Name: 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 에어로졸 LPS를 이용한 폐 호중구 염증 유도 방법을. 마우스 노출 실험과 기관지폐포 세척을 통해 염증 반응을 평가하고 면역조직화학 분석으로 세포 침윤을 확인하는 기술입니다.

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우리는 숙련 된 지원 커스틴 Thim (아스트라 제네카, 룬드, 스웨덴), 베니 타 달 버그 박사 앤더스 에크 룬드 (카롤린스카 연구소, 스톡홀름, 스웨덴)뿐만 아니라 닥터 마틴 Stampfli (맥 매스터 대학, 해밀턴, ON, 캐나다)에 감사드립니다 및 전문가의 조언.

동물 연구는 북부 스톡홀름 동물 복지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 실험 절차는 스웨덴어 법을 준수 하였다. 1. LPS 에어로졸을 생성 <ol><li> P. 정제 0.5 g을 녹여 부드러운 교반과 함께 50 ml의 멸균 식염수에 aeruginosa의 LPS 및 용해를 확인합니다. 1 mg / ml의 최종 농도로, 9 ml의 멸균 식염수에 용해하여 LPS를 1 mL로 희석. -20 ° C에서 알루미늄 호일과 가게와 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 실온에서 어두운 가용화 LPS를 사용하기 전에 해동하고 즉시 잘 혼합한다. </li><li> 환기 수준 II 생물 학적 후드에서 분무기에 붉은 입구를 삽입하고, 제조업체 (그림 1의 실험 장치를 제시 검토 방식)에 의해 제공되는 튜브를 통해 가압 실내 공기에 분무기를 연결합니다. 주의 : 적절한 개인 보호 장비, 반 얼굴 조각 재사용 respirat 포함또는 미립자 필터, 고글, 장갑, 보호 의복 노광의 과정 동안 사용되어야한다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> 도 1 :. 에어로졸을 생성하기 위해 사용되는 실험 장치의 개략도 표현은 에어로졸 생성기의 입구는 공기 공급 장치에 연결된다. 분무기의 출구는 제 15.9 mm 튜브와 공기 필터 및 공기 공급을 통해 유량계에 연결되어 2 kbar 압력 5.0 L / m으로 조절된다. 출구 이동식 뚜껑과 압력 증가를 방지하기 위해 5mm 구멍에 끼워 플렉시 박스 옆으로 접속된다. <ol start="4"><li> 에어 필터를 통해 질량 유량계에 분무기의 출구를 연결합니다. 전기 공급 장치에 질량 유량계를 연결합니다. </li><li> 1.0 ~ 2.0 바에서 남은 압력, 5 L / min으로 공기 공급을 조정합니다. </li><li> 질량 유량계를 제거하고공기 공급 장치를 분리합니다. </li><li> 150 X 163 X 205mm, 이동식 뚜껑 장착 : 분기합니다 및 치수 두 플렉시 유리 상자에 연결하는 15.9 mm 튜브에 분무기의 출구를 연결합니다. 각 박스에는 압력 증가를 방지하기 위해 입구 대향 측 5mm 구멍을 가져야한다. </li><li> 각 플렉시 유리 상자에 5 마우스까지 올려 놓고 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 분무기를 열고 단독으로 멸균 식염수 또는 차량에 용해 최소 4 ML의 LPS로 삽입을 채우기 (멸균 식염수를, 볼륨 8 ml의를 초과 할 수 없습니다). 공기 공급 장치의 입구를 다시하는 것은 연결합니다. </li><li> 에어로졸은 10 분 동안 폐쇄 플렉시 글라스 상자에 흐르게. 지속적으로 동물을 모니터링합니다. 반드시 공기 공급이 분무기의 입구에 단단히 고정되어있는 상태 확인합니다. </li><li> 공기 공급 장치를 분리합니다. 뚜껑이 닫힌 상​​태에서, 동물이 2 분 동안 플렉시 유리 상자에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 뚜껑을 열고 에어로졸 분산 할 수 있도록하고, T로 동물을 반환그는 케이지. 동물 젖은 나타날 경우 저체온증을 방지하기 위해, 저 발열로 설정 가열 패드에 새장을 배치합니다. </li><li> 처음 30 분 동안 연속적으로 동물을 모니터링하고, 상기 제 6 시간 동안, 그 후 매 2 시간. 동물 중 및 분무 과정을 거친 후 정상적인 호흡 패턴 및 활동을 전시한다. </li></ol> 2. 기관지 폐포 세척 (BAL) <ol><li> 교육 기관의 수의 직원에서 권장하는 실험 종료 시점에서, 깊이 효과에 이소 플루 란과 동물을 마취. 큰 수술을 실시 마취의 충분한 깊이를 보장하기 위해 철수 반사를 확인하기 위해 뒷발을 꼬집어. 70 % 에탄올과 동물의 모피를 스프레이. </li><li> 가위를 사용하여 복부를 열고 동물에게서 피를 뽑다하는 대동맥을 절단. 혈액을 흡수하기 위해 복부를 통해 조직의 조각을 놓습니다. </li><li> 안락사를 follwing을하기에 가위 하나의 전후방 컷을 사용가슴 노출. 흉골의 앞쪽 끝으로 흉곽을 들어 올려 모든 폐 엽으로 절단하지 않고, 대부분의 복부 지점에서 다이아 프램에 구멍에 가위를 사용합니다. 전후방 방향으로 두 컷 (턱 아래 회의)하여 흉곽을 엽니 다. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 흉곽 떨어져 당겨, 그리고 후두 아래의 기관을 잘라. </li><li> 집게로기도를 들어 올려 흉강에 로브를 연결하는 인대를 절단하고 부드럽게 지방과 심장 조직에 의해 당겨 폐를 제거합니다. </li><li> 폴리에틸렌 관 (: 0.58 mm, 외경, 내경 0.965 mm)를 넣 기관에 및 실크 스레드의 문자열로 튜브를 고정합니다. </li><li> 실크 스레드와 multilobe (우측 폐의 네 로브)를 묶어. </li><li> 폴리에틸렌 튜브에 23 게이지 바늘을 삽입하고 천천히 1 ML의 주사기와 단일 로브에 얼음처럼 차가운 멸균 PBS의 250 μl를 주입. </li><li> 조심스럽게 폐를 누릅니다30 시간과 주사기를 통해 액체를 수집합니다. 200 μL PBS와 절차를 반복합니다 (약 300 μl의 PBS 450 μL의 총 주입 볼륨에서 하나의 로브에서 복구해야합니다). </li><li> 얼음에 기관지 세척액 (BALF)을 유지, 또는 즉시 BAL 세포를 열거합니다. 전지 (11)를 염색 터크 용액을 사용하여 세포 heamocytometer 카운트. 염색 액의 희석 배수와 heamocytometer의 카운트 필드 내의 부피 세포 수를 곱하여 총 세포 수를 계산한다. </li><li> 다른 11 설명 된대로 cytocentrifuged 세포에서 차동 세포 수를 준비합니다. </li></ol> 조직 학적 평가를위한 폐 조직의 3 포르말린 고정 <ol><li> multilobe를 제거하고 스냅인 동결을 드라이 아이스에. -80 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 금속 지지대에 제거 플런저와 60 ML의 주사기를 탑재합니다. 10 % 포르말린에와 주사기를 채우일정한 압력의 20cm를 나타내는 실험실 벤치 위에 20cm의 높이. </li><li> 포르말린의 흐름을 제어하는​​ 밸브가 플라스틱 튜브를 통해 60 ml의 시린지에 고정 기관지 23 게이지 바늘을 연결한다. </li><li> 5 분 동안 포르말린 폐 엽 Insufflate. 바늘을 분리하고 실크 스레드에서 당기는 기관을 닫고 폐의 압력을 유지하면서 기관에서 폴리에틸렌 튜브를 함께 제거합니다. </li><li> 포르말린 폐 엽 잠수함 4 ° C에서 24 시간 동안 수정. </li><li> 70 % 에탄올로 적어도 20 분 동안 고정 된 조직을 세 번 씻은 다음, 다음 처방 (1 시간마다)를 통해 탈수 크실렌 : <ul><li> 3X 70 % 에탄올 </li><li> 3X 95 % 에탄올 </li><li> 3X 100 % 에탄올 </li><li> 3 배 크실렌 </li><li> 1 배 (액체) 파라핀 </li></ul></li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신에 포함 탈수 4-5 μm의 섹션으로 잘라 파라핀 조직, 얼룩은 조직 학적 평가를 허용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

아브라함 로스는 베링거 인 겔 하임, 아스트라 제네카 R &amp; D와 아스트라 제네카 R &amp; D에서 연구 보조금에서 여행 보조금에서 강사 수수료를 받고있다. 매그너스 노르 아스트라 제네카 R &amp; D의 풀 타임 직원과 아스트라 제네카 R &amp; D에서 연구 보조금을 받았다. 요한 Grunewald는과 토베 버그는 아스트라 제네카 R &amp; D 자금 지원 관련없는 연구 프로젝트에 공동 연구자이다.

에어로졸은 LPS 상피 점막하 호중구 특징으로기도의 염증 반응을 발생시키고, 전도성기도뿐만 아니라 폐포를 둘러싼 공간. 이것은 함께 혈장 누출, 급성 폐 손상의 병리 대표 나타내는 BALF에서 증가 된 총 단백질 함량으로한다. LPS는 무균 염증을 유도 같이, 반응은 적응성 면역 반응에 독립적이며, 세균 감염에 대한 관련성에 한계가있다. 기술은 그러나 적응 면역 반응을 제외하여 염증 기전을 해부하기 위해 사용될 수있다. 방법은 간단하고 쉽게 다른 과학적인 질문에 대답하기에 적합하지만, 분무기 및 튜브의 선택은 매우 중요하다. LPS 및 결과 호중구의 증착은 여기에 설명 된 것보다 다른 입구, 분무기 및 튜브 유효성을 확인해야합니다. 또한, 덜 일반적인 마우스 성LPS에 다른 응답을 표시 할 수 있습니다 비가, LPS의 최적 용량은 각 변형에 대한 결정되어야한다. 등 (12, 13)에 의해 관측 더욱이, 에어로졸 생성 LPS 염증은 호중구, LPS의 비내 전...

리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 그람 음성 세균 (1)의 세포벽 성분이다. LPS에 도전 급성 폐 손상, 급성 염증 세포의 침윤 염증과 부종이 특징으로하는 증후군의 잘 문서화 된 모델입니다. 또한, 폐 호중구 또한 COPD 악화 4를 모델링하는데 사용되어 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 3, 및 인간에서 LPS 챌린지의 특징이다. 따라서, LPS 노출의 실험 모델은 임상 적으로 인간의 병리를 이해하기 위해 적절하고 가치있는 도구입니다. 여기에 설명 된 에어로졸 LPS의 폐 전달의 목적은 전신 개입 없이도 도통 및 호흡기도에 호중구 염증 반응을 생성하는 것이다. LPS 도전의 여러 기술 이전에 기술되었다. LPS의 정맥 내 주입 투여 가장 일반적으로 사용되는 경로이다. 이 기술에 쉽게 접근 할 수 있지만, t그는 차 손상은 폐에 호중구 마이그레이션 다음 폐 상피 세포의 보조 파괴, 내피이다. 인트라 정맥 투여는 동물 모델에서 임상 사진을 복잡하게 할 수 있습니다 전신 염증이를 유도한다. 전신 염증은 내 기관 관리와 관찰되지 대조적이다. 이 기술은, 그러나, 노동 집약적이며, 마취제뿐만 아니라 상당한 훈련 5, 6을 필요로한다. 또한, 행정이 경로를 통한 폐 침착은 호흡 7에 따라 달라집니다. 따라서, 폐 침착은기도에 내 기관 관리 및 변수 침착이 관찰 될 수 있습니다에 필요한 마취의 깊이에 의해 영향을 받는다. 대조적으로, 에어로졸 화 된 LPS와 폐 전달은 최소한의 훈련을 필요로하며, 쉽게 작은 가진 동물의 다수 또는 개인 5, 8 사이에 편차가없이 달성 될 수있다.최근의 연구는 에어로졸 배달 증착에 관한 내부 기관 노선 우수하다는 및 LPS의 관련성 용량이 모델 8 호중구 염증을 유도 확인합니다. 에어로졸 Psuedomonas aeruginosa의 LPS가 폐포 (9), (10)를 포함하여기도 루멘과 폐 실질, 눈에 띄게 염증 반응을 생성에 이전의 연구는 그 도전을 증명하고있다. 염증은 호중구 폐부종의 존재를 특징으로 우세, 따라서 급성 폐 손상의 기전을 해결하고 질병 병리에 기여하는 메커니즘을 더 지식을 얻기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>정제된 &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>유해함. 정제된 제품 권장. 다른 박테리아에서 정제된 LPS를 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>Pari LC sprint star nebulizer</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>TSI mass flowmeter 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>공급업체의 대체 제품을 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>Saint-Gobain 15.9 mm Tygon tube</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>권장 브랜드.</td></tr><tr><td>탈착식 덮개가 있는 Plexiglas 상자</td><td>Custom built</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm (측면에 2 mm 구멍).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3M Half Facepiece Reusable Respirator</td><td>3M</td><td>7503</td><td>권장 브랜드.</td></tr><tr><td>3M Advanced Particulate Filters (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>권장 브랜드.</td></tr><tr><td>가위</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>선호하는 가위를 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>포셉</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>선호하는 포셉을 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>Intramedic PE50 polyethylene tube</td><td>BD</td><td>427411</td><td>권장 브랜드.</td></tr><tr><td>Ethicon 2-0 Perma-hand silk tread</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>권장 브랜드.</td></tr><tr><td>26 &amp;frac12; 게이지 바늘</td><td></td><td></td><td>대체 공급업체가 있음.</td></tr><tr><td>1 ml BD slip-tip syringe, 비멸균</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>대체 공급업체가 있음.</td></tr><tr><td>60 ml BD Luer-Lok syringe, 비멸균, 폴리프로필렌</td><td>BD</td><td>301035</td><td>대체 공급업체가 있음.</td></tr><tr><td>Fluka Hematoxylin-Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>대체 공급업체가 있음.</td></tr><tr><td>T&amp;uuml;rk's solution</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td></td><td></td><td>대체 제조사가 있음.</td></tr><tr><td>Cytospin 4 cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>대체 원심분리기를 사용할 수 있음.</td></tr><tr><td>HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>대체 염색 키트가 있음.</td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>대체 공급업체가 있음.</td></tr></tbody></table>

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

급성 폐 손상 (ALI)는 제한된 치료 옵션과 높은 사망률과 폐포 호중구을 특징으로하는 심각한 질병이다. ALI의 실험 모델은 질병의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 향상의 열쇠입니다. 그람 양성 세균에서 파생 된 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)는 호중구기도의 염증과 쥐의 폐 실질을 유도한다. 이러한 LPS와 같은 화합물의 효율적인 폐 전달하지만, 달성하기가 어렵다. 여기에 설명 된 방법에서, 마우스의 폐 전달이 에어로졸 녹농균 LPS 챌린지에 의해 달성된다. 용존 LPS는 압축 공기에 연결되어 에어로졸 분무기로 하였다. 생쥐는 에어로졸이 중단 된 후 2 분 컨디셔닝 한 후, 10 분간 플렉시 유리 상자에 LPS 에어로졸의 연속 흐름 노출시켰다. 포르말린 관류 다음에 기관 삽관 이후 기관지 세척은, 다음 멸균 페이지의 특성을 허용하는 수행 하였다ulmonary 염증. 에어로졸 LPS는 기관지 폐포와 조직 학적 평가에 의해 검출 된 폐포 호중구을 특징으로하는 폐 염증을 생성합니다. 이 기술은 몇 가지 제품으로 작은 비용으로 설정하고, 최소한의 교육과 전문 지식을 필요로 할 수 있습니다. 노광 시스템은 따라서 통상적 폐 병변에 대한 이해를 향상시키기 위해 잠재적으로, 임의의 실험실에서 수행 될 수있다.

에어로졸 P.에 도전 aeruginosa의 LPS는 보통 초기와 후기 시점에서 모두 우위 호중구 특징으로기도 내강 및 치조 공간에서 표시된 염증 반응을 산출한다. 에어로졸 LPS는 폐 호중구을 유도 C57BL / 6by 및 BALB / C 마우스에게 에어로졸 화 된 P. 노출시켰다 aeruginosa의 LPS 또는 단독으로 차량과 호중구가 폐포 세척액에 열거 하였다. C57BL 차량 생성 에어로졸에 노출 / 6by 마우스의 BALF의 총 세포 수는 단지 일반적으로 약 20 만 세포 이하와 셀은 몇 림프구 (0.5-5 %)과, 95-100% 단핵 세포로 구성하고, 폐포 세척액에는 호중구 없다 (그림 2A-C). 마우스는 6 시간 후, 에어로졸 LPS 전시와 함께 일반적으로&gt; 50 세포를 폐포 세척액에서 증가 된 총 세포 수에 도전했다...

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 에어로졸화된 LPS 노출을 통해 일관되고 재현 가능한 기도 호중구 증다증을 유도하는 것입니다. 이를 위해 먼저 식염수에 현탁된 LPS를 노출 챔버에 연결된 네뷸라이저에 충전합니다. 그다음 마우스를 에어로졸화된 LPS에 노출시키고, 기관지폐포 세척액을 수집하여 세척액 내의 염증 세포 수를 측정합니다.마지막으로, 폐 조직을 고정액에 넣어 고정한 후, 임베딩, 절편 제작 및 면역조직화학 분석을 위해 포르말린 처리를 합니다. 최종적으로, 기관지폐포 세척액의 총 세포 수 및 감별 세포 수를 통해 폐로의 호중구 모집 정도를 평가할 수 있습니다. 기관 내 LPS 투여와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 에어로졸화된 LPS가 폐 전체에 균등하게 분포된다는 점, 수행이 간편하다는 점, 그리고 성공적인 적용을 위해 필요한 교육이 최소한이라는 점입니다. 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 환기 시설이 갖춰진 생물안전 2등급(BSL-2) 후드 내에서 LPS 에어로졸을 생성하려면, 먼저 네뷸라이저에 빨간색 입구를 삽입한 다음 제조사에서 제공한 튜브를 사용하여 네뷸라이저를 가압실내공기와 연결하십시오.다음으로, 에어 필터를 사용하여 네뷸라이저의 배출구를 질량 유량계에 연결한 후, 질량 유량계를 전원에 연결합니다. 압력을 1~2 bar로 유지하면서 공기 유량을 분당 5 L로 조절한 다음, 질량 유량계를 제거하고 공기 흐름을 차단합니다. 이어서, 네뷸라이저의 배출구를 탈착식 뚜껑이 장착된 2개의 150 x 163 x 205 mm 플렉시글라스 박스에 연결된 15.9 mm 분기 튜브에 연결합니다.압력 상승을 방지하기 위해 각 상자의 입구 반대편 측면에 5mm 구멍을 하나씩 뚫어야 합니다. 이제 각 상자에 생쥐를 최대 5마리까지 넣고 뚜껑을 닫으십시오. 그런 다음 네뷸라이저를 가동하십시오.인서트에 식염수에 용해된 4~8 mL의 LPS 또는 식염수 vehicle만을 채우고, 공기 공급 장치와 유입구를 다시 연결합니다. 에어로졸이 밀폐된 플렉시글라스 상자로 흐르게 하며, 에어로졸 발생 동안 동물을 지속적으로 모니터링하고 공기 공급 장치가 네뷸라이저의 유입구에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 10분 후, 공기 공급 장치를 분리하고 동물을 플렉시글라스 상자 안에 2분 더 둡니다.그 다음 뚜껑을 엽니다. 에어로졸이 분산되도록 한 뒤 실험 종료 시점에 마우스들을 케이지로 돌려보냅니다. 각 동물에 대해 순서대로, 먼저 가위를 사용하여 흉부를 노출시키기 위해 전후 방향으로 한 번 절개합니다. 다음으로 흉골의 앞쪽 끝부분을 잡아 흉곽을 들어 올리고, 폐 조직이 손상되지 않도록 주의하며 가장 배측 지점에서 횡격막을 천공합니다.그런 다음 앞뒤 방향으로 턱 아래에서 만나는 두 번의 절개를 통해 흉곽을 엽니다. 흉곽을 연 후, 포셉을 사용하여 조심스럽게 벌리고 후두 아래의 기관을 절단합니다. 이제 기관을 들어 올리고 폐엽을 흉강에 연결하는 인대들을 절단합니다.그 다음 폐와 기관을 지방 및 심장 조직으로부터 조심스럽게 들어 올려 분리한 후, 시린지 포장지에 놓습니다. 이어서 0.965 millimeter 폴리에틸렌 튜브를 기관에 삽입하고 실크사로 고정합니다. 다엽(multi lobe) 부위 역시 실크사로 묶은 다음, 폴리에틸렌 튜브에 23 gauge 바늘을 삽입합니다.그 후 기관지폐포 세척액을 수집하기 위해, 1 mL 주사기를 사용하여 250 µL의 얼음처럼 차가운 멸균 PBS를 단일 엽에 천천히 주입하고, 폐를 조심스럽게 두드리거나 작업대 표면에 30회 정도 쳐준 뒤 액체를 주사기로 천천히 다시 빨아들여 튜브에 수집합니다. 200 µL의 신선한 PBS로 이 절차를 반복한 후, 이후 분석을 위해 기관지폐포 세척액을 얼음에 보관합니다. 조직학적 분석을 위해 폐 조직을 고정하려면, 다엽을 제거하고 드라이아이스에서 급속 냉동합니다.엽(lobe)을 -80 °C에서 보관하십시오. 조직학적 분석을 위해 조직을 고정하려면, 플런저가 없는 60 mL 시린지를 금속 지지대에 장착하고 단일 엽에 포르말린을 5분 동안 주입하십시오. 그 후 바늘을 분리하고 실을 당겨 폴리에틸렌 튜브와 함께 기관에서 제거하십시오.기관을 동시에 폐쇄하고 폐 내의 압력을 유지합니다. 다음으로, 엽을 4°C의 Formin에 24시간 동안 담급니다. 다음 날, 고정된 조직을 70% ethanol로 최소 20분씩 3회 세척합니다.탈수된 조직을 파라필름으로 포매한 후, 엽을 4~5 µm 두께의 절편으로 자르고 헤마토실린-에오신(hematin and eoin)으로 염색하여 조직학적 평가를 수행합니다. 대조군(vehicle only)으로 생성된 에어로졸에 노출된 마우스의 기관지폐포 세척액 내 총 세포 수는 일반적으로 200,000 cells 내외이거나 그보다 적습니다. 이 세포들은 95~100%의 단핵구로 구성되며, 림프구는 소수만 존재하고 호중구는 관찰되지 않습니다.1 mg/mL의 에어로졸화된 LPS를 투여한 마우스는 기관지 폐포 세척액 내 총 세포 수가 증가하며, 일반적으로 6시간 후 500,000 cells 이상으로 나타나고 24시간 후에도 세포 침윤이 높게 유지되며, 세포 구성이 호중구 우세 방향으로 전환됩니다. 5 mg/mL LPS를 네뷸라이저로 투여했을 때도 이와 유사한 염증성 세포 구성과 폐 호중구 증가증이 관찰됩니다.LPS 자극 후 6시간과 24시간이 지났을 때, 대조군인 식염수 처리 쥐에서는 관찰되지 않았으나 LPS 자극 쥐의 상피 점막하층뿐만 아니라 전도성 기도와 혈관 주변 공간에서 호중구가 관찰되었습니다. LPS 자극 쥐의 기관지폐포 세척액 내 총 단백질 함량은 식염수에 노출된 쥐에 비해 증가했으며, 호중구 화학 유인 케모카인인 CXCL1 및 CXCL2의 발현 또한 LPS 자극 쥐에서 증가했습니다.이 방법은 LP로 유도된 폐 염증에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 에어로졸화된 증기를 통해 다양한 자극 물질을 전달하도록 조정할 수 있으므로 세균 또는 바이러스 감염과 같은 다른 질환 모델에도 적용 가능합니다.

a-method-for-generating-pulmonary-neutrophilia-using-aerosolized

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

이 비디오는 생쥐의 피하 조직에서 공기 주머니를 생성하고 생체 내에서  지질다당류 투여에 대한 반응으로 염증성 삼출물을 수집하는 절차를 설명합니다.이 비디오는 공기 주머니의 호중구 침투 분석도 다룹니다.

Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Exudate Collection을 위한 에어 파우치 마우스 모델

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

본 연구는 폐의 선천성 면역 반응을 촉진하고 마우스의 급성 폐렴구균성 폐렴을 예방하기 위해 설하 면역요법을 사용하는 것의 편리함을 보여줍니다.

대안으로 설하 면역 요법은 급성 호흡기 감염에 대한 보호를 유도하기 위해

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

복 LPS에 드러낸 쥐에는 miRNAs와 함께 패키지 된 Broncho-치경 게 (BAL) 액체에 exosomes 분 비. 공동 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 보여줍니다 발 액체에서 발표 하는 exosomes 기관지 상피 세포에서 꽉 접합 단백질의 표현을 방해 폐 상해를 강조 하는 프로 염증 성 cytokines의 표현을 증가.

Bronchoalveolar 게 Exosomes Lipopolysaccharide 유도 정화 조 폐 상해에

여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

본 연구에서는 기본 후두경을 사용하여 쥐에서 ALI를 발달시키는 비침습적 기기관내 삽입 기법이 입증되어 LPS가 폐에 정밀히 전달되도록 합니다. LPS는 후두경을 이용한 기관내관 을 통해 주입됩니다. 폐 손상의 규모는 여러 시점에서 평가됩니다.

설치류에서 급성 폐 손상을 유도하기 위한 비침습적 기관내 지포폴리당(Lipopolysaccharide) 투여

배우세요 에어로졸 LPS를 이용한 폐 호중구 염증 유도 방법을. 마우스 노출 실험과 기관지폐포 세척을 통해 염증 반응을 평가하고 면역조직화학 분석으로 세포 침윤을 확인하는 기술입니다.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

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