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a>

이 프로토콜은 전기 세포 기판 임피던스 감지, 세포 부착, 증식, 운동성 및 약리 및 독성 자극에 대한 세포 반응의 정량화에 부착 세포의 임피던스 스펙트럼을 기록하고 분석 할 수있는 방법을 검토합니다. 내피 세포의 투과성과 세포 - 세포 및 세포 - 기질 연락처 평가의 검출이 강조된다.

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

다음 실험의 전반적인 목표는 전기 세포 기질 임피던스 센싱(electric cell substrate impedance sensing, ECIS)을 사용하여 세포 행동을 특성화하는 것입니다. 이는 전극 어레이 상에서 세포를 배양하고 다양한 모드에서 측정함으로써 혈관 내피 세포 장벽의 형성, 성숙 및 기능을 정량화함으로써 달성됩니다. 이후 전기적 손상 유도 및 자극제 첨가와 같은 조작을 통해 세포 운동성과 장벽 기능을 테스트합니다. 이를 통해 ECIS를 기반으로 세포 부착, 증식, 이동, 혈관 내피 투과성 검출, 그리고 세포-세포 및 세포-기질 접촉 평가에 대한 결과를 얻습니다.이 방법은 표준 세포 배양 조건에서 세포의 자연스러운 합류 상태를 특성화하고 정량적 데이터를 실시간으로 생성하는 등, 세포 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 기초 이론이 복잡해 보이고 실험 시작 전 몇 가지 기본적인 고려 사항을 숙지해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 전극 드리프트를 방지하고 재현성을 높이며 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 어레이를 세척하고 안정화해야 합니다.따라서 8-웰 어레이의 각 웰에 10 millimolar EL ine 200 microliters를 첨가합니다. 상온에서 15분 후, 인산염 완충액이 아닌 초순수로 두 번 세척하여 EL cystine을 제거합니다. 또한, 코팅 전에는 전극을 혈청 함유 용액에 노출시키지 마십시오. 혈청 성분이 단백질 흡착을 방해할 수 있기 때문입니다. 다음으로, 가온된 1% gelatin 200 microliters를 각 웰에 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 어레이를 배양합니다.젤라틴을 제거하려면 초순수를 사용하고 전극 표면이 마르지 않도록 주의하십시오. 그 후, 혈청이 포함될 수 있는 완전 배지 400 µL를 웰에 채웁니다. 어레이를 홀더에 장착하십시오.9개의 금색 사각형을 확인하십시오. 이 사각형들은 POGO 핀과 접촉해야 합니다. 컴퓨터에 있는 조절 나사를 조여 배열이 제자리에 고정되도록 손으로 조심스럽게 고정하십시오.측정 소프트웨어를 엽니다. 설정(set up)을 누른 다음 데이터 수집(collect data) 섹션에서 기본 주파수인 4,000 hertz로 각 웰의 임피던스를 빠르게 측정하도록 선택합니다. 측정값은 비고(comments) 섹션에 저장됩니다.어레이 다이어그램의 웰 구성 섹션에서 사용 중인 EISs 어레이 유형이 정확하게 선택되었는지 확인하십시오. 빨간색과 녹색은 연결의 기능 상태를 나타냅니다. 세척과 코딩이 성공적으로 이루어졌다면, 8개의 W 1 E sys 어레이는 약 5~6 NANOFARAD로 측정되어야 하며, 8개의 W 10 E 어레이도 마찬가지입니다.세포 파종 전 50에서 60 nanofarad의 기저 저항은 약 2000 ohms입니다. RB alpha 및 cm를 사용하여 데이터를 모델링하려면, medium failed array로 MFT 기록을 시작하십시오. 세포가 없는 상태에서 15분 동안 데이터를 수집한 후, 실험을 종료하고 세포를 추가하십시오.이제 어레이를 제거하고 각 웰에 400 µL의 단일 세포 현탁액을 분주합니다. 세포 성장을 연구하려면 cm²당 10,000 cells를 분주하고, 거의 합류된(confluent) 상태의 세포군으로 시작하려면 cm²당 60,000 cells를 분주하십시오. 홀더에 어레이를 장착한 후, 웰 구성(well configuration) 섹션에서 측정할 웰을 선택합니다.그 다음 데이터 수집 옵션으로 이동하여 고정 주파수 시계열을 위한 측정 모드를 선택합니다. 전극 피복도와 RB 및 alpha 모델을 측정하기 위한 측정 주파수를 선택하려면 SFT를 선택하고, MFT를 선택하면 장치가 사용 가능한 모든 주파수에서 자동으로 측정을 수행합니다. 가능한 경우 항상 다중 주파수 모드로 측정을 실행하십시오. 이 모드는 사용 가능한 모든 주파수의 데이터를 필요로 하며, 이를 통해 가장 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다.미세 움직임 분석을 위해 RTC를 선택하고 샘플링 주파수를 조정하십시오. 표준 시간 분해능은 1 Hz이지만, 임피던스의 빠른 변화를 추적하기 위해 높일 수 있습니다. z theta의 경우 이 값을 25 Hz까지 높일 수 있습니다.여러 웰에서 순차적으로 미세 움직임을 측정하려면 도움말 메뉴를 선택하십시오. 그런 다음 전문가 도구 모음 메뉴 항목 표시를 선택하고 acquire 및 multi-well RTC를 선택하십시오. 데이터 수집 섹션에서 시간 제한을 시간 단위로 반드시 지정하십시오.이 설정을 사용하면 데이터 획득이 시작된 후 소프트웨어에서 사이클 수를 입력하라는 메시지가 표시됩니다. SFT 또는 MFT를 사용하여 데이터를 수집할 때는 초 단위로 지정된 측정 간 시간 간격을 선택하십시오. 최대 데이터 획득을 위해서는 이 옵션을 선택 해제한 상태로 두십시오.이제 시작(start) 버튼을 누르고 데이터가 저장될 위치를 지정하십시오. 종료(finish) 버튼을 누르면 실행이 중단됩니다. 일시정지(pause) 버튼을 누르면 데이터 수집은 중단되지만, 실험 시계는 계속 작동합니다.이제 어레이를 제거하고 층류 후드(laminar flow hood) 아래에서 웰을 조작하십시오. 어레이를 홀더에 다시 장착한 후, 'check connection'을 클릭하여 전기 연결 상태를 확인하고 'resume experiment'를 클릭하여 데이터 수집을 계속합니다. 조작 후 세포의 무균 상태를 유지할 필요가 없다면, 데이터 획득 중에 thrombin과 같은 자극제를 웰에 직접 첨가할 수 있습니다.이렇게 도입된 변수는 mark를 누르고 코멘트를 추가하여 실험 시계에 표시할 수 있습니다. 또 다른 옵션은 세포에 전기적 상처를 입히는 것입니다. 이 설정의 경우, 너무 짧은 상처 생성 시간으로는 적절한 효과를 얻기 위해 세밀한 조정이 필요하며, 너무 길어지면 효과가 없을 뿐만 아니라 전극이 손상될 수 있습니다.소프트웨어에서 제공하는 기본 설정으로 시작하여 진행하십시오. 상처 전기 패러드(wound electro parade) 설정 섹션으로 이동하여 wound 기능을 활성화하십시오. 이제 웰 구성(well configuration)에서 상처를 낼 웰을 선택하십시오.체크된 웰만 상처를 입힙니다. 'activate'를 클릭하면 상처 유도를 위한 팝업 창이 나타납니다. 상처 유도 후, 신호가 거의 세포가 없는 전극의 값까지 떨어지는지 확인하십시오.데이터 작업을 위해 상처 입히기 과정이 일반적으로 반복되지 않았다면, 데이터 내보내기 옵션을 사용하여 Excel을 선택하십시오. 하지만 RB 및 alpha 모델링은 소프트웨어 내에서 수행할 수 있습니다. MFT 데이터의 경우, 모델링은 합류성 세포층(confluence cell layers)에서만 유효하다는 점에 유의하십시오.그리고 무세포 기준점(cell-free reference)을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 주파수 스캔 모델링 및 분석 섹션의 찾기 기능을 사용하여 무세포 기준점을 자동으로 선택하는 것부터 시작하십시오. 설정(set)을 통해 해당 값을 적용하십시오.다음으로 모델 버튼을 눌러 계산을 시작하십시오. 계산 완료까지 수 분이 소요될 수 있으나 이는 정상적인 과정입니다. 일반적인 실험 과정에서 세포는 성장기에서 정지기로 진입합니다.세포가 합류(confluence)에 도달하면, 이 과정 동안 전극에서 직접 이미지를 획득합니다. 다음 단계는 EC 장벽의 형성 및 성숙 단계입니다. 이후 세포 이동을 연구하기 위해 전기적 상처(electrical wounding) 기법이 사용됩니다.신호가 기저선까지 특징적으로 감소한 후, 다시 합류 상태가 회복됩니다. 마지막으로, 자극에 대한 반응을 실시간으로 관찰합니다. 여기서는 혈관 활성 제제인 thrombin을 처리하였습니다.이로 인해 세포 수축이 발생하고 그 결과 장벽에 일시적인 작은 틈이 생기며, 이는 임피던스 저항의 하락을 유발합니다. 커패시턴스 측정은 가장 민감한 측정 시점에서 세포 접착 및 성장 저항에 대한 보완적인 정보를 제공합니다. 주파수는 세포 장벽의 품질과 기능을 나타내며, 세포 간(paracellular) 및 세포 내(transcellular) 전류 흐름에 대한 저항을 고려합니다. 세포가 전극에 부착되면 전류 흐름이 제한되며 커패시턴스가 이에 비례하여 감소합니다.이 단계에서는 전극 피복도의 전반적인 측정이 이루어지며, 40 kilohertz보다 높은 주파수에서 커패시턴스를 기록할 때 가장 정확하게 정량화할 수 있습니다. 저항은 세포가 전류 흐름을 얼마나 잘 차단하는지를 명확하게 보여주며, 따라서 세포 장벽의 품질을 나타냅니다. 그러므로 계대 배양 횟수나 세포 종류가 서로 다른 세포들은 각기 다른 저항값을 가집니다.본 연구의 RB 및 alpha는 세포-세포 접합과 세포-기질 접합을 구분하는 데 도움을 줍니다. RB는 전류 흐름에 대한 세포-세포 접합의 저항성 또는 투과성의 역측정값입니다. Alpha는 세포-전극 접합부에서 발생하는 임피던스 기여도를 측정하는 지표입니다.RB 값과 alpha 값 모두 ISIS 소프트웨어 내에서 계산할 수 있습니다. 저항 신호의 작은 변동은 confluence 세포층의 미세한 움직임이나 마이크로 모션으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 변동은 가장 민감한 주파수에서 하나의 E 어레이로 측정할 수 있으며, EIS 소프트웨어 내의 고속 푸리에 변환(fast Fourier transformation)을 통해 분석함으로써 세포 행동에 대한 통찰력을 정밀하게 얻을 수 있습니다.예를 들어, 세포 이동을 연구하기 위해 몇 시간 내에 폐쇄되는 250 micron 크기의 전기적 상처를 만드는 것이 가능합니다. 임피던스 분광법은 첨가된 물질의 효과를 분석하는 데에도 매우 적합합니다. 앞서 언급했듯이, thrombin은 기초 세포 장력을 낮추어 세포 장벽을 과투과성으로 만들며, ARO kinase inhibitor를 통해 thrombin의 효과를 감소시킬 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 ESIS는 온도, pH, 배지 고갈 등과 같은 세포 환경의 변화에 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.개발 이후, 이 기술은 혈관학 분야의 연구자들이 혈관 활성제의 경향과 효과를 합류 세포 배양에서 실시간으로 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

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