에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 에어로졸화된 LPS에 노출되어 일관되고 재현 가능한 기도 호중구증가증을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 식염수에 부유된 LPS를 노출 챔버에 연결된 분무기에 로드하여 수행됩니다. 다음으로 생쥐를 에어로졸화된 LPS에 노출시킨 다음 기관지폐포 세척을 수집하고 세척 내 염증 세포를 계수합니다.

마지막으로, 폐 조직은 포매 및 절편 및 면역 조직 화학 분석을 위해 공식적으로 고정됩니다. 궁극적으로, 기관지폐포 세척액의 총 세포 수와 차등 세포 수는 폐로의 호중구 동원을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 기관내 LPS 투여와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 폐 전체에 에어로졸화된 LPS가 고르게 분포되어 있고 성능이 용이하며 성공적인 적용에 필요한 최소한의 교육입니다.적절한 PPE를 사용하여 LPS 에어로졸을 생성하고 환기가 잘되는 수준 내에서 2개의 생물학적 위험 후드는 분무기에 빨간색 흡입구를 삽입한 다음 분무기를 제공된 튜브에 의해 가압된 실내 공기에 연결하는 것으로 시작합니다. 생산자.

그런 다음 공기 필터를 사용하여 분무기의 출구를 질량 유량계에 연결한 다음 질량 유량계를 전기 공급 장치에 연결합니다. 공기 흐름을 분당 5리터로 조정하고 압력을 1-2bar로 유지한 다음 질량 유량계를 제거하고 공기 흐름을 분리합니다. 그런 다음 분무기의 배출구를 탈착식 뚜껑이 있는 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5mm 플렉시글라스 상자에 연결된 15.9mm 분기 튜브에 연결합니다.

각 상자에는 압력 상승을 방지하기 위해 입구 반대쪽에 5mm 구멍이 있어야 합니다. 이제 각 상자에 최대 5 마리의 마우스를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 분무기를 엽니다.

식염수 또는 식염수 차량에만 용해된 4-8ml의 LPS를 인서트에 채우고 흡입구를 공기 공급 장치에 다시 연결합니다. 동물을 지속적으로 모니터링하고 에어로졸화 중에 공기 공급이 분무기 입구에 단단히 고정되어 있는지 확인하여 에어로졸이 밀폐된 플렉시글라스 상자로 흘러 들어가도록 합니다. 10분 후 공기 공급을 차단하고 동물을 플렉시글라스 상자에 2분 더 두십시오.

그런 다음 뚜껑을 엽니다. 에어로졸이 흩어지도록 하고 실험 종점에서 쥐를 케이지로 되돌려 보냅니다.각 동물에 대해 먼저 가위를 사용하여 흉부를 노출시키기 위해 단일 전방 후방 절단을 만듭니다. 다음으로, 흉골의 앞쪽 끝으로 흉곽을 들어 올리고 폐 조직을 절단하지 않고 가장 복부 지점에서 횡격막에 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 턱 아래에서 전방 후방 방향으로 만나는 두 개의 상처로 흉곽을 엽니다. 흉곽이 열리면 집게를 사용하여 부드럽게 잡아당겨 분리하고 후두 아래의 기관을 자릅니다. 이제 기관을 들어 올리고 폐엽과 흉강을 연결하는 인대를 자릅니다.

그런 다음 폐와 기관을 지방 조직과 심장 조직에서 부드럽게 위로 당겨 주사기 포장지 위에 놓습니다. 그런 다음 0.965mm 폴리에틸렌 튜브를 기관에 삽입하고 명주실로 고정합니다. 멀티 로브도 명사로 묶은 다음 폴리에틸렌 튜브에 23 게이지 바늘을 삽입합니다.

그런 다음 기관지 폐포 세척을 수집하려면 1 밀리리터 주사기를 사용하여 멸균 PBS라는 250 마이크로 리터의 얼음을 단일 엽에 천천히 주입하고 폐를 조심스럽게 두드리고 작업대 표면에 대고 200 마이크로 리터의 신선한 PBS로 절차를 반복 한 후 천천히 액체를 주사기로 다시 끌어 당겨 튜브에 수집합니다. 나중에 분석할 수 있도록 기관지폐포 세척을 얼음 위에 놓습니다. 조직학적 분석을 위해 폐 조직을 고정하려면 다엽을 제거하고 스냅합니다. 드라이 아이스에 얼립니다.

로브는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 조직학적 분석을 위해 조직을 고정하려면 플런저가 없는 60ml 주사기를 금속 지지대에 장착하고 단일 엽에 포르말린을 5분 동안 주입합니다. 그런 다음 바늘을 분리하고 명주실을 당겨 기관에서 폴리에틸렌 튜브와 함께 제거합니다.

동시에 기관을 닫고 폐의 압력을 유지합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 24시간 동안 포르민에 엽을 담급니다. 다음날, 70% 에탄올로 매번 최소 20분 동안 고정 조직을 세 번 씻습니다.

탈수된 조직을 파라 필름에 삽입한 후 엽을 4-5미크론 절편으로 자르고 조직학적 평가를 위해 헤마틴과 어인으로 절편을 염색합니다. 차량에서만 생성된 에어로졸에 노출된 마우스의 기관지폐포 세척액에 있는 총 세포 수는 일반적으로 약 200,000개 이하입니다. 세포는 95-100%의 단핵 세포로 구성되어 있으며 림프구는 몇 개뿐이고 호중구는 없습니다.

생쥐는 에어로졸 1 밀리리터 당 1 밀리그램에 도전했습니다. LPS입니다. 그러나, 기관지폐포 세척액에서 총 세포 수가 증가하며, 일반적으로 6시간 후 500,000개 이상의 세포가 나타나며, 24시간 후에도 세포 침투율이 높게 유지되고, 세포 프로필이 호중구가 우세한 쪽으로 이동했습니다. 유사한 염증성 세포 프로필과 폐 호중구증가증이 밀리리터 LPS당 5mg의 분무에서도 관찰됩니다.

호중구는 상피하 점막과 전도기도 및 혈관을 둘러싼 공간에서 LPS 챌린지 6시간 및 24시간 후에 관찰되었지만 통제되지 않았습니다. 식염수를 처리한 쥐. LPS 챌린지 마우스의 기관지폐포 세척액의 총 단백질 함량은 식염수에 노출된 마우스에 비해 증가하며, 호중구 화학 유인제 케모카인 C, XCL 1 및 C XCL 2의 발현도 LPS 챌린지 마우스에서 증가합니다.

이 방법은 LP가 유발하는 폐 염증에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 에어로졸화된 증기가 다양한 문제를 제공하도록 조정될 수 있기 때문에 박테리아 또는 바이러스 감염과 같은 다른 질병 모델에도 적용할 수 있습니다.