Name: 방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 인간 혈액-뇌 장벽의 세포 공배양 모델링 기법을 사용하여 신경과학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 뇌 질환 관련 약물 전달 및 장벽 투과성 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (허가 번호 606658)에서 RLM에게 수여 교부금에 의해 투자되었다.

1. 세포 배양 (이전 BBB 조립에 3-7 일) 1.1. 차 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs) 를 BECs는 상업적으로 수득 하였다. 세포는 정상적인 인간의 뇌 피질 조직의 디스 파제 해리에 의해 생성 및 통로 (3) (&lt;12 인구 doublings) 냉동 제공되었다. <ol><li> 하층 : 제조 업체의 지침에 따라 &quot;첨부 인자&quot;와 코트 조직 문화 선박. </li><li> 세포의 유지 보수 : 혈청이 포함 된 완전한 매체를 BECs을 유지한다. 완전한 무 혈청 배지에서 실험, 문화를 BECs하십시오. 가습 5 % CO 2에서 세포를 유지, 37 ° C에서 21 % O 2 배양기 참고 : DMEM/F-12 15 mM의 HEPES, 10 % (v / v) 소 태아 혈청 (FCS)으로 보충하면서 특수한 시약에 대한 대안으로, 0.1 % (w / v) 젤라틴 용액 도포 시약으로 사용할 수, 2 밀리미터 L-글루타민, 50 μg/ ㎖ 젠타 마이신, 20 ㎍ / ㎖의 헤파린 및 20 ㎍ / ml의 내피 세포 성장 보충 BEC의 유지 보수를 위해 사용될 수있다. </li><li> 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:6 1:3 분할 합류를 BECs : 실험에 대한 하위 배양. 3 일마다 유지 보수 매체를 변경합니다. 15 구절를 BECs을 사용합니다. </li></ol> 1.2. SVG 인간 태아 Astroglial 셀 라인 SVG 인간 태아 astroglial 세포 (22)는 원래 복제 결핍 유인원 바이러스 (40)로 형질 전환 된 인간 태아의 두뇌의 차 문화에서 파생되었다. <ol><li> 정비 : 20 % (v / v) FCS (그들의 부모 일차 전지 (22)를 유지하는 데 사용되는 동일한 혈청 백분율) 2 ㎜의 L-글루타민, 50 U / ㎖의 페니실린으로 보충 얼의 균형 염 용액과 최소 필수 배지에서 농경 SVG 세포 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신. 가습 된 5 % CO 2, 21 % O 2에서 세포를 유지 </37 ° C에서 서브&gt; 인큐베이터 </li><li> 다음 사용을 위해 의도 된 시간 (3-7 일간)에 따라 1:10, 1:5 비율로 분할 합류 SVGs : 실험에 대한 하위 배양. 트립신의 제거로 인해 매체에서 혈청의 높은 내용으로 필요하지 않습니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 최대 20 구절 SVGs를 사용합니다. </li></ol> 2. 인간의 체외 BBB 모델의 조립 및 공동 배양 (0 일) 의견 체외 접촉 BBB 모델은 인간의 수정, 발행 프로토콜 13, 23에 따라 제조된다. 2.1. 삽입의 코팅 <ol><li> 공급 된 24 웰 플레이트의 우물에서 조직 문화 삽입 (폴리 에스테르 다공성 막과 직경 6.5 mm, 3 ㎛의 기공 크기)를 놓습니다. 삽입의 코트 내강면 <s> </s> 밤새 쥐 콜라겐 가습 37 ° C 배양기에서 I (20 ㎍ / cm 2, 132 μg의 50 μL/ ㎖ 콜라겐 밀리 Q 물에 0.02 % 아세트산 I (MQH 2 O)). 잔류 산을 제거하는 MQH 2 O와 (abluminal 및 내강 측면에서 모두)를 한 번 삽입을 씻으십시오. 참고 : 뇌의 모세 혈관의 기저막은 콜라겐을 포함하지 I하지만 주로 라미닌, 콜라겐 IV 형의 아형, nidogens 및 헤파 란 황산 프로테오글리칸 9. 이러한 이유로, 몇몇 연구자들은 콜라겐 IV, 피브로넥틴 (13) 또는 매트 리겔 더 확실한 BBB 모델링 (BD 바이오 사이언 시즈) (16)와 같은 코팅제를 사용한다. </li></ol> 2.2. 밑면 (Abluminal) 막 표면에 파종 SVGs <ol><li> 삽입 전환 부드럽게 다공성 막 탄력있는 실리콘 튜브의 짧은 조각의 테두리에 맞게, 잘 abluminal 표면 위에 기본적으로 새를 만드는 ( &quot;외부 튜브&quot;~ 10mm 길이, 8mm 내경 1.6 mm 벽) (그림 2A). </li><li> 삽입 니의 밑면DS 미디어 누설을 방지하기 위해 밀봉된다. 플라스틱 밀봉 원뿔 일단 밀봉 먼저, (도 2B;; ~ 8mm 길게, 3.2 mm, 내경 1.6 mm의 벽 &quot;의 내부 튜브&quot;라고) 실리콘 튜브로 이루어지는 플러그 (도 2A 및 2B)을 제조 (~ 3mm 긴; 0.2 ㎖의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 튜브 바닥 절삭에 의해 제조;도 2b 참조).이 원뿔 내부 튜브 내강을 밀봉, 또한 인서트에 타이트한 피팅 가장자리 넓혀 아닙니다. 그것은 막에서 최대 - ~ 1-2mm (그림 2A)에 도달 할 때까지 다음, 멸균 집게를 사용하여 내강 공동 사전 그것으로 실리콘 플러그를 삽입합니다. </li><li> 다음, 200 ㎕의 SVG 유지 보수 매체에서 4 × 10 4 SVG 세포 (종자 자체의 ction의 위 1.2.2) 직접 잘 abluminal 막 표면 위의 실리콘 (그림 2A)로. SVGs가 인큐베이터에서 최소 4 시간 동안 부착 할 수 있습니다. 주 : 무균 두 개의 6 - 웰 플레이트 (다른 것에 반전 한 접시, 그림 2C) 사이에 조립 삽입을 수송 유지하기 위해 절차를 수행하는 동안 여과되지 않은 공기에 노출을 최소화 할 수 있습니다. 실리콘 튜브 및 플러그는 에탄올에 세척하고 나중에 사용하기 위해 멸균된다. 참고 : 사용 플러그 만 막 기공과 인서트 (2.2.2)이 1 μm의보다 큰 크기. 1 μm의 ≤ 공경 막은 거의 누출되지 않고 외부 실리콘 튜브 (2.2.1) 만 피팅이 필요합니다. 또한, 콜라겐 이외의 코팅제는 I (2.1 절 주 참조)도 3 ㎛의 기공을 통해 leakiness를 방지 할 수 있습니다. 경험적으로이 문제를 확인합니다. </li><li> 당신 성상 세포의 부착 상태를 모니터하기 위해, 병렬로 씨앗성상 세포의 세포 현탁액의 표준 96 - 웰 동일한 볼륨. 이 우물은 6.5 mm의 삽입과 같은 표면적 (0.33 cm 2)이며 삽입 막보다 위상차 현미경으로 세포를보다 쉽게 시각화를 허용합니다. 당신이 컨트롤의 성상 세포의 충분한 준수를 관찰하면 96도, 성상 세포가 적절하게 삽입 막에 또한 준수했다. </li><li> 성상 세포는 충분히 96 - 웰 컨트롤에 부착 한 경우, (위의 주 참조) 조직 문화 후드에 삽입 어셈블리를 전송하고 부드럽게 외부 실리콘 튜브 및 플러그를 제거합니다. 800 μL / 잘 BEC 유지 보수 매체 (위의 섹션 1.1.2)을 포함하는 공급 우물에 정상 (즉, 수직) 방향으로 삽입을 반환합니다. </li></ol> 2.3. 성상 위의 내강 상공 회의소에를 BECs의 시드 콜라겐 코팅 내강 표면에 200 μL와 INSE을 반환 씨 2 × 4를 BECs인큐베이터에 RTS. 2.4. 공동 배양 실험 전에 미디어의 변화없이 BEC 매체 3 일 SVG / BEC 시드 삽입 공 배양. 3. 인간 BBB 모델 실험 (3 일) <ol><li> 각각 600 μL 및 혈청를 BECs 매체의 100 μL로 abluminal 및 내강 미디어를 대체하여 체외 BBB 첫 번째 세척 세포를 자극합니다. </li><li> 다시 내강 매체를 대기음 자극 에이전트와 혈청 배지 100 μL로 교체합니다. 참고 : abluminal 챔버의 자극이 (성상 세포 구획에서 체외 BBB를 활성화하기 위해) 필요한 경우, abluminal 매체를 대기음 및 에이전트를 자극으로 혈청 배지의 600 UL로 교체. </li><li> 내강 자극이 3 × 100 μl를 요구하는 수행하는 경우, 따라서 (세중 각 실험 그룹을 테스트, 우리는 다시 희석 권장<html> 우물 사이에 피펫의 오류를 최소화하기 위해 그룹 당 혈청 배지 350 μL)의 최종 농도 에이전트. </li><li> 전술 한 바와 같이 및 / 또는 봉사자 13,16,25 측정 (후자 우리는 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) - 결합 된 알부민을 사용) 표준 세포층 및 / 또는 표시 추적자 16, 24의 세포 횡단 투과성 분석을 수행합니다. </li></ol> 투자율 (최대의 %) = (: 초기 투자율의 변동을 고려하여 실험 사이 (최대 투자율에 대한 참고가) 세포없이 코팅 된 인서트와 식을 이용하여 차량 투여군 투과성 상대적인 변화를 분석 비히클 군의 평균 투과도 값) X 100 - 차량 기 블랭크 인서트) / (투자율 값의 평균 투과도 값 - 투과성 실험 인서트의 값. 4. 다공성 막에 세포의 시각화 NT &quot;&gt; 코멘트 : 삽입 세포막에 흠 세포는 세포막이 매우 불투명하고 빛의 투과를 방해하기 때문에 위상차 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경으로 관찰하기 어려운 우리가 세포의 다양한 염색 절차를 개발 한이 문제를 처리하기 위해. 크게 막에 세포 모양을 향상시킬 수 있습니다. 여전히 우물에서 삽입에 붙어있다. 세포막은 설치 목적을 위해 염색 과정의 끝에서 제거해야합니다 일반적으로 삽입 세포막을 얼룩 삽입. 4.1. 헤 마톡 실린 염색 <ol><li> 20 분, 인산염 완충 생리 식염수 (130 mM의 NaCl을, 10 mM의 나 2 HPO 4, 10 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 7.2 PBS)에서 (w / v)의 파라 포름 알데히드 (PFA) 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다. PBS에 한 번 씻으십시오. </li><li> 2 분 동안 0.1 % 메이어의 헤 마톡 실린 용액에 삽입 잠수함. </li><li> 조심스럽게 기능을 잠수하여 (수돗물로 삽입을 씻어비커에 들어있는 수돗물에 ERT 부드럽게) 과잉의 물을 피펫. 원하는 블루 색상이 개발 될 때까지 20 초 ~를위한 스콧의 수돗물 솔루션 (2 G / L 탄산 수소 나트륨, 20g / L 망초)에 삽입을 전송합니다. 수돗물 (4.1.3)으로 다시 삽입을 씻으십시오. 옵션 에오신 염색은 수돗물 세척 한 다음 10 초 동안 1 % 에오신 용액에 삽입을 찍기에 의해 여기에 도입 될 수있다. </li><li> 삽입 막을 공기 건조. (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 시야의 이미징을위한 유리 슬라이드에 마운트 주 : 디-N-butylphthalateinxylene (DPX) 설치 매체가 활용되는 경우가 막을 제거하고 설치하기 전에 크실렌 다음에 100 % 에탄올로 삽입을 씻어. </li></ol> 4.2. 주사 전자 현미경 (SEM) <ol><li> 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 수정 (W / V) 20 분 대한 PBS에 PFA. PBS로 세 번 씻으십시오. </li><li> 30 1 %의 분 (W / V의 세포막을 사후 수정MQH 2 O.에서) 오스뮴 </li><li> 물 (4.1.3)에 삽입을 세척하고 (간격 당 10 분 동안 100 % 에탄올로 3 배 후 50 %, 70 %, 5 분 각 90 %) 점점 더 커지고있는 에탄올 그라데이션에 탈수. </li><li> 에탄올 (1시 2분 다음 2시 1분 5 분) : 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 혼합물로 탈수 삽입을 처리합니다. </li><li> 5 분, 건조 된 상태에서 자연 건조 및 저장을위한 100 % HMDS로 삽입을 처리합니다. </li><li> (막 가장자리 주위에 절단) 메스를 사용하여 막을 제거합니다. 주사 전자 현미경에 의해 세포막을 검사합니다. </li></ol> 4.3. 면역 형광 <ol><li> (V / W) PBS에 PFA는 20 분 동안, (, 50 MM 트리스 - 염산의 pH 7.6, 154 mM의 염화나트륨, 0.22 μm의 여과 TBS) 트리스 완충 식염수에 한 번 씻어 얼음처럼 차가운 4 %에 삽입 고정합니다. </li><li> 이전 26 설명한대로 삽입 막에 세포의 면역 염색을 수행합니다. </li><li> (막 에지 주위 절단) 메스를 사용하여 멤브레인을 제거하고 AG에 마운트형광 설치 매체와 아가씨 슬라이드. 형광 현미경으로 멤브레인을 검사합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

뇌 병변에 의료 연구는 많은 번역 어려움을 겪고있다. 급성 허혈성 뇌졸중의 영역에서, 예를 들어, 동물 모델에서 큰 약속을 보여 많은 약물 클리닉 (38, 39)에 실패했습니다. 실망스러운 결과에 대한 이유는 다양하며 인간의 스트로크 시나리오 및 동물 연구 (21)에서 얻어진 결과의 과장에 임상 테스트 시스템의 부정이 (가) 있습니다. 임상 단계에 임상 연구 결과의 예측을 개선하는 한 가지 전략은 추가 개발 인간의 셀 기반 체외 모델에서, 이러한 새로운 약물 및 메커니즘 심사를위한 강력하고 비용 효율적인 툴을 제공하고 더 나은 임상 적으로 관련 도로에 초점을 허용 할 수 있습니다 21. 이 맥락에서, 우리는 여기에 상세하게 설명 인간의 불후의 천체의 새로운 조합을 이용하여 인간의 접촉 BBB 모델의 설립을위한 우리의 실험실에서 수행하는 프로세스cytes (SVGs)과 뇌졸중 관련 현상의 검사에 대한 인간의 차를 BECs. ...

BBB는 말초 혈액 순환과 뇌 지혈 유지에 결정적인 책임 중추 신경계 사이의 특수한 인터페이스이다. 기능적 뇌에 단단하고 역동적 인 게이트웨이를 형성하기 위해 (아래) 몇 가지 세포 및 무 세포 구성 요소에 의해 영향을하는 별개의 뇌 미세 혈관 내피 세포 (를 BECs)를 포함한다. 생리적 조건 하에서 BBB는 뇌에 혈액 세포, 혈장 성분 및 유해 물질, 모든 잠재적 신경 독성의 통과를 제한한다. 병행 BBB 선택적 정확하게 뇌 1,2 환경을 유지하기 위해 뇌와 순환 사이 키 이온 및 영양분 (포도당과 아미노산) 및 대사 노폐물을 교환한다. 최근 몇 년 동안은 BBB의 실패는 신경 퇴행성 염증 관련 질환 (예를 들어, 알츠하이머 질환과 multipl과 같은 만성 뇌 병변의 다양한 발생하는 것을 분명 해지고있다전자는 허혈성 뇌졸중 4와 같은 심각한 상황뿐만 아니라,)는 각각 3 경화증. 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs)의 독특한 BBB 속성은 크게 자신의 대뇌 환경 (5)에 의해 유도, 특히 성상 세포 6,7로됩니다. 다른 이러한 혈관 주위 세포 08 뉴런과 마이크로 글 1,3 세포 유형뿐만 아니라, 기저막 (9),를 BECs을 지원 기능 유닛이 &quot;신경 혈관 유닛&quot;(NVU)를 지칭 함께 형성하는 성장 이해있어 동시에 부부는 공급 모세 혈관 10 신진 대사 요구를 신경. 병적 인 상황에서 BBB의 참여 BBB 관련 연구 11, 12을 지원하기 위해 관내 BBB 모델의 개발에 많은 시도를 기초. 이 모델은 NVU의 원리에 따라 생체 BBB 특성에 가깝게 모방하는 것을 목표로하고 있습니다. 체외 </EM&gt; BBB 모델은 일반적으로 ((주로 소 (13)으로부터, 인간의 14, 쥐 15, 쥐 16, 17, 18 및 돼지 유래) 꽉 접합 형성를 BECs의 단층에 다공성 막에서 배양 함께 지원하는 성상 세포와 의존 광범위 ) 델리 등 2005. (11)에 의해 검토. 성상 세포는 배양액 아무런 가용성 요소 (16)를 통해를 BECs와 통신하여 (막의 상면에 재배)를 BECs 분리 잘 조직 배양의 하단에 비접촉 상태에서 성장 될 수있다. 더 나은 생체 내에서 BBB의 해부학 적 구조를 닮은 고급 모델에서, 성상 세포는 접촉 조건과 직접를 BECs 13,15,17 가까이 (그림 1)에서 멤브레인의 반대편에 배양에 유지됩니다. 이 구성은 설립를 BECs 및 성상 세포 사이에 신체 접촉을 가능하게 할 때 성상 프로젝트다공성 막을 통해 자신의 프로세스. 성상 교세포 최종 피트 작은 기공 크기 (즉, 0.4 μM) (14, 15)을 통과 할 수 있기 때문에 중요한 것은, 발생하는 진정한 담당자의 기공은 직경이 1 ㎛를 ≥해야합니다. 특히, 연락처 BBB 시스템은 자신의 트랜스 내피 전기 저항 (봉사자) 및 각종 추적기 13,17,18의 투과도 값에 대한 비접촉 대응에 우수한 것으로 일부 연구에서 입증됩니다. 미디어 흐름의 또 다른 차원은 최근 뇌 혈관 12, 19의 가까운 시뮬레이션을위한 내피 세포에 전단력을 적용 할 수있는 체외 BBB 모델의 숫자에 추가되었습니다. 접촉 BBB 모델을 생성 할 때 극복하는 한 가지 기술적 장애물은 다공성 멤브레인의 abluminal 표면에 중력에 대하여 성상 교세포의 시드이다. 성상 세포는 단순히의 상단에 미디어의 드롭에 씨앗을 품고 있었다 이전 프로토콜 13,20,, 변환 된 삽입, 수 만 짧은 시드 배 적절한 세포 부착에 대한 불충분 우리의 손에서 발견되었다 (즉, 10 분 13 2 시간 20). 이 기본적인 방법을 사용하여, 긴 성상 세포 부착 기간 (온도, pH 및 습도의 변동을 일으키는) 인큐베이터의 빈번한 개폐함에 인서트의 지속적인 모니터링을 필요로 인한 기공을 통한 매체의 누설에도 요철 세포 시딩하는 경향이있다 특히 1 μm의보다 큰 기공을 사용하는 경우. 여기서, 우리는 접촉 BBB 모델의 준비를위한 일반적인 프로토콜을 설명한다. 우리의 절차는 위에서 언급 한 제한 사항을 해결 반전 삽입에 세포 파종을위한 다른 방법을 포함한다. 방법은 장시간 동안, 평형화 인큐베이터에서 abluminal 막 표면 상 교세포의 교란 부착을 허용한다. 결과적으로, 성상 세포의 균일 한 시드가 장벽 품질을 증가시킨다 달성과 인서트 사이의 기초 투자율 변화를 최소화 할 수 있습니다. 인간 세포의 사용은 인간 관련 연구 21 중요하기 ​​때문에, 우리는 또한이 문서에서 인간의 기본를 BECs의 새로운 조합의 특정 사용을 설명하고 높은 처리량 검사 용량 접촉 인간 BBB 모델의 설립을위한 인간의 성상 세포를 불멸 . 다공성 막에 세포를 보는 것은 다공성 막에 합류하고 세포 형태의 결정에 도움을 줄 수 어렵습니다, 우리는 또한 세부 염색 기술이 될 수 있기 때문에. BBB에 - 급성 허혈성 뇌졸중에 대한 유일한 치료 옵션으로 제공하는 응고 파열 효소 - 마지막으로, 우리는 우리 인간의 BBB 모델은 조직 형 플라스 미노 겐 활성제의 영향 (t-PA)를 조사하는 데에 이용 될 수있는 방법을 예시.

<table><tbody><tr><td>부착 인자</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>뇌 미세혈관 내피 세포(BEC), 일차, 인간</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Complete medium</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>CSC JetFuel</td></tr><tr><td>완전 무혈청 배지</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td> <td>보충CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12와 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>내피 세포 성장 보조제(소 기원)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>외부 실리콘 튜빙</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Pumpsil 브랜드, 8mm 내경, 1.6mm 벽</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이트</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>화이자</td><td></td><td>1,000 U/ml</td></tr><tr><td>헥사메틸디실라잔(HMDS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>인간 뇌 미세혈관 내피 세포</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>내부 실리콘 튜빙</td><td>왓슨말로우</td><td>913.A032.016</td><td>Pumpsil 브랜드, 3.2mm 내경, 1.6mm 벽</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s 헤마톡실린 용액</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>Earle' 함유 최소 필수 배지 s 균형 잡힌 염 용액</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>쥐 콜라겐 I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Cultrex 브랜드</td></tr><tr><td>조직 배양 인서트</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>Transwell 브랜드, 직경 6.5mm, 폴리에스터 다공성 멤브레인 포함, 3 &마이크로; M 모공 크기</td></tr></tbody></table>

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​은 밀접 뇌 환경을 제어하지만, 불 투과성 적응할 뇌 모세관을 포함한다. BBB의 실패는 임상 관련 연구를 지원하기 위해 체외 BBB 모델에서 인간의 개발에 대한 필요성을 만들고, 많은 뇌 병변의 원인에 함축되어 있습니다. 지금까지 설명한 여러 BBB 모델 중, (흐름)없이 정적, 성상 세포 및 뇌 혈관 내피 세포 (를 BECs가) 다공성 막의 양측에 동시 배양하는 BBB 모델을 문의 시뮬레이션 단순화 아직 확실한 시스템으로 부상 높은 처리량 검사 능력 BBB. 그럼에도 불구하고 이러한 모델의 생성은 몇 가지 기술적 과제를 제시한다. 여기서 우리는 인간의 기본를 BECs 및 불후의 인간의 성상 세포의 새로운 조합을 이용하여 연락처 인간 BBB 모델의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 특히, 세부 반전 삽입에 세포 파종을위한 혁신적인 방법뿐만 아니라이 inser를 지정T 염색 기술과 우리가 BBB 관련 연구에 대한 우리의 모델을 사용하는 방법을 예시.

우리는 내피 세포 14,15,27,28과 접촉 성상 세포의 최종 피트의 통과를 허용하는 것으로 3 ㎛의 기공 크기, 다공성 막에 SVGs과를 BECs을 연마했다 인간, 연락처 BBB 모델을 수립하기 위해. 전체 연락처 모델의 개략도는 그림 1 (그림 왼쪽)에 설명되어 있습니다. 연락처 시스템에 의해 제공되는 주요 기술적 과제는 멤브레인의 abluminal 표면의 중력에 성상을 시드 할 필요가있다. 우리는 내강 공동에 삽입 추가 실리콘 플러그 (그림 2)와 미디어의 누설을 방지하면서 주로 abluminal 막 표면 위에 잘 이동할 수있는 실리콘을 만들어이 작업에 성공했다. 상기 방법은 교대로 강하게 최소 셀 손실 다공성 표면에 부착되었고, 이는 SVGs의 최적 중단 시딩 기간 (적어도 4 시간)를 허용했다. 실제로 3 일 SVGs과를 BECs 응용 프로그램을 모두 포스트 뿌리기합류를 귀있는 헤 마톡 실린 염색 삽입의 이미지에서 판단으로 (4.1 절 ...

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

본 절차는 다공성 막의 양면에 성상세포와 혈관내피세포를 공동 배양하여 혈뇌장벽을 인비트로(in vitro) 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 먼저 다공성 막의 루멘 쪽 표면을 세포외 기질로 코팅합니다. 콜라겐과 같은 단백질을 사용하며, 외부 실리콘 튜브와 내부 실리콘 플러그로 인버트 인서트를 고정하여 막의 외측 표면 위에 제거 가능한 웰을 형성합니다.이제 성상세포를 반전된 인서트에 파종하여 외막측(abluminal surface) 표면에 부착되도록 합니다. 그런 다음 튜브를 제거하고, 배지가 채워진 웰 내부에 인서트를 정상 방향으로 배치합니다. 다음으로 혈관내피세포를 인서트의 내강측(luminal compartment)에 파종하여 반대편의 성상세포와 공동 배양합니다.최종적으로, 다양한 자극제에 반응하는 인비트로(in vitro) BBB의 투과성 변화를 측정하기 위해 형광 추적자의 통과 여부를 확인하거나 경내피 전기 저항을 기록합니다. 이 절차의 시연은 제 실험실의 박사후 연구원인 Barry Nigo 씨가 맡아주실 것입니다. 그는 박사 과정 중에 혈뇌장벽을 모사하기 위해 우리가 사용해 온 이 수정된 세포 파종 프로토콜을 개발했습니다. 저희는 더 투박한 파종 방법들을 테스트하며 기공을 통한 배지의 누출과 적은 배지 용량으로 인해 많은 어려움을 겪은 후, 이 절차에 대한 아이디어를 처음 얻게 되었습니다.이는 성상세포(astrocyte)의 부착 기간이 짧고 불충분하게 되는 결과를 초래했으며, 본 절차에서는 이를 해결하고자 합니다. 24웰 플레이트의 웰에 조직 배양 인서트를 배치합니다. 그런 다음 인서트의 내강 표면을 코팅하기 위해 132 µg/mL의 쥐 콜라겐 type I을 50 µL 첨가하고, 잔류 산을 제거하기 위해 가습된 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한 후, 인서트의 외강 측과 내강 측을 모두 이중 증류수로 세척합니다.그런 다음 인서트를 뒤집고 다공성 막의 테두리에 짧은 탄성 실리콘 튜브 조각을 조심스럽게 끼웁니다. 이는 기본적으로 외막면(abluminal surface) 위에 새로운 웰을 만드는 것입니다. 하단을 밀봉하기 위함입니다.0.2 milliliter PCR 튜브의 절단된 팁으로 한쪽 끝을 밀봉한 실리콘 튜브 플러그를 준비합니다. 이제 멸균 핀셋을 사용하여 실리콘 플러그를 루멘강(luminal cavity) 내로 삽입하고, 막(membrane)에서 약 1~2 mm 거리까지 전진시킵니다. 다음으로, 200 microliters의 유지 배지에 현탁된 40,000개의 성상교세포(astrocytes)를 아블루미날(abluminal) 막 표면 위의 실리콘 웰에 직접 분주합니다.아스트로사이트(astrocyte)의 부착 상태를 모니터링하기 위해 6.5 millimeter 인서트와 표면적이 동일하며 위상차 현미경을 통한 세포 시각화가 더 용이한 표준 96 well plate를 사용합니다. 아스트로사이트 세포 현탁액을 동일한 부피로 96 well plate에 분주합니다. 시간이 지남에 따라 이를 모니터링하여 96 well 내의, 그리고 연장선상에서 인서트 막 내의 아스트로사이트가 멸균 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분히 부착되었는지 확인합니다.필터링되지 않은 공기에 노출되는 것을 최소화하기 위해 조립된 인서트를 두 개의 6-well 플레이트 사이에 넣어 운반하십시오. 성상세포가 부착될 수 있도록 세포를 인큐베이터에 넣으십시오. 이때 대조군 96-well 플레이트도 함께 인큐베이터에 넣으십시오.약 4시간 후, 대조군 96 웰을 확인하여 성상세포(astrocytes)가 부착되었는지 확인합니다. 부착되었다면, 인서트 어셈블리를 다시 조직 배양 후드로 옮깁니다. 외부 실리콘 튜브와 플러그를 조심스럽게 제거합니다.그런 다음 인서트를 혈관내피세포 유지 배지가 웰당 800 µL씩 들어 있는 웰에 다시 정상적인 수직 방향으로 넣습니다. 실험 전, 200 µL에 담긴 20,000개의 뇌혈관내피세포를 콜라겐 코팅된 내강 표면에 접종하여 배지 교체 없이 BEC 배지에서 3일 동안 공배양하십시오.실리콘 튜브와 플러그를 에탄올로 세척한 후 오토클레이브하여 추후 사용을 위해 보관하십시오. 인비트로(in vitro) 혈뇌장벽을 자극하려면, 먼저 외측(abluminal) 및 내측(luminal) 배지를 각각 600 µL와 100 µL의 무혈청 BECs 배지로 교체하십시오. 내측 세척액을 흡입하여 제거하고, 자극제가 포함된 무혈청 배지 100 µL로 교체하십시오.성상교세포 구획으로부터 in vitro BBB를 유도하는 경우, abluminal 배지를 흡입하여 제거하고 자극제가 포함된 무혈청 배지 600 µL로 교체합니다. 이후 인간 접촉 혈뇌장벽 모델을 구축하기 위해 표지 추적자를 이용한 표준 paracellular 또는 transcellular 투과성 분석을 수행합니다. 인간 불멸화 성상교세포와 뇌 혈관 내피세포는 성상교세포 돌기(feet)가 내피세포와 접촉할 수 있도록 통과가 가능한 3 µm 다공성 막 위에서 배양됩니다.이 방법은 성상세포(astrocytes)와 혈관내피세포(becs)의 최적의 중단 없는 파종 기간을 가능하게 하며, 이는 결과적으로 세포 손실을 최소화하면서 다공성 표면에 강력하게 부착되어 파종 후 3일째에 공동 합류성(co fluency)까지 성장하게 합니다. 두 세포 유형 모두 다공성 막 위에서 세포 특이적 마커를 유지하며, 이는 SVG의 glial fibrillary acidic protein GFAP 및 NEC의 von Vand factor VWF 발현 패턴을 통해 확인되었습니다.접촉식 BBB 모델의 가장 기본적인 특징과 일치하게, 성상교세포 NFE는 3 µm 기공을 통해 내강 구획으로 통과할 수 있습니다. 따라서 이러한 크기의 기공 위에 위치한 SVG와 BES 사이에 접촉이 잠재적으로 존재할 수 있습니다. 또한, SEM 이미징은 SVG와 BBC가 막 기공 위에서 직접 성장할 수 있음을 나타내며, 이러한 현상은 인비트로 BBB 접촉 모델의 물리적 장벽 기능에 인위적으로 기여합니다.본 연구에서는 인간 접촉식 BBB 모델을 사용하여 혈전용해제인 TPA가 BBB에 미치는 영향을 탐구하였습니다. 이러한 인 비트로(in vitro) 연구 결과, TPA는 실제로 온전한 BBB의 투과성을 농도 및 시간 의존적으로 증가시켰으며, 이는 모두 약리학적으로 유의미한 범위 내에 있었습니다. TPA 노출 후 다공성 막에서 SVG 성상교세포의 극적인 형태학적 변화가 뚜렷하게 나타났으며, 이는 TPA에 대한 성상교세포의 반응이 TPA로 유도된 BBB 개방의 근저에 있음을 시사합니다.이 방법은 뇌졸중 환자의 혈전을 용해하기 위해 사용되는 TPAA 혈전용해제에 대해 혈뇌장벽이 어떻게 반응하는지 조사하는 것을 목표로 한 본 연구에서 핵심적인 역할을 하였습니다. 이는 문헌상으로 본 방법을 처음으로 입증한 사례이며, 다른 연구자들도 각자의 목적에 맞게 이 방법을 채택하여 활용하시기를 바랍니다.

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<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

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방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

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