방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

이 절차는 다공성 막의 반대편에 있는 성상세포와 내피 세포를 공동 배양하여 혈액-뇌 장벽의 체외 시뮬레이션을 목표로 합니다. 먼저 다공성 막의 내강 표면을 세포 외 기질로 코팅합니다. 콜라겐과 같은 단백질은 외부 실리콘 튜브와 내부 실리콘 플러그가 있는 거꾸로 된 삽입물에 맞아 멤브레인의 abluminal 표면 위에 탈착식 웰을 만듭니다.

이제 거꾸로 된 삽입물에 성상교세포 세포를 파종하여 abluminal 표면에 부착되도록 합니다. 그런 다음 튜브를 제거하고 인서트를 채워진 매체 웰 내부에 정상 방향으로 놓습니다. 다음으로, 내피 세포를 삽입체의 내강 구획에 파종하고 반대쪽 성상 세포와 공동 배양합니다.

궁극적으로, 형광 추적자의 통과 또는 트랜스 내피 전기 저항의 기록은 다양한 자극제에 대한 반응으로 체외 BBB의 투과성 변화를 측정하는 데 사용됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사후 연구원인 Barry Nigo씨로, 박사 과정 중에 혈액 뇌 장벽을 시뮬레이션하는 데 사용한 이 수정된 파종 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 더 조잡한 착석 방법을 테스트하고 일시 중지를 통한 매체 누출과 작은 중간 볼륨에 대해 많은 좌절감을 느낀 후 이 절차에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.

이로 인해 성상세포 착석 시간이 짧고 불충분했으며, 우리는 이 절차를 통해 이 문제를 해결하려고 합니다. 조직 배양 삽입물을 24웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 그런 다음 밀리리터 쥐 콜라겐 당 132 마이크로 그램의 50 마이크로 리터를 추가하고, 인서트의 내강 표면을 코팅하고, 잔류 산을 제거하기 위해 섭씨 37 도의 가습 된 인큐베이터에서 밤새 배양하고, 인서트의 abluminal 및 luminal 측면을 이중 증류수로 세척합니다.

그런 다음 인서트를 뒤집고 다공성 멤브레인의 가장자리 주위에 짧은 탄성 실리콘 튜브 조각을 부드럽게 끼웁니다. 본질적으로 abluminal 표면 위에 새로운 우물을 만듭니다. 밑면을 밀봉합니다.

0.2 밀리리터 PCR 튜브의 절단 팁으로 한쪽 끝을 밀봉 한 실리콘 튜브로 만든 플러그를 준비합니다. 이제 멸균 집게를 사용하여 실리콘 플러그를 내강 구멍에 삽입하고 멤브레인에서 약 1-2mm까지 도달 할 때까지 전진시킵니다. 다음으로, 40, 000 개의 성상 세포를 200 마이크로 리터의 유지 보수 매체에 직접 abluminal 막 표면 위의 실리콘으로 파종합니다.

성상세포의 부착 상태를 모니터링하려면 6.5mm 인서트와 표면적이 동일하고 허용되는 표준 96웰 플레이트를 사용하십시오. 위상차 현미경 검사법으로 세포를 더 쉽게 시각화할 수 있으며, 성상교세포 세포 현탁액과 동일한 부피를 96웰 플레이트 8로 만들 수 있습니다. 이는 96 웰의 성상세포와 더 나아가 삽입 멤브레인의 성상세포가 무균 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분히 부착되었는지 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 모니터링될 것입니다.

여과되지 않은 공기에 대한 노출을 최소화하기 위해 2개의 6웰 플레이트 사이에 조립된 인서트를 운반합니다. 성상세포가 부착할 수 있도록 세포를 인큐베이터에 넣습니다. 또한 이때 컨트롤 96 웰 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

약 4시간 후, 대조군 96 웰을 점검하여 성상세포가 부착되었는지 확인합니다. 그렇다면 인서트 어셈블리를 조직 배양 후드로 다시 옮깁니다. 외부 실리콘 튜브와 플러그를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 삽입물을 정상적인 수직 방향으로 내피 세포 유지 매체의 웰당 800마이크로리터가 들어 있는 웰로 되돌립니다. 20, 200 마이크로 리터에 있는 20의 두뇌 내피 세포를 어떤 매체 변화도 없이 BEC 매체에 있는 3 일 동안 교원질에 의하여 입힌 luminal 표면 CO 배양에 보십시오. 실험하기 전에.

나중에 사용할 수 있도록 고압증기멸균하기 전에 실리콘 튜브와 플러그를 에탄올로 세척하십시오. 체외 혈액 브레인 장벽을 자극하기 위해 먼저 abluminal 및 luminal 배지를 각각 600마이크로리터 및 100마이크로리터의 무혈청 becs 배지로 교체합니다. 루미널 세척제를 흡입하고 자극제가 함유된 100마이크로리터의 무혈청 배지로 교체하십시오.

astrocytic compartment에서 in vitro BBB를 유도하는 경우 abluminal 배지를 흡인하고 600마이크로리터의 무혈청으로 교체하십시오. 자극제를 함유한 배지는 인간 접촉 혈액-뇌 장벽 모델을 확립하기 위해 라벨 추적자의 표준 paracellular 또는 transcellular 투과성 분석을 계속합니다. 인간이 불멸하는 성상세포와 뇌 내피 세포는 성상세포와 발이 내피 세포와 접촉할 수 있도록 하는 3개의 미크론 다공성 막에서 배양됩니다.

이 방법은 성상교세포와 becs의 중단 없는 최적의 파종 기간을 허용했으며, 이는 다시 최소한의 세포 손실로 다공성 표면에 강력하게 부착되고 3일 이내에 co-fluency로 성장합니다. 파종 후. 두 세포 유형 모두 SVG 및 von Vand factor VWF NEC에서 신경교섬유산성 단백질 GFAP의 발현 패턴에서 알 수 있듯이 다공성 막에서 세포 특이적 마커를 유지합니다.

접촉식 BBB 모델의 가장 기본적인 특징과 일관되게 astrocytic NFE는 3미크론 기공을 통해 내강 구획으로 들어갈 수 있습니다. 따라서 이 차원의 공극에 안착된 SVG와 BES 사이에 접촉이 잠재적으로 존재할 수 있습니다. 또한, SEM 이미징은 SVG와 BBC가 체외 BBB 접촉 모델의 물리적 장벽 기능에 인위적으로 기여하는 현상인 멤브레인 기공에서 직접 성장할 수 있음을 나타냅니다.

본 연구에서는 TPAA 섬유소용해제가 BBB에 미치는 영향을 조사하기 위해 인간 접촉 BBB 모델을 사용하였다. 이러한 시험관 내 연구는 TPA가 실제로 농도 및 시간 의존적 방식으로 온전한 BBB의 투과성을 증가시켰으며, 둘 다 약리학적으로 관련된 범위 내에 있음을 확인했습니다. SVG 성상세포의 극적인 형태학적 변화는 TPA에 노출된 후 다공성 막에서 분명하며, 이는 TPA에 대한 성상세포 반응이 TPA에 의한 BBB 개방에 의해 유발됨을 시사합니다.

이 방법은 뇌졸중 환자에서 혈전을 용해하기 위해 사용되는 TPAA 혈전용해제에 대해 혈액뇌장벽이 어떻게 반응하는지 조사하는 것을 목표로 하는 본 연구에서 핵심적인 역할을 했습니다. 이 방법은 문헌에서 처음으로 입증되었으며, 다른 연구자들이 자신의 목적을 위해 이 방법을 채택할 수 있기를 바랍니다.