C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 C형 간염 바이러스 복제 주기의 다양한 단계를 조사하는 것입니다. 이는 먼저 선형화된 HCV 플라스미드 구성물에서 전사체인 HCV 게놈 RNA를 생성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 세포를 H-C-V-R-N-A로 transfection하는 것입니다.

다음으로, 세포는 다양한 시점 및 분석에 대해 도금됩니다. 마지막 단계는 바이러스 역가를 측정하기 위해 세포 배양 상층액을 수집하고 형질 주입된 세포에서 단백질 및 RNA를 채취하는 것입니다. 궁극적으로 역전사, PCR 웨스턴 블로팅 면역형광 분석 및 HCV 역가가 수행되어 강력한 HCV 감염성 세포 배양 시스템을 입증합니다.

HCV 복제 시스템에 비해 이 감염성 C형 간염 바이러스 세포 배양 시스템의 주요 장점은 바이러스 진입, 바이온 조립 및 배출 단계를 조사할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 Vion, 형태 형성 및 병원체 상호 작용과 같은 C형 간염 바이러스학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 잠재적인 백신 후보로 평가될 수 있는 약독화 바이러스 균주의 특성을 분석할 수 있기 때문에 백신 개발로 확장됩니다.

이 방법은 C형 간염 바이러스에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 랩 베르데 계열의 다른 RNA 바이러스에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고품질 HCV 게놈 RNA 연구를 생성해야 하는 과제에 직면하게 됩니다. HCV의 완전한 복제 주기는 유전자형 2, A A, HCV, 일본 전격성 간염 1 분리물의 발견에 따라 세포 배양에서 실현 가능해졌습니다.

바이러스 분석의 시각적 시연은 분석이 중요하기 때문에 분자 및 세포 기술 모두에 대한 전문 지식이 필요하기 때문에 분석에는 분자 및 세포 기술 모두에 대한 전문 지식이 필요하기 때문에 중요합니다.유전자형 2 A 키메라 바이러스, F-N-X-H-C-V 및 F-N-X-H-C-V 폴링 null HCV를 사용하여 바이러스 복제 평가를 수행합니다. 이전에 생성된 바이러스 플라스미드를 2밀리리터 튜브에서 XBA 1 제한 효소로 분해하여 선형화합니다. 그런 다음 플라스미드를 녹두 뉴클레아제로 처리하여 뭉툭한 말단을 생성합니다.

음이온 교환 크로마토그래피로 분해된 플라스미드를 정제합니다. DNA에 AROS 겔 전기영동을 실시하여 선형화된 플라스미드의 무결성을 검증합니다. 다음으로, T 7 RNA 중합효소 반응 성분이 포함된 0.2 millilit 튜브에 선형화된 플라스미드 DNA 템플릿을 추가하여 HCV 게놈 RNA 전사체를 합성합니다.

RNA purification kit를 사용하여 새로 합성된 DNA로 처리된 RNA를 정제합니다. 그런 다음 Agros 젤 전기 영동에 의한 RNA 생산을 확인하십시오. 그런 다음 스펙트럼 측광법으로 RNA를 정량화합니다.

트립신 효소 처리를 사용하여 HU 7 기반 부착 세포를 분리하고 세포를 50ml 원뿔형으로 수집합니다. 두 개의 다음 원심 분리 resus. 원심분리를 반복한 후 저혈청 배지로 세포 펠릿을 현탁시키고, 저혈청 배지에 10회에서 밀리리터당 7개의 세포로 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 총 10마이크로그램의 전사된 바이러스 RNA와 400마이크로리터의 재현탁 세포를 사전 냉각된 0.4cm 전기천공법에 혼합하고 270볼트, 100옴 및 950마이크로페레에서 전기천공을 사용하여 바이러스 RNA를 세포로 전달합니다. 완료되면, 이 시점에서 15% FBS로 10ml의 완전 성장 배지에 전기천공된 세포를 재현탁하고, T 25 플라스크의 세포를 플라스크당 6개의 세포에 약 1.2배로 플레이팅하고 48웰 플레이트에서 48개의 웰 플레이트를 한 번에 10개에서 웰당 네 번째 셀로 4, 48 및 96시간 동안 플레이트합니다. transfection 후 4-8시간 후에 배지를 10%FBS가 함유된 새로운 성장 배지로 교체하여 배양된 플라스크 및 플레이트에서 죽은 세포 파편을 제거합니다.

혈청학적 피펫을 사용하여 48N 96시간 시점에서 세포 배양 상등액을 15ml 원추형 튜브로 채웁니다. 다음 15, 000 분당 회전수에 원심분리에 의해 모아진 표본에서 세포질 파편을 제거한다 4 섭씨 온도에 10 분 후에 분리기분리. cell-free 상등액은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

표시된 시점에서 웨스턴 블롯 및 역전사 정량 PCR 또는 R-T-Q-P-C-R에 의한 단백질 및 RNA 분석을 위해 세포를 라이스합니다. 역전사효소(reverse transcriptase enzyme)를 사용하여 전체 세포 RNA 1마이크로그램을 역전사하고 0.2ml 튜브에서 5개의 프라임 미번역 영역에 결합하는 HCV 감지 가닥에 대한 특정 프라이머를 사용합니다. 또한 Realtime PCR 시스템을 사용하여 HCV 감지 스트랜드 프라이머를 사용하여 알려진 게놈 사본의 F-N-X-H-C-V-R-N-A를 역전사합니다.

QPCR 슈퍼 믹스를 함유한 특정 HCV 프라이머 및 DNA 결합 녹색 염료를 사용하여 생성된 전사된 CD NA의 50나노그램을 사용하여 QPCR을 수행합니다. QPCR을 실행할 때 다음 조건을 사용하여 QPCR 다음에 오는 H-C-V-R-N-A 복사 번호를 확인합니다. 96시간에 transfection된 바이러스 RNA에서 세포 용해물을 분리합니다.

SDS 페이지를 사용한 사후 transfection. 그런 다음 겔에서 분해된 단백질을 트랜스 플롯 터보 방법으로 poly vine di fluoride membrane으로 옮깁니다. PBS에 5%탈지유와 0.2%tween 20이 함유된 차단 용액을 사용하여 멤브레인을 차단하고 용기에 넣습니다.

1차 마우스 단클론 항체와 S3를 1/1000 희석으로, 베타 액틴을 1/5, 000 희석으로 섭씨 4도의 냉장실에서 멤브레인을 배양합니다. 배양 후에, 5, 000 희석에 1개에 말 무 peroxidase에 활용된 염소 반대로 쥐 면역 글로불린 G를 추가하고 chemiluminescence에 의하여 검출하십시오. 이 시점에서 면역형광 분석을 위해 메탄올을 사용하여 마이너스 섭씨 20도에서 30분 동안 transfection된 세포를 고정합니다.

완료되면 면역형광 분석법으로 차단한 후 PB S3로 세포를 세척하고 완충액을 차단한 후 토끼 다클론 항 NS 5 1 차 항체 및 마우스 단클론 항 DS RNA 항체 J 2를 1 대 200의 희석액으로 사용하고 섭씨 4도의 냉장실에서 5 시간에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후 1차 항체 후 PB S3로 세포를 세척합니다. 그런 다음 염소 항 토끼 면역 글로불린 G 4, 8, 8 다클론 2 차 항체 및 염소 항 뮤즈 면역 글로불린 5, 9, 4 다클론 2 차 항체를 1000 분의 1 희석으로 추가하고 탁상용 로커에서 실온에서 1 시간 동안 배양합니다.

PB S3로 세포를 세척한 후 herx die를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경을 사용하여 관찰합니다. 다음 플레이트는 순진한 색조, 7.5 0.1 세포에서 웰 당 세 번째 세포에 약 3 배 10을 곱합니다. 다음날 96 well plate를 사용하여 성장 배지를 사용하여 H-C-V-R-N-A 형질 주입된 세포에서 수확한 무세포 배양 상등액을 10배 연속 희석하고 색조에 3회 접종합니다.

7.5 0.1 세포: 감염 후 72시간이 경과한 시점에 메탄올을 사용하여 마이너스 20°C에서 30분 동안 세포를 고정하고, 앞서 설명한 조건을 사용하여 H-C-V-N-S 5 A 단백질에 대한 아미노 염색 단백질을 저장한다. 바이러스 희석률이 가장 높은 웰의 NS five, A positive cell foci를 세고 밀리리터당 평균 초점 형성 단위 수를 계산합니다. 선형화된 HCV 플라스미드 품질은 겔 전기영동에 의해 평가되었습니다.

H-C-V-D-N-A는 9.6 Kilobases에서 단일 RNA 생성물을 수득한 시험관 내 전사를 매개하는 T 7 RNA 중합효소를 적용했습니다. R-T-Q-P-C-R 결과는 야생형 바이러스가 게놈을 효율적으로 복제했음을 나타냅니다. 야생형은 poll null 바이러스에 비해 1-3 log 더 높은 수준의 게놈 복제를 보였습니다.

야생형 바이러스는 바이러스 단백질 분열 및 게놈 복제에 관여하는 NS 3 단백질을 생성했습니다. 야생형 바이러스는 또한 야생형 형질주입 세포의 세포 세포질에 국한된 NS 5 단백질과 NS 5 단백질과 이중 가닥 RNA co를 발현하여 활성 바이러스 복제 바이러스 역가 측정을 시사하며, 야생형 바이러스가 전염성이 있으며 형질주입 후 6시간에 감염성 입자 밀리리터당 10, 000 병소 형성 단위 이상을 생성한다는 것을 나타냈습니다. 야생형 바이러스와 극 null 바이러스는 모두 유사한 루시페라아제 활성을 보였으며, 이는 유사한 transfection의 입력 수준을 나타냅니다.

그러나 RNA는 형질주입 후 48시간 및 96시간에 번역되었습니다. 야생형 바이러스는 poll null 바이러스에 비해 게놈 복제 수준이 증가한 것으로 나타났습니다. 야생형 바이러스는 또한 바이러스 NS 3 단백질을 생성했습니다.

poll null 바이러스는 기본 수준의 루시퍼라제 활성을 가졌던 반면, 야생형 바이러스는 poll null reporter 바이러스에 비해 2-3 로그 높은 복제 수준을 가졌습니다. 일단 숙달되면 TC형 간염 바이러스 분석이 제대로 수행되면 2주 안에 완료할 수 있습니다 이 절차를 시도하는 동안 견고한 세포와 고품질 HCV 게놈 RNA 전사체를 보유하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 동물 모델 시스템에서 HCV 균주 특성을 분석하여 생체 내 적합성 및 숙주 병원체 상호 작용을 조사할 수 있습니다.

감염성 HCV 세포 배양 시스템의 개발은 연구자들이 HCV 복제 주기의 비리온, 형태 형성 및 바이러스 출구 단계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 C형 간염 바이러스 복제 주기의 여러 단계를 특성화하기 위해 다양한 바이러스 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. C형 간염 바이러스와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 안전 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.