Name: C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 학습하세요 C형 간염 바이러스(HCV) 복제 주기를 분석하는 방법을. 플라스미드로부터 HCV 게놈 RNA를 생성하고 세포에 전염시켜 감염성 세포 배양 시스템을 확립하는 프로토콜입니다. 이 기법은 바이러스학 및 감염성 질환 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Huh-7.5.1 세포주를 제공해 주신 F. Chisari에게 감사드립니다. 원고를 편집해 주신 Justine Ho에게 감사드립니다. 이 작업은 Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award와 National Center for Advancing Translational Sciences의 지원을 받았으며 V.A.에 UL1TR000124 지원했습니다.

프로토콜의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 1. 셀 <ol><li> 15 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 비 필수 아미노산, 10mM의 헤 페스, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖), 및 2 mM의 L-글루타민을 포함 완전 성장 배지를 준비한다. </li><li> C 형 간염 바이러스의 복제주기의 체외 분석을 위해 위의 보충제를 포함하는 완전한 성장 매체 허-7.5.1 셀 (13)을 유지한다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 지정한 보충 성장 매체 허-7.5.1 세포 배양 바이러스의 변종. </li></ol> 2. 바이러스와 플라스미드 구문 <ol><li> HCV RNA의 상보 적 DNA (cDNA를) 형태로 생성 및 유전자 조작의 용이성을 위해 플라스미드 벡터로 복제. 참고 : 일본의 전격 성 간염 1의 발견은, JFH-1 (유전자형 2A의 HCV), HCV 연구에 대한 비판적이고있다 격리주로 HCV의 복제 사이클 11-13를 연구하는 데 사용. JFH-1 HCV에 따라 간 및 intragenotypic 키메라 바이러스는 일반적으로 연구 14-18에서 사용된다. 합성 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 monocistronic 키메라 기자 균주의 건설은 이미 19 건설 자세한 내용은이 프로토콜의 범위를 벗어 설명했다. </li><li> 그것은 (뉴클레오티드 1-2878) J6CF 부모의 변형 (NCBI의 기탁 아니오. AF177036)의, 같은 5&#39;NTR, 구조 지역과 P7 및 NS2 비 구조 영역의 일부를 포함로 pFNX-HCV intragenotype의 2A 바이러스를 사용 잘 JFH-1 바이러스 균주 (NCBI의 기탁 없습니다. AB047639)의 비 구조적인 구성 요소로. 참고 : FNX-HCV가 JC1의 intragenotype의 2A 키메라 HCV의 순서에 따라 합성 하였다 이전에 (15) 보도했다. </li><li> R을 삽입하여 (단계 2.2 이상) pFNX-HCV의 변형을 기반으로 monocistronic 키메라 기자 바이러스 구조, pFNX-Rluc를 생성5 &#39;NTR과 (NT 388과 389 사이의) 핵심 유전자 사이 enilla 루시퍼 라제 유전자. 이어서, 절단 신호로서 작동 할 구제역 바이러스 2A (F2A) 펩티드 서열을 사용하여 루시 페라 제 유전자 및이 구조의 핵심 유전자를 연결한다. </li><li> pFNX-HCV 또는 pFNX-Rluc 바이러스 배경을 사용하여 RNA 중합 효소 널 (폴) 바이러스 구조 엔지니어. , AAG의 아미노산 잔기 이러한 바이러스 백본 중 하나의, NS5B 효소 촉매 잔류 물, GDD (8615-8623을 NT AA 2,759에서 2,761 사이)를 교체합니다. </li></ol> 3. 체외 HCV의 RNA의 전사 <ol><li> intragenotype의 2A 키메라 바이러스 FNX-HCV와 FNX-HCV의 유류 널 (null) 바이러스 복제 (그림 2A)의 평가를위한 (폴) HCV를 사용합니다. </li><li> 를 XbaI 제한 효소로 바이러스 플라스미드를 선형화 한 다음 평활 말단을 생성하는 녹두 클레아로 취급한다. 음이온 교환 크로마토 그래피에 의해 소화 플라스미드를 정화. O를 무결성을 확인F 겔 전기 영동 (그림 2B)를 아가 로스의 DNA를 쓰는하여 플라스미드를 선형화. </li><li> -T7 RNA 중합 효소를 이용하여 선형화 된 바이러스 플라스미드를 표기. </li><li> RNA 정제 키트를 사용하여 새로 합성 된 DNA 분해 효소 처리 RNA를 정화. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동 (그림 2C)에 의해 RNA의 생산을 확인합니다. </li><li> 분광 광도법에 의한 RNA의 양을. </li><li> 10 μg 작업 분량 씩 -80 ° C에서 생성 된 RNA를 저장합니다. 참고 : 같은 시간에 각각의 바이러스 샘플 및 제어를위한 모든 RNA를 해독하여 각 실험 설계 내에서 RNA의 품질의 변화를 최소화하기 위해. </li></ol> 4. HCV RNA 형질 및 시료 채취 <ol><li> 트립신을 사용하는 허-7.5.1 세포를 수확. </li><li> 세포 원심 분리기를 씻어 차가운 낮은 혈청 미디어로 두 번 정학을 재현 탁합니다. ML 당 1 × 10 7 세포에서 낮은 혈청 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 10 &amp; # 총 혼합956, 0.4-CM의 일렉트로 큐벳에 재현 탁 세포 (4 × 10 6 세포)의 400 μL와 전사 바이러스 성 RNA의 g. 270 V에서 전기 충격을 통해 100 Ω, 950 μF을 세포를 형질. </li><li> 15 % FBS와 10 ㎖ 완전한 성장 미디어 일렉트로 세포를 Resuspend. 참고 : 허-7.5.1 세포는 15 % 소 태아 혈청에서 배양 할 때 일렉트로 세포의 증가 생존을 볼 수 있습니다. </li><li> 4, 48 및 96 시간 : 두 T-25 플라스크 (플라스크 당 ~ 1.2 × 10 6 세포) 및 48 - 웰 플레이트 다음과 같은 시점마다 (물론 당 1 × 10 4 세포)에서 세포를 접시. </li><li> 배양 플라스크와 접시에서 죽은 세포 파편을 제거하기 위해 10 % FBS와 신선한 보충 성장 매체와 4-8 시간 후 - 형질 전환에 용지를 교체하십시오. </li><li> 48, 96 시간의 시점에서, 4에서 10 분 동안 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세포를 수집 한 시료에서 세포 파편을 제거 수확 세포 배양 상청액 º C. </li><li> -80 º C에서 세포가없는 상층 액을 저장 를 Lyse 웨스턴 블롯에 의해 단백질과 RNA 분석 및 지정된 시점에서 전사 정량적 PCR 역 세포. </li></ol> 5. HCV 게놈 복사를 평가하기위한 전사 정량 PCR (RT-qPCR에)를 역방향 <ol><li> HCV 게놈 RNA 카피 수를 결정하는 두 단계 RT-qPCR에를 수행합니다. </li><li> 역 쓰다 1 역전사 효소 및 5&#39;NTR (JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;)에 결합 HCV의 가닥 특정 프라이머 사용하여 총 세포 RN​​A ㎍의 또는 하우스 키핑 유전자 peptidylprolyl 이성화 효소 G (삑 R 특정 프라이머를 : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). 또한 HCV의 가닥 프라이머를 사용하여 알려진 게놈 사본 (10 1 9 표준 10)의 (3 단계에서 생성 된) FNX-HCV RNA를 표기 역. </li><li> (JFH RT HCV 특정 프라이머를 이용하여 생성 된 cDNA의 전사 50 NG를 사용하여 qPCR에를 수행QF : 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;)와 DNA는 qPCR에 슈퍼 믹스를 포함하는 녹색 염료를 결합. 또한 하우스 키핑 유전자 삑위한 qPCR에 수행 (프라이머 삑 F : 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;, 삑 R : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) 참고 : 예제를 통해 정확한 세포 내 HCV의 RNA 수준을 계산하는 경우, 휴대 하우스 키핑 유전자 삑를 사용 정규화에 대한 발현 수준 (CT주기). 카피 수 결정을위한 표준으로 FNX-HCV 게놈의 카피 수를 사용합니다. </li><li> 15 초 동안 95 º C ~ 60 : qPCR에를 실행하는 HCV의 RNA 사본의 수를 결정하는 경우 다음과 같은 조건을 사용하여 &#160; 실시간 PCR 시스템을 사용하여 30 초 (40 회)에 대해 C를 º. </li><li> 게놈의 복제 결과를도 3a 및도 3b를 참조하십시오. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅 분석 HCV 단백질 발현 (그림 3C)를 검출 <ol><li> 세포 용 해물의 FR을 사용하여톰 바이러스 성 RNA는 단백질 웨스턴 블롯 분석을위한 96 시간 포스트 형질에 형질 전환. </li><li> SDS-PAGE 및 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인으로 이동을 사용하여 세포 용 해물을 해결. </li><li> 5 % 탈지 분유, 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 0.2 % 트윈 20을 함유하는 차단 용액을 사용하여 멤브레인을 차단. </li><li> 기본 마우스 단일 클론 항체 NS3와 막 (1 천에 희석) 및 베타 - 액틴 (1 5,000 희석)을 품어. </li><li> 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (1 5,000 희석)에 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG의 추가 및 화학 발광에 의해 감지. </li></ol> 7. 면역 형광 분석 (IFA) <ol><li> 면역 형광 분석 -20 º C에서 30 분 동안 메탄올을 사용하여 HCV 감염과 형질 전환 세포를 고정합니다. </li><li> PBS로 3 회 세포를 세척하고 IFA 버퍼를 차단으로 차단합니다. </li><li> 토끼 폴리 클로 날 또는 마우스 단일 클론 항-DSR (친절 박사 다스 굽타, UCLA에서 제공) 항 NS5A 주로 항체를 사용하여NA 항체 1:200 (1 ㎍ / ㎖)의 희석 J2와 5 시간에 4 박에서 알을 품다 º C. </li><li> 세 번 차 항체 후 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 염소 항 - 토끼 IgG의-488 클론 차 항체 또는 1:1,000 희석 (1 ㎍ / ㎖)에 염소 항 - 마우스 IgG-594 클론 차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> PBS 형광 현미경 (그림 3D)를 사용하여 훽스트 염료 및 뷰를 사용하여 3 회 얼룩 핵으로 세포를 씻으십시오. </li></ol> 8. 측정 바이러스 역가 <ol><li> 판 순진 허-7.5.1 세포 약 3 × 10 3 세포 / 잘 96 - 웰 플레이트를 사용하여. 다음 날, 성장 미디어를 사용하여 HCV의 RNA 형질 세포에서 수확 한 무 세포 배양 상층 액의 10 배 시리얼 희석을 수행하고 허-7.5.1 세포에 배수로 접종. </li><li> -20에서 30 분 동안 메탄올 (사용하여 72 시간 게시물 감염에서 세포를 수정 </suC)과 7 장에서 언급 한 바와 같이 HCV의 NS5A 단백질에 대한 immunostain º P&gt;. </li><li> NS5A 긍정적 인 초점을위한 카운트 밀리리터 당 포커스 형성 단위의 평균 수 (FFU)를 계산하는 가장 높은 희석을 사용합니다. HCV 역가 그림 4를 참조하십시오. </li></ol> 바이러스 게놈 복제 및 감염성 9. 닐라 루시퍼 라제 리포터 분석 <ol><li> 바이러스 게놈 복제, 48 - 웰 플레이트에 세중 판 HCV의 RNA-일렉트로 허-7.5.1 세포 (1 × 104 세포 / 웰) 평가하십시오. </li><li> 를 Lyse 6 시간에서 수동 용해 완충액 75 μL, 48 시간, 96 시간 후 - 형질을 가진 세포. </li><li> -80 º C에서 실내 온도와 매장에서 15 분 동안 부드럽게 플레이트 록 </li><li> , 레 닐라 루시퍼 라 아제의 효소 활성을 측정하고, 실온으로 단백질 및 파쇄물 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약을 해동. </li><li> 96 - 아, 잘 당 단백질의 용해 액의 20 μl를 추가합니다<html> L 화이트 발광 판과 루미에 접시를 놓습니다. </li><li> 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약 (엘렌 테라 기판 + 버퍼) 잘 당 2 초 미리 읽기 지연 시간 후 100 μl를 분배; 10 초 동안 방출되는 빛을 통합 할 수 있습니다. </li><li> 생물학적 삼중의 루시퍼 라제 값으로부터 각 샘플에 대한 평균 및 표준 편차를 계산 및 통계 분석 데이터 (도 5) 주체. </li><li> 감염을 평가하기위한 48 - 웰 플레이트에 순진 허-7.5.1 세포에 세중 표시된 시점 (48 시간 및 96 시간)에 대한 HCV의 RNA 형질 세포에서 얻은 세포가없는 상층 액 500 μl를 접종. </li><li> 물론 후 6 시간 게시물 감염 당 신선한 매체의 500 μL와 바이러스 접종을 교체합니다. </li><li> 를 Lyse 8.2-8.7 (그림 5) 단계에 설명 된대로 레 닐라 루시퍼 라제 분석에 48 시간의 후 감염과 피사체에 세포. </li></ol>itle &quot;&gt; 10. 통계 분석 <ol><li> 그래프에 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P 값은 짝 t 테스트에 의해 산출 하였다. </li></ol>

<ol><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology.%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li>
<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li>
<li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hepatitis+C%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li>
<li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindenbach%2C+BD+%22Flaviviridae%3A+viruses+and+their+replication+in+Fields+Virology%22">Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology</a>. , Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).</li>
<li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+in+2010%3A+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li>
<li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection%3A+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li>
<li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A%2C+non-B+viral+hepatitis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li>
<li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li>
<li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li>
<li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li>
<li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li>
<li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mutations+in+E1%2C+p7%2C+NS2%2C+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li>
<li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+%28strain+TN%29+infectious+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li>
<li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+1a+HCV+%28H77S%29+infection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li>
<li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+%28NS2%29+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li>
<li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li>
<li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li>
<li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li>
<li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li>
<li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li>
<li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 그림은 C 형 간염 바이러스의 복제 사이클을 분석하는 방법을 설명한다. HCV는 인간의 병원체이며, 소정의 바이오 안전성 의정서는 엄격하게 준수해야하는 것입니다. HCV 감염 세포 배양 시스템은 이전 11-13,16,17 설명되었다. 예시 된 프로토콜을 다음과 같은 때 우리가 구현하는 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 다운 스트림 연구에 그대로 전체 길이 바이러스 게놈 RNA의 좋은 품질을 가지고 높은 중요하다. 바이러스의 cDNA를 들고 입력 플라스미드를 선형화하고 신중하게 무디게 할 수있다. XBA I 오버행을 무디게하기 위해 사용 된 녹두 콩 클레아가 아닌 특정 클레아 제와 장시간 배양은 바이러스 게놈의 3 &#39;말단의 손상이나 성능 저하가 발생합니다. 클레아는 ​​페놀 - 클로로포름 추출 또는 음이온 교환 칼럼 정제에 의해 지정된 30 분 인큐베이션 후에 즉시 제거되어야한다. DNA 치료 핵산 분해 효소의 젤 추출로 추천 할 수 없습니다효소는 전기 영동 과정 중에 활성...

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 간경변과 간암의 원인이됩니다. 그것은 350,000의 사람들이 매년 1-3 죽어과 170 만명이 전 세계적으로 영향을 미칩니다. HCV는 9.6 KB의 게놈의 크기와 양의 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈은 단백질 가수 분해 10 폴리펩티드에 다양한 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단된다 ~ 3000 개의 아미노산의 단일 폴리 단백질로 번역된다. HCV는 속 Hepacivirus에 프로토 타입 바이러스와 가족 플라 비 바이러스과 4에 속한다. 노출되면, HCV는 개인의 80 %에 만성 감염을 설정합니다. 감염이 진단은 간 저하를 방지하기 위해 치료 적 개입을 허용 할 수 있습니다 대부분 증상이 적시에 있습니다. 현재 치료는 차선이고 백신은 5,6 사용할 수 없습니다. C 형 간염의 원인은 1989 7 설명했다. HCV 복제를 공부하는 것은 C 형 간염 백신과 치료 연구를위한 중요하지만이 있었다긴 효율적인 바이러스 배양 시스템의 부족에 의해 방해. HCV의 분자 클론은 간내 접종 8시 침팬지에 감염 될 것으로 나타났다. 이어서, HCV 서브 게놈 플리은 세포 배양 시스템 9,10에서 바이러스 게놈 복제 단계를 절개 할 수있는 기술되었다. 유전자형 2A의 HCV의 발견은 JFH-1 (일본어 전격 성 간염 1) 분리, 세포 배양을 감염시킬 수는 HCV의 복제 연구를 11 ~ 13를위한 새로운 길을 열었습니다. 유전자형 2A 변형 JFH-1 간 및 내 유전자형 키메라 바이러스와 유전자형 1 HCV 기반 기반 감염성 문화 시스템뿐만 아니라 14 ~ 18 사용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 단백질 도메인 및 시스 - 작용하는 RNA 요소 (19, 20)의 고해상도 기능 프로파일의지도를 구하는 것이 JFH-1 균주 및 HCV의 intragenotype의 2A 키메라 바이러스를 사용했습니다. 이 기사에 따르면, 우리가 할 수 일상적으로 사용하는 효과적인 문화 시스템을 설명HCV의 복제주기 및 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 단계를 공부. 우리는 바이러스 게놈 복제 및 intragenotype 2a 개의 HCV와 레 닐라 루시퍼 기반 기자 HCV의 새로이 감염을 평가 한 바이러스 분석을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>비 필수 아미노산</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 감소 혈청 매체, 페놀 없음 Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>스크립스 연구소</td><td></td><td>세포주는 프랜시스 치사리 박사가 스크립스 연구소와 시더스-시나이 메디컬 센터</td></tr><tr><td>플라스미드 (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)</td> 사이의 MTA를 실행하듯 Arumugaswami 박사에게 친절하게 제공되었습니다.<td>Cedars-Sinai Medical Center</td><td></td><td>HCV 플라스미드는 중첩된 올리고-뉴클레오티드를 사용하여 Dr. Arumugaswami에 의해 합성되었습니다.</td></tr><tr><td>XBAI</td><td>뉴 잉글랜드 Biolabs Inc.</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>녹두 뉴클레아제</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express 대규모 RNA 생산 시스템</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvette (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항-dsRNA 항체 J2&nbsp;</td><td>영어 & 과학 컨설팅 Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인 패키지</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 등급 차단제 Non-Fat Dry Milk</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>항-C형 간염 바이러스 NS3 항체 [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>항-C형 간염 바이러스 NS3 항체 [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG 고추냉이 과산화효소 (HRP)와 결합&nbsp;</td><td>잭슨 면역 연구소 Inc.</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약&nbsp;</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 real-time PCR 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase 분석 시스템 키트</td><td>Promega</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-Multi Detection System(광도계)</td><td>프로메가</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 세계 인구의 3 %에 영향을 미치는 만성 간염, 간경변 및 간암 등의 심각한 간 질환의 원인이됩니다. HCV는 가족 플라 비 바이러스과에 속하는 포락선 RNA 바이러스이다. 현재의 치료는 완전히 효과가없고, 부작용이 발생합니다. 가능한 HCV 백신이 없습니다. 따라서, 지속적인 노력은 백신과 더 나은 치료를 개발하기 위해 필요합니다. HCV 세포 배양 시스템은 바이러스 진입, 게놈 복제, 포장, 및 송신을 포함하여 HCV 성장의 각종 단계 연구에 중요하다. 제시된 현재 프로 시저에서, 우리는 야생형 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 바이러스 복제를 연구하는 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 유전자를 운반하는 재조합 FNX-Rluc 바이러스를 사용했습니다. 인간 간암 세포주 (허-7을 기준으로)의 시험 관내 형질 도입에 사용 된은 HCV 게놈 RNA를 전사를. 무 세포 배양 상층 액, 단백질 해물과 t전 체 RNA는 HCV의 성장을 평가하는 사후 형질 포인트는 다양한 시간에 수확. HCV 게놈의 복제 상태 정량적 RT-PCR 및 HCV의 존재를 시각화하는 이중 가닥 RNA에 의해 평가 하였다. HCV 단백질 발현은 HCV NS3 및 NS5A 단백질에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역 형광 분석에 의해 확인되었다. 배양 상청 및 바이러스 역가에 감염성 입자를 방출 HCV의 RNA 형질 감염 세포를 측정 하였다. 루시페라아제 리포터 분석법은 HCV의 복제 수준 및 감염성을 평가하기 위해 사용되었다. 결론적으로, 우리는 HCV의 복제주기의 다른 단계를 특성화하기위한 다양한 바이러스 적 분석을 제시한다.

C 형 간염 바이러스는 RNA 바이러스이다. 따라서, 유전자 조작 목적, HCV 게놈 cDNA를 박테리아 플라스미드 벡터에 클로닝되었다. T7 RNA 폴리머 라제 프로모터 서열은 HCV 게놈의 5 &#39;말단 바로 전에 도입되었다. HCV 분석 워크 플로우에 대한 일반적인 개요를 그림 1에 제시되어있다. 정확한 3 &#39;끝 HCV 게놈 RNA를 생성하려면, 플라스미드를 포함하는 HCV 게놈은 XBA I 제한 효소 생성 된 단일 가닥 오버행이 녹두 클레아 소화를 둔화 된 절단된다 . HCV 선형화 된 플라스미드의 품질을 아가 로스 겔 전기 영동 (도 2B)에 의해 평가 하였다. HCV DNA는 시험 관내 전사에 매개 T7 RNA 중합 효소를 실시하고 그 결과 RNA는 9.6 킬로베이스 (도 2c)에서 하나의 제품을 얻었다. 우리는 intragenoty...

C형 간염 바이러스(HCV)는 간경변과 암을 포함한 간 질환을 일으키는 주요 인간 병원체입니다. HCV 감염성 세포 배양 시스템은 HCV 복제의 분자 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HCV 복제 주기의 다양한 단계를 조사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 C형 간염 바이러스(HCV) 복제 주기의 다양한 단계를 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 선형화된 HCV 플라스미드 구조체로부터 HCV 게놈 RNA 전사체를 생성합니다. 두 번째 단계는 세포에 HCV-RNA를 형질전환시키는 것입니다. 다음으로, 다양한 시간대와 분석을 위해 세포를 플레이트에 도말합니다. 마지막 단계는 바이러스 역가 측정을 위해 세포 배양 상층액을 수집하고, 단백질과 RNA 분석을 위해 형질전환된 세포를 회수하는 것입니다. 최종적으로 역전사 PCR, 웨스턴 블로팅, 면역형광 분석 및 HCV 역가 측정을 수행하여 강력한 HCV 감염 세포 배양 시스템을 입증합니다.이 감염성 C형 간염 바이러스 세포 배양 시스템이 HCV 레플리콘 시스템보다 갖는 주요 장점은 바이러스의 진입, 비리온 조립 및 유출 단계를 조사할 수 있다는 점입니다. 본 프로토콜은 비리온 형태 형성 및 호스트-병원체 상호작용과 같은 C형 간염 바이러스학 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 잠재적인 백신 후보로 평가될 수 있는 약독화 바이러스 균주들의 특성 분석을 가능하게 하므로, 그 영향력은 백신 개발까지 확장됩니다.이 방법은 C형 간염 바이러스에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, Flaviviridae 과에 속하는 다른 RNA 바이러스에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 고품질의 HCV 게놈 RNA를 생성하는 데 어려움을 겪게 됩니다. 유전자형-2A HCV 일본어 급성 간염 1 분리주의 발견 이후, 세포 배양을 통한 HCV의 전체 복제 주기 연구가 가능해졌습니다. 해당 분석법은 분자 생물학적 및 세포 생물학적 기술 모두에 대한 전문 지식이 필요하므로, 바이러스 분석 과정의 시각적 시연이 매우 중요합니다.바이러스 복제 평가를 위해 유전자형 내 2A 키메라 바이러스인 FNX-HCV 및 pol-null HCV인 FNX-HCV를 사용하여, 이전에 제작한 바이러스 플라스미드를 2 mL 튜브에서 XBA-one 제한효소로 절단하여 선형화합니다. 그다음, 플라스미드를 mung bean nuclease로 처리하여 평활 말단을 생성합니다.음이온 교환 크로마토그래피를 통해 소화된 플라스미드를 정제하십시오. 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 선형화된 플라스미드의 무결성을 확인하십시오. 다음으로, HCV 게놈 RNA 전사체를 합성하기 위해 T-s

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 조건부를위한 두 가지 방법을...

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

출처: Ren, S., et al. C형 간염 바이러스 복제 분석 프로토콜. J. Vis. Exp. (2014)이 영상에서는 세포 배양 내의 감염성 C형 간염 바이러스를 정량화하는 데 사용되는 형광 포커스 분석법(fluorescence focus assay)을 보여줍니다. 바이러스 상층액의 단계적 희석, 간암 세포의 감염, 그리고 항체 기반 형광 현미경을 이용한 바이러스 복제 부위의 검출 과정을 설명합니다.

형광 현미경을 이용한 감염성 C형 간염 바이러스의 정량 분석

이 비디오는 항바이러스 화합물을 스크리닝하기 위한 바이러스 부착 분석을 보여줍니다. 유전자 변형 C형 간염 바이러스와 루시페라아제를 사용하여 바이러스만 처리한 웰에 비해 공동 처리된 웰에서 낮은 광 강도로 알 수 있듯이 바이러스 부착에 대한 억제 효과를 평가합니다.

항바이러스 화합물 스크리닝을 위한 바이러스 부착 분석

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.

양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학

학습하세요 C형 간염 바이러스(HCV) 복제 주기를 분석하는 방법을. 플라스미드로부터 HCV 게놈 RNA를 생성하고 세포에 전염시켜 감염성 세포 배양 시스템을 확립하는 프로토콜입니다. 이 기법은 바이러스학 및 감염성 질환 연구에 필수적입니다.

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

더 많은 동영상 탐색