방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 절차는 다공성 막의 양면에 성상세포와 혈관내피세포를 공동 배양하여 혈뇌장벽을 인비트로(in vitro) 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 먼저 다공성 막의 루멘 쪽 표면을 세포외 기질로 코팅합니다. 콜라겐과 같은 단백질을 사용하며, 외부 실리콘 튜브와 내부 실리콘 플러그로 인버트 인서트를 고정하여 막의 외측 표면 위에 제거 가능한 웰을 형성합니다.

이제 성상세포를 반전된 인서트에 파종하여 외막측(abluminal surface) 표면에 부착되도록 합니다. 그런 다음 튜브를 제거하고, 배지가 채워진 웰 내부에 인서트를 정상 방향으로 배치합니다. 다음으로 혈관내피세포를 인서트의 내강측(luminal compartment)에 파종하여 반대편의 성상세포와 공동 배양합니다.

최종적으로, 다양한 자극제에 반응하는 인비트로(in vitro) BBB의 투과성 변화를 측정하기 위해 형광 추적자의 통과 여부를 확인하거나 경내피 전기 저항을 기록합니다. 이 절차의 시연은 제 실험실의 박사후 연구원인 Barry Nigo 씨가 맡아주실 것입니다. 그는 박사 과정 중에 혈뇌장벽을 모사하기 위해 우리가 사용해 온 이 수정된 세포 파종 프로토콜을 개발했습니다. 저희는 더 투박한 파종 방법들을 테스트하며 기공을 통한 배지의 누출과 적은 배지 용량으로 인해 많은 어려움을 겪은 후, 이 절차에 대한 아이디어를 처음 얻게 되었습니다.

이는 성상세포(astrocyte)의 부착 기간이 짧고 불충분하게 되는 결과를 초래했으며, 본 절차에서는 이를 해결하고자 합니다. 24웰 플레이트의 웰에 조직 배양 인서트를 배치합니다. 그런 다음 인서트의 내강 표면을 코팅하기 위해 132 µg/mL의 쥐 콜라겐 type I을 50 µL 첨가하고, 잔류 산을 제거하기 위해 가습된 37 °C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한 후, 인서트의 외강 측과 내강 측을 모두 이중 증류수로 세척합니다.

그런 다음 인서트를 뒤집고 다공성 막의 테두리에 짧은 탄성 실리콘 튜브 조각을 조심스럽게 끼웁니다. 이는 기본적으로 외막면(abluminal surface) 위에 새로운 웰을 만드는 것입니다. 하단을 밀봉하기 위함입니다.

0.2 milliliter PCR 튜브의 절단된 팁으로 한쪽 끝을 밀봉한 실리콘 튜브 플러그를 준비합니다. 이제 멸균 핀셋을 사용하여 실리콘 플러그를 루멘강(luminal cavity) 내로 삽입하고, 막(membrane)에서 약 1~2 mm 거리까지 전진시킵니다. 다음으로, 200 microliters의 유지 배지에 현탁된 40,000개의 성상교세포(astrocytes)를 아블루미날(abluminal) 막 표면 위의 실리콘 웰에 직접 분주합니다.

아스트로사이트(astrocyte)의 부착 상태를 모니터링하기 위해 6.5 millimeter 인서트와 표면적이 동일하며 위상차 현미경을 통한 세포 시각화가 더 용이한 표준 96 well plate를 사용합니다. 아스트로사이트 세포 현탁액을 동일한 부피로 96 well plate에 분주합니다. 시간이 지남에 따라 이를 모니터링하여 96 well 내의, 그리고 연장선상에서 인서트 막 내의 아스트로사이트가 멸균 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분히 부착되었는지 확인합니다.

필터링되지 않은 공기에 노출되는 것을 최소화하기 위해 조립된 인서트를 두 개의 6-well 플레이트 사이에 넣어 운반하십시오. 성상세포가 부착될 수 있도록 세포를 인큐베이터에 넣으십시오. 이때 대조군 96-well 플레이트도 함께 인큐베이터에 넣으십시오.

약 4시간 후, 대조군 96 웰을 확인하여 성상세포(astrocytes)가 부착되었는지 확인합니다. 부착되었다면, 인서트 어셈블리를 다시 조직 배양 후드로 옮깁니다. 외부 실리콘 튜브와 플러그를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 인서트를 혈관내피세포 유지 배지가 웰당 800 µL씩 들어 있는 웰에 다시 정상적인 수직 방향으로 넣습니다. 실험 전, 200 µL에 담긴 20,000개의 뇌혈관내피세포를 콜라겐 코팅된 내강 표면에 접종하여 배지 교체 없이 BEC 배지에서 3일 동안 공배양하십시오.

실리콘 튜브와 플러그를 에탄올로 세척한 후 오토클레이브하여 추후 사용을 위해 보관하십시오. 인비트로(in vitro) 혈뇌장벽을 자극하려면, 먼저 외측(abluminal) 및 내측(luminal) 배지를 각각 600 µL와 100 µL의 무혈청 BECs 배지로 교체하십시오. 내측 세척액을 흡입하여 제거하고, 자극제가 포함된 무혈청 배지 100 µL로 교체하십시오.

성상교세포 구획으로부터 in vitro BBB를 유도하는 경우, abluminal 배지를 흡입하여 제거하고 자극제가 포함된 무혈청 배지 600 µL로 교체합니다. 이후 인간 접촉 혈뇌장벽 모델을 구축하기 위해 표지 추적자를 이용한 표준 paracellular 또는 transcellular 투과성 분석을 수행합니다. 인간 불멸화 성상교세포와 뇌 혈관 내피세포는 성상교세포 돌기(feet)가 내피세포와 접촉할 수 있도록 통과가 가능한 3 µm 다공성 막 위에서 배양됩니다.

이 방법은 성상세포(astrocytes)와 혈관내피세포(becs)의 최적의 중단 없는 파종 기간을 가능하게 하며, 이는 결과적으로 세포 손실을 최소화하면서 다공성 표면에 강력하게 부착되어 파종 후 3일째에 공동 합류성(co fluency)까지 성장하게 합니다. 두 세포 유형 모두 다공성 막 위에서 세포 특이적 마커를 유지하며, 이는 SVG의 glial fibrillary acidic protein GFAP 및 NEC의 von Vand factor VWF 발현 패턴을 통해 확인되었습니다.

접촉식 BBB 모델의 가장 기본적인 특징과 일치하게, 성상교세포 NFE는 3 µm 기공을 통해 내강 구획으로 통과할 수 있습니다. 따라서 이러한 크기의 기공 위에 위치한 SVG와 BES 사이에 접촉이 잠재적으로 존재할 수 있습니다. 또한, SEM 이미징은 SVG와 BBC가 막 기공 위에서 직접 성장할 수 있음을 나타내며, 이러한 현상은 인비트로 BBB 접촉 모델의 물리적 장벽 기능에 인위적으로 기여합니다.

본 연구에서는 인간 접촉식 BBB 모델을 사용하여 혈전용해제인 TPA가 BBB에 미치는 영향을 탐구하였습니다. 이러한 인 비트로(in vitro) 연구 결과, TPA는 실제로 온전한 BBB의 투과성을 농도 및 시간 의존적으로 증가시켰으며, 이는 모두 약리학적으로 유의미한 범위 내에 있었습니다. TPA 노출 후 다공성 막에서 SVG 성상교세포의 극적인 형태학적 변화가 뚜렷하게 나타났으며, 이는 TPA에 대한 성상교세포의 반응이 TPA로 유도된 BBB 개방의 근저에 있음을 시사합니다.

이 방법은 뇌졸중 환자의 혈전을 용해하기 위해 사용되는 TPAA 혈전용해제에 대해 혈뇌장벽이 어떻게 반응하는지 조사하는 것을 목표로 한 본 연구에서 핵심적인 역할을 하였습니다. 이는 문헌상으로 본 방법을 처음으로 입증한 사례이며, 다른 연구자들도 각자의 목적에 맞게 이 방법을 채택하여 활용하시기를 바랍니다.