3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

다음 절차의 전반적인 목표는 3차원 침습 분석을 사용하여 암세포의 침습 능력을 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 기저막 매트릭스에서 암세포를 배양함으로써 달성됩니다. 그런 다음 광학 현미경을 통해 5일 이상 동안 기질의 세포 침입을 관찰합니다.

마지막 단계에서는 관심 단백질의 국소화를 위해 세포를 형광 항체로 표지합니다. 궁극적으로 암세포 침입 속도와 그에 따른 단백질 발현의 변화는 면역형광 현미경으로 분석할 수 있습니다. Transwell 챔버 침습 분석법과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 3D 주요 겔 침습 분석법이 암이 성장하는 문제를 해결하는 생체 내 환경을 더 잘 모방한다는 것입니다.

이 기술의 함의는 암 치료에 대한 것이며, 암 침습 및 전이에 관여하는 새로운 단백질을 연구에서 확인할 수 있습니다. 배양 절차를 시작하기 전에 기저막 매트릭스 A P 200 피펫과 피펫 팁을 섭씨 4도의 얼음 위에 밤새 놓습니다. 다음날, 얼음처럼 차가운 200 마이크로 리터 피펫의 끝을 사용하여 컨 포칼 번호 1 유리 바닥 접시의 바닥에 50 마이크로 리터의 매트릭스를 나선형 패턴으로 펴 바릅니다.

그런 다음 매트릭스가 세포가 분리되기 시작하면 70-80% confluent 100mm 플레이트의 세포 플레이트인 응고 트립신 눈을 진행하는 동안 최소 30분 동안 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 10ml의 배지로 트립신을 비활성화한 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포가 회전하는 동안 100Gs 및 섭씨 4도에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.

기저막 매트릭스 접시당 1개의 1밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 50마이크로리터의 매트릭스를 분취하고 세포가 회전을 마치면 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입한 다음 다시 흡입합니다. 1ml의 배지에 세포를 현탁시키고 다음에 계산합니다.

4번째 세포로 2.5배 10을 옮기고 세포 현탁액을 50마이크로리터의 최종 부피까지 배지로 채웁니다. 그런 다음 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스를 1:1 비율로 셀에 추가하여 최종 부피 100마이크로리터를 만듭니다. 매트릭스 대 세포 혼합물을 응고된 기저막 매트릭스에 부드럽게 플레이트화하고 세포가 세포 배양 인큐베이터의 매트릭스에 내장되도록 합니다.

30분 후, 매트릭스를 2밀리리터의 배지로 덮고 접시를 다시 인큐베이터에 넣고 실험 기간 동안 매일 배지를 교체하고 실험 기간 동안 매일 한 번 광학 현미경의 10 x 대물렌즈를 사용하여 20개의 차동 간섭을 취합니다. 기저막 매트릭스에 매달려 있는 군체의 대조 이미지. 세포 군집 성상 형성을 결정하기 위해 이미지를 맹목적으로 분석합니다.

군체는 세포의 스테로이드에서 하나 이상의 돌기가 관찰되는 경우 성상으로 간주됩니다. 3D 콜로니의 형태 형성 특성을 검사하려면 인큐베이터에서 세포를 제거하고 얼음 트레이에 놓습니다. 배지를 흡인시킨 다음 2ml의 차가운 PBS로 군체를 세 번 씻습니다.

마지막 세척 후 20% 아세톤, 80% 메탄올 용액 2밀리리터에 세포를 섭씨 4도에서 20분 동안 고정한 다음 접시를 다시 실온으로 가져옵니다. 기저막 매트릭스가 실온에 도착하면 고정제를 흡인하고 방금 시연한 것처럼 PBS로 플레이트를 세 번 세척합니다. 최종 세척 후, 실온에서 최소 30분 동안 2ml의 3%BSA로 세포에 대한 비특이적 결합을 차단합니다.

그런 다음 실온에서 3% BSA로 희석된 관심 항체의 1차 항체에 세포를 배양합니다. 1시간 후, PBS로 결합되지 않은 1차 항체를 3회 세척한 후 1차 항체 용액을 제거하고 3% BSA에 용해된 2차 항체를 적절한 희석액으로 첨가한 후 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. PBS로 결합되지 않은 2차 항체를 씻어낸 후 PBS에서 2ml의 hext 3, 3, 2, 5, 8로 세포핵을 어두운 곳에서 5분 동안 염색합니다.

그런 다음 PBS로 세포에서 결합되지 않은 헥스트를 5회 세척합니다. 다섯 번째 세척 후, 매트릭스에서 세포 혼합물에 직접 장착 매체를 추가하고 세포 혼합물에 대한 기저막 매트릭스의 무결성이 중단되지 않도록 유리 커버 슬립으로 장착 매체를 조심스럽게 덮습니다. 접시를 실온에서 밤새 건조시킨 다음 이 이미지에 사용된 항체에 적합한 레이저 파장에서 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다.

MDA, MB, 2, 3, 1, 3D 매트릭스에 침입하는 셀이 예시되어 있습니다. 세포는 첫째 날에 매트릭스에 삽입되었고 3일째에 침습적인 성상 구조를 형성하기 시작했습니다. 5일째가 되면 매트릭스의 완전한 침입이 관찰될 수 있습니다.

그런 다음 형성된 성상 군체의 수를 계산하고 접시당 침입성 및 비침습적 군체의 총 수에 대한 백분율로 표시했습니다. 또한 5일 동안 매일 측정을 완료했기 때문에 이러한 면역형광 이미지에서 침입률도 평가할 수 있었습니다. MDA MB 2, 3, 1 세포의 대표적인 침습성 성상 군집은 기저막 단백질 laminin five의 막 무결성 상실 및 확산 국소화를 나타내는 것으로 MDA MB 2 31 유방암 세포에서 관찰된 것과 극명한 대조를 이룹니다.

라미닌 5는 처리되지 않은 비악성 MCF 10 A 세포의 메모리 아시닌을 둘러싸고 있는 온전한 기저막층에 국한되었습니다. 이 절차에 따라 기질 세포와의 공동 배양을 수행하여 개발 후 미세환경에서 암세포가 기질 세포와 누화하는지 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 종양학 분야의 연구자들이 암세포의 전이성 확산에 필요한 암 침입 및 이동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.