3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

다음 절차의 전반적인 목표는 3차원 침습 분석법을 사용하여 암세포의 침습 능력을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 기저막 매트릭스에서 암세포를 배양함으로써 수행됩니다. 그 후 광학 현미경을 통해 5일 이상 매트릭스 내의 세포 침습을 관찰합니다.

마지막 단계에서, 관심 단백질의 위치를 확인하기 위해 세포를 형광 항체로 표지합니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 통해 암세포의 침습 속도와 그에 따른 단백질 발현의 변화를 분석할 수 있습니다. Transwell 챔버 침습 분석과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 3D major gel 침습 분석이 암세포가 성장하는 체내 환경을 더 잘 모사한다는 점입니다.

이 기술의 시사점은 암 치료에 있으며, 이를 통해 암의 침습 및 전이에 관여하는 새로운 단백질들을 연구에서 식별할 수 있습니다. 배양 절차를 시작하기 전, 기저막 매트릭스와 P 200 피펫 및 피펫 팁을 4 °C에서 하룻밤 동안 얼음 위에 놓아둡니다. 다음 날, 차갑게 식힌 200 µL 피펫 팁을 사용하여 매트릭스 50 µL를 공초점 현미경용 1번 유리 바닥 접시 바닥에 나선형 패턴으로 도포합니다.

그런 다음 매트릭스가 응고되는 동안 디쉬를 37 °C, 5% CO2 조건의 세포 배양 인큐베이터에 최소 30분 동안 둡니다. 세포가 분리되기 시작하면 70~80% 정도로 confluence 상태인 100 mm 플레이트의 세포에 trypsin을 처리합니다. 10 mL의 배지로 trypsin을 불활성화한 후, 세포 현탁액을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포가 가라앉는 동안 4 °C에서 100 ×g로 3분 동안 원심 분리합니다.

기저막 매트릭스 디쉬당 하나의 1 mL 미세 원심분리 튜브에 매트릭스 50 µL를 분주하고, 세포 원심분리가 완료되면 튜브를 얼음에 둡니다. 펠렛이 손상되지 않도록 상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포를 1 mL의 배지에 현탁하고 이어서 세포 수를 측정합니다.

2.5 × 10⁴개의 세포를 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 배지를 추가하여 세포 현탁액의 최종 부피를 50 µL로 맞춥니다. 그다음, 1:1 비율로 얼음처럼 차가운 basement membrane matrix 50 µL를 세포에 추가하여 최종 부피를 100 µL로 만듭니다. 굳어진 basement membrane matrix 위에 matrix와 세포 혼합물을 조심스럽게 분주하고, 세포 배양 인큐베이터 내에서 세포가 matrix에 매몰되도록 둡니다.

30분 후, 매트릭스에 2 mL의 배지를 덮고 디쉬를 다시 인큐베이터에 넣으며, 실험 기간 동안 매일 배지를 교체하십시오. 실험 기간 동안 매일 광학 현미경의 10x 대물렌즈를 사용하여 기저막 매트릭스에 부유된 콜로니의 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 이미지 20장을 촬영하십시오. 블라인드 방식으로 이미지를 분석하여 세포 콜로니의 성상 형성(stellate formation) 여부를 결정하십시오.

세포 집합체로부터 하나 이상의 돌출부가 관찰되면 해당 콜로니를 성상(stellate)으로 간주합니다. 3D 콜로니의 형태학적 특징을 조사하려면, 세포를 인큐베이터에서 꺼내 얼음 트레이 위에 놓습니다. 배지를 흡입하여 제거한 후, 2 mL의 차가운 PBS로 콜로니를 3회 세척합니다.

마지막 세척 후, 20% acetone, 80% methanol 용액 2 mL에서 4 °C로 20분간 세포를 고정하고, 디쉬를 다시 상온으로 가져옵니다. 기저막 매트릭스가 상온이 되면, 고정액을 흡입하여 제거하고 앞서 시연한 것과 같이 PBS로 플레이트를 3회 세척합니다. 최종 세척 후, 3% BSA 2 mL를 사용하여 상온에서 최소 30분 동안 세포의 비특이적 결합을 차단합니다.

그다음 3%BSA에 희석한 목적의 1차 항체에서 세포를 상온으로 배양합니다. 한 시간 후, PBS로 결합되지 않은 1차 항체를 3회 세척하여 제거하고, 3%BSA에 적절한 농도로 희석하여 녹인 2차 항체를 첨가한 후 암실 내 상온에서 한 시간 동안 세포를 배양합니다. PBS로 결합되지 않은 2차 항체를 세척하여 제거한 후, PBS에 희석한 2mL의 hext 3, 3, 2, 5 8로 암실에서 5분 동안 세포 핵을 염색합니다.

그런 다음 결합하지 않은 hex를 PBS로 5회 세척합니다. 5번째 세척 후, 기저막 매트릭스-세포 혼합물 위에 마운팅 용액을 직접 첨가하고, 기저막 매트릭스-세포 혼합물의 무결성이 손상되지 않도록 유리 커버슬립으로 마운팅 용액을 조심스럽게 덮습니다. 디쉬를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, 이미지에 사용된 항체에 적합한 레이저 파장을 사용하여 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다.

3D 매트릭스로 침투하는 MDA MB 2 3 1 세포의 모습이 예시되어 있습니다. 1일 차에 매트릭스에 심어진 세포들은 3일 차부터 침윤성 성상 구조를 형성하기 시작했습니다. 5일 차에는 매트릭스의 완전한 침투가 관찰되었습니다.

그 후 형성된 별 모양 군집(stellate colonies)의 수를 측정하여, 디쉬당 침습성 및 비침습성 군집 총 수에 대한 백분율로 표시하였습니다. 또한, 5일 동안 매일 측정을 수행했으므로, 이러한 면역형광 이미지에서 침습 속도 또한 평가할 수 있었습니다. 막 무결성 상실과 기저막 단백질인 laminin five의 확산성 국소화를 나타내는 MDA MB 2 3 1 세포의 대표적인 침습성 별 모양 군집은 MDA MB 2 31 유방암 세포에서 관찰되는 양상과 극명한 대조를 이룹니다.

라미닌 5는 처리되지 않은 비악성 MCF 10 A 세포의 기억 아시닌을 둘러싸고 있는 온전한 기저막 층에 국소화되었습니다. 이 절차 이후, 암세포가 미세환경 조성 후 기질 세포와 상호작용하는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 기질 세포와의 공동 배양을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 암세포의 전이성 확산에 필수적인 암 침습과 이동을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.